Nghiên cứu phát hiện đột biến gen yếu tố viii gây bệnh hemophilia a và phát hiện người lành mang gen bệnh

ỦY BAN NHÂN DÂN TPHCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU Â MO LÀ LAA À ƯỜ MA Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS Huỳnh Nghĩa PGS.TS.BS.Nguyễn Thị Băng Sương THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 11/2016 MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10 DANH SÁCH BẢNG 11 DANH SÁCH HÌNH 12 PHẦN MỞ ĐẦU 15 CHƯƠNG - TỔNG QUAN 19 1.1.Bệnh Hemophilia A 19 1.2.Lịch sử nghiên cứu bệnh Hemophilia 20 1.3 Đại cương đông máu 21 1.4 Triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh 23 1.4.1 Triệu chứng lâm sàng 23 1.4.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 24 1.5 Điều trị Hemophilia A 26 1.6 Cấu trúc, chức gen FVIII protein FVIII 27 1.7 Bệnh học phân tử Hemophilia A 29 1.7.1 Đột biến gây bệnh Hemophilia A thể nặng 30 1.7.2 Bệnh học phân tử Hemophilia A thể nhẹ trung bình 32 1.8 Mối liên quan kiểu gen kiểu hình 33 1.8.1 Mối liên quan kiểu gen thể bệnh nặng 34 1.8.2 Mối liên quan kiểu gen thể bệnh nhẹ trung bình 35 1.8.3 Đột biến hình thành yếu tố ức chế 37 1.9 Tổng quan tình hình nghiên cứu tính cấp thiết đề tài 38 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.1 Đối tượng nghiên cứu 41 2.1.1 Thiết kế nghiên cứu .40 2.1.2 Chọn mẫu nghiên cứu: 41 2.2 Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1 Sơ đồ bước nghiên cứu: 42 2.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 43 CHƯƠNG – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 47 3.1 Tối ưu hóa quy trình xác định đột biến đảo đoạn intron 22 47 3.1.1 Kiểm tra đoạn mồi 47 3.1.2 Thực phản ứng Inverse- PCR 48 3.1.3 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Inverse- PCR 50 3.2 Tối ưu hóa quy trình chẩn đốn đột biến đảo đoạn intron 51 3.2.1 Kiểm tra đoạn mồi: 52 3.2.2 Thực phản ứng Multiplex-PCR phát đảo đoạn intron 52 3.2.3 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 53 3.3 Hồn thiện quy trình giải trình tự tồn gen FVIII 53 3.3.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen FVIII 53 3.3.2 Giải trình tự gen FVIII 54 3.4 Kiểm chuẩn kỹ thuật phân tích gen FVIII…………………………………………… ….56 3.5 Ứng dụng quy trình tối ưu hóa thực phân tích gen FVIII bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A: 57 3.5.1 Tách chiết DNA 57 3.5.2 Đối với bệnh nhân thể nặng: trình tự kỹ thuật áp dụng sau: 57 3.5.3 Đối với bệnh nhân thể nhẹ trung bình: 58 CHƯƠNG – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu…………………………………….…… 58 4.1.1 Đặc điểm tuổi………………………………………………………………… ….58 4.1.2 Tỷ lệ bệnh nhân chia theo thể bệnh………………………………………………… 59 4.2 Kết tối ưu hóa quy trình xác định đột biến đảo đoạn intron 22……………………….59 4.2.1 Kết kiểm tra đoạn mồi 60 4.2.2 Kết ly trích DNA 61 4.2.3 Kết thực phản ứng Inverse- PCR 62 4.2.4 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật Inverse- PCR 63 4.3 Kết tối ưu hóa quy trình chẩn đốn đột biến đảo đoạn intron 63 4.3.1 Kiểm tra đoạn mồi: 63 4.3.2 Thực phản ứng Multiplex-PCR phát đảo đoạn intron 65 4.3.3 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 65 4.4 Hoàn thiện quy trình giải trình tự tồn gen FVIII 66 4.4.1 Kết tối ưu phản ứng PCR khuếch đại gen FVIII 66 4.4.2 Kết kiểm chuẩn kỹ thuật phân tích đột biến gen FVIII 67 4.5 Ứng dụng quy trình tối ưu hóa thực phân tích gen FVIII bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A: 67 4.5.1 Kết phân tích đột biến gen FVIII bệnh nhân Hemophilia A thể nặng 68 4.5.2 Kết phân tích đột biến gen FVIII bệnh nhân thể trung bình 74 4.5.3 Kết phân tích đột biến gen FVIII bệnh nhân thể nhẹ…………… …………73 4.5.3 Kết phân tích đột biến gen FVIII bệnh nhân thể nhẹ ……………………….73 4.5.4 Dự đoán ảnh hưởng đột biến gen FVIII chưa công bố phần mềm insilicon…… 748 4.6 Liên quan kiểu gen kiểu hình bệnh nhân Hemophilia A nghiên cứu 80 4.6.1 Đột biến bệnh nhân hemophilia A thể nặng .79 4.6.2 Đột biến bệnh nhân hemophilia A thể trung bình 82 4.6.3 Đột biến bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ .83 4.6.4 Các dạng đột biến bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A Việt Nam 83 4.6.5 Kết thống kê SNP gen FVIII 86 4.7 Kết phân tích đột biến gen FVIII cho thành viên gia đình bệnh nhân Hemophilia A 87 4.7.1 Phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 thành viên nữ………………………… 87 4.7.2 Phân tích đột biến điểm thành viên nữ………………………………………….88 CHƯƠNG - KẾT LUẬN 94 KIẾN NGHỊ…………………………………………………………………………………….94 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………… 95 PHỤ LỤC 103 Phụ lục 1: Quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ bạch cầu máu ngoại vi 103 Phụ lục : Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR giải trình tự gen FVIII 106 Phụ lục 3: Tổng kết chương trình ngoại kiểm cho bệnh rối loạn đông cầm máu di truyền số 26 –UK NEQAS 107 Phụ lục 4: Kết tham gia chương trình ngoại kiểm bệnh máu khó đơng di truyền số 26 110 Phụ lục 5: Kết giải trình tự bệnh nhân hemophilia A 111 Phụ lục 6: Phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu 120 Chấp thuận (cho phép) hội đồng Đạo đức DANH SÁCH BỆNH NHÂN TÓM TẮT NGHIÊN CỨU Hemophilia A rối loạn đông máu di truyền thiếu hụt hay bất thường chức yếu tố đông máu VIII Đây bệnh di truyền lặn liên quan giới tính Gen mã hóa yếu tố VIII (FVIII) nằm nhiễm sắc thể X Hiện nhiều dạng đột biến gen FVIII công bố Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác gây kiểu hình đặc trưng khác Ở bệnh nhân Hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-50%), đột biến đảo đoạn intron chiếm khoảng 5% phần lại đột biến điểm (45- 50%) Trong đột biến điểm chiếm đa số bệnh nhân Hemophilia A thể bệnh vừa nhẹ (90-95%) Nghiên cứu hồn thiện quy trình chẩn đoán dạng đột biến thường gặp gen FVIII đảo đoạn intron 22, đột biến đảo đoạn intron đột biến điểm Với quy trình này, nghiên cứu tiến hành phân tích gen 71 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia A phát 60 bệnh nhân bị đột biến gen FVIII, chiếm tỷ lệ 84,5% Trong số 50 bệnh nhân thể nặng, phân tích gen phát 22 bệnh nhân đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 44%) 22 bệnh nhân đột biến điểm (chiếm 44%) Khi phân tích đột biến điểm 15 bệnh nhân thể trung bình, chúng tơi xác định 12 bệnh nhân (chiếm 80%) mang gen đột biến Nghiên cứu phát 4/6 (chiếm 66,7%) bệnh nhân thể nhẹ có đột biến điểm gen FVIII Nghiên cứu chưa ghi nhận đột biến đảo đoạn intron Nghiên cứu tiến hành phân tích kiểu gen thành viên nữ gia đình bệnh nhân Khi phân tích 152 người nữ 60 gia đình bệnh nhân, chúng tơi phát có 119 người có mang gen FVIII đột biến, chiếm 78,3% có 33 người không mang gen FVIII đột biến, chiếm 21,7% Trong số 60 gia đình bệnh nhân phân tích gen, có 56 người mẹ (chiếm 93,3%) mang gen đột biến người mẹ (chiếm 6,7%) khơng có đột biến gen FVIII Như bốn bệnh nhân có đột biến de novo Tóm lại, nghiên cứu chúng tơi ứng dụng thành cơng ba quy trình đẻ xác định đột biến thường gặp gen FVIII bệnh nhân Việt Nam Với phương pháp này, nghiên cứu xác định diện tỉ lệ đột biến đặc hiệu nhóm bệnh nhân Hemophilia A có mức độ nặng khác Ngồi ra, cơng trình tiến hành phân tích gen cho thành viên nữ gia đình bệnh nhân có đột biến phát tỉ lệ người lành mang gen bệnh cao SUMMARY Hemophilia A is a hereditary coagulation disorder caused by deficiency malfunction of coagulation factor VIII This is an X-linked recessive genetic disease The gene encoding coagulation factor VIII (FVIII) is located on chromosome X Currently, many FVIII gene mutations have been identified Genetic studies have confirmed the fact that different mutations are responsible for the different phenotypes In patients with severe Hemophilia A, the common causative mutation is intron 22 inversion (accounting for 45-50%) whereas intron inversion mutation is responsible for only about 5% of cases and the rest (45-50%) are point mutations On the other hand, point mutations are dominantly found (90-95%) in patients with mild and moderate Hemophilia A The present study has successfully applied different methods to determine common mutations in the FVIII gene namely intron 22 inversion, intron inversion and point mutations Using these methods, we conducted genetic analysis in 70 patients clinically diagnosed of Hemophilia A from whom 60 (84.5%) were confirmed to have FVIII gene mutations causing Hemophilia A In 50 patients with severe Hemophilia A, 22 patients (44%) had intron 22 inversions and 22 patients (44%) had point mutations In 15 patients with moderate Hemophilia A, point mutations were found in 12 patients (80%) In this study, we identified out of patients with mild Hemophilia A (66.7%) bearing point mutations No intron inversion was seen in this investigation In our study, we conducted carrier testing for females in 60 families from which patients were identified to have mutations on FVII gene In total, genetic analysis was performed in 152 female members of 60 patients’ families with FVII gene mutations found in 119 individuals (78.3%) Among 152 females tested, no mutation in FVIII gene was detected in 33 ladies (21.7%) We found 56 mothers (93.3%) carrying FVIII mutations and the rest mothers (6.7%) showed no mutation responsible for Hemophilia A Thus in the latter group of families, patients had de novo mutations In conclusion, we have successfully applied different methods to determine common mutations in the FVIII gene in Vietnamese patients With these methods, this study determined the presence and rate of specific causative mutants in patients with different severity of Hemophilia A In addition, female members from patients’ families were also checked for possible mutations in FVIII gene showing high rate of carrier status DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ bp : Base pair CLSI : Clinical & Laboratory Standards Institute Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Phịng Thí nghiệm DNA : Deoxyribonucleic acid FVIII : Protein yếu tố FVIII FVIII : Gen FVIII mã hóa cho protein yếu tố FVIII I-PCR : Inverse-PCR kD : Kilo dalton mRNA : Messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information NST : Nhiễm sắc thể nt : nucleotide PCR : Polymerase Chain Reaction SNP : single-nucleotide polymorphism UK-NEQAS : United Kingdom National External Quality Assessment Service Dịch vụ Ngoại kiểm Quốc gia – Vương quốc Anh 10 PHỤ LỤC Tổng kết chương trình ngoại kiểm cho bệnh rối loạn đông cầm máu di truyền số 26 –UK NEQAS 107 108 109 PHỤ LỤC Kết tham gia chương trình ngoại kiểm bệnh máu khó đơng di truyền số 26 110 111 PHỤ LỤC Kết giải trình tự bệnh nhân hemophilia A Hình ảnh đột biến điểm bệnh nhân hemophilia A thể nặng B H Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem16 Nhận xét: Bệnh nhân bị đột biến thêm nucleotide A vào vị trí c.4825dupA exon 14 Đột biến gây biến đổi p.Thr1609Asn*fs cuỗi B phân tử protein FVIII Đột biến tìm thấy nhiều bệnh nhân Hemophilia A thể nặng Đột biến công bố lần đầu tác giả Lin (1993) [47] B H Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem21 112 Nhận xét: Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân Hem21 mang đột biến thêm nucleotide c.4379dupA exon 14 gây biến đổi p.Asn1460Lys*fs vùng B Đột biến công bố lần đầu tác giả Higuchi cộng (1991) [32] B H Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem23 Nhận xét: Bệnh nhân 23 mang đột biến that nucleotide T thành A vị trí c.2025 thay đổi ba TAT mã hóa cho Tyrosine thành ba kết thúc TAA Sự xuất ba kết thúc vị trí làm trình phiên mã dừng exon 13 mã hóa cho vùng A2 làm cho protein FVIII bị cắt cụt Đột biến đột biến mới, chưa công bố sở liệu bệnh Hemophilia A B H Hình Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem25 113 Nhận xét: Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân Hem25 mang đột biến c.3870dupA làm biến đổi p.Gly1291Argfs*29 trình tự acid amin mã vùng B Đột biến không làm thay đổi acid amin mà làm lệch khung dịch mã từ vị trí chèn nucleotide A trở Đột biến công bố lần đầu tác giả Frusconi năm 2002 tìm thấy nhiều bệnh nhân Hemophilia A thể nặng Anh, Ý, New Zealand, Tây Ban Nha [27] B H Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem27 Nhận xét: Bệnh nhân Hem27 mang đột biến nucleotide G vị trí c.1141 exon làm thay đổi acid amin codon 381 vùng a1 từ axit aspartic thành methionine, đồng thời làm lệch khung dịch mã Đột biến phân tích nguy phần mêm Polyphene-2 cho số điểm nguy 0.98, số điểm gần 1,0 chứng tỏ đột biến có khả gây bệnh cao 114 B H 30: Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem30 Nhận xét: Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem30 cho thấy vị trí c.1096 exon có chèn nucleotide G khiến cho acid amin Aspatic axit codon 366 bị thay đổi thành Glycine, đồng thời khung dịch mã bị thay đổi từ vị trí chèn B H 34 Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem34 115 Nhận xét: Bệnh nhân Hem34 mang đột biến c.4512delG exon 14 công bố tác giả Repesse năm 2007 phát bệnh nhân thể nặng Pháp [70] Đột biến làm thay đổi acid amin codon 1504 từ Leucine thành Phenylalanine (p.Leu1504Phefs*62) làm lệch khung dịch mã từ vị trí đột biến trở Đột biến phân tích phần mềm Polyphene-2 cho thấy khả gây bệnh cao với số điểm nguy 0.999 B H Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem35 Nhận xét: Tại vị trí c.266 exon mã hóa cho vùng A1 gen FVIII, nucleotide G bị thay A làm thay đổi ba GGT mã hóa cho acid amin kích thước nhỏ, kỵ nước, khơng tích điện Glycine codon 89 thành GAT mã hóa cho acid amin kích thước trung bình, ưa nước, tích điện âm Aspartic Sự thay đổi làm thay đổi tính chất liên kết hình thành acid amin cấu trúc FVIII, gây bệnh thể nặng Đột biến cho số điểm nguy 1.00 phân tích phần mềm Polyphene-2 Đột biến công bố lần đầu tác giả Becker năm 1996 nghiên cứu đột biến gây bệnh bệnh nhân Hemophilia A thể nặng Đức [6] 116 B H 40 Hình Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem40 Nhận xét: Kết giải trình tư gen FVIII bệnh nhân Hem40 cho thấy bệnh nhân mang đột biến c.3637dupA exon 14 mã hóa cho vùng B, làm lệch khung dịch mã làm cho protein thay đổi p.Ile1213Asnfs*28 Đột biến tìm thấy nhiều bệnh nhân thể nặng công bố năm 1995 nghiên cứu đột biến gây bệnh Hemophilia A tác giả Pieneman Hà Lan [64] B H Hình 10 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem46 Nhận xét: Bệnh nhân Hem46 mang đột biến thay A G vị trí c.1891 exon 12 mã hóa cho vùng A2 Đột biến thay làm cho ba mã hóa AAC mã 117 hóa cho acid amin khơng tích điện Asparagine bị thay đổi thành GAC mã hóa cho acid amin Aspartic tích điện âm Đột biến có số điểm nguy 1.00 công bố năm 2009 bệnh nhân thể nặng tác giả Sirocova [80] B H 0: Hình 11 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem50 Nhận xét: Kết giải trình tự exon 14 bệnh nhân Hem50 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay c.4027G>T Đột biến làm ba GAA mã hóa cho acid amin Glutamat bị thay đổi thành ba kết thúc TAA Đột biến vô nghĩa làm protein FVIII bị cắt cụt hoàn toàn chuỗi nhẹ biểu thành kiểu hình Hemophilia A thể nặng B H : Hình 12 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem52 118 Nhận xét: Kết giải trình tự exon 14 bệnh nhân Hem52 cho thấy bệnh nhân mang đột biến nucleotid c.3637delA Đột biến làm lệch khung dịch mã làm cho protein thay đổi p.Ile1213Phe*fs Đột biến tìm thấy bệnh nhân thể nặng công bố năm 1993 tác giả Lin tạp chí Genomics vào năm 1993 [47] B H : Hình 13 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem54 Nhận xét: Bệnh nhân Hem54 mang đột biến thay c.143G>A exon Đột biến làm thay đổi ba AGA thành AAA thay acid amin Arginin codon 48 Lysin Đột biến công bố tác giả Becker năm 1996 tạp chí Am J Hum Genet B H 0: Hình 14 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem60 119 Nhận xét: Kết giải trình tự exon 14 bệnh nhân Hem60 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay c.4156C>T Đột biến làm thay đổi codon 1366 từ CAG mã hóa cho acid amin Glutamin bị thay đổi thành ba kết thúc TGA Đột biến vô nghĩa làm protein FVIII bị cắt cụt biểu thành kiểu hình Hemophilia A thể nặng Đột biến cơng bố Santacrose vào năm 2008 tạp chí J Hum Genet B H 4: Hình 15 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem64 Nhận xét: Kết giải trình tự exon bệnh nhân Hem64 cho thấy bệnh nhân mang đột biến thay c.446C>T Đột biến làm codon 149 từ CCT mã hóa cho acid amin Prolin bị thay đổi thành ba CTT mã hóa cho acid amin Leucin (p.Pro149Leu) Đột biến công bố Santacrose vào năm 2008 tạp chí J Hum Genet 120 PHỤ LỤC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập- Tự do- Hạnh phúc PHIẾU ĐỒNG Ý THAM GIA NGHIÊN CỨU Sau giải thích cặn kẽ đề tài “Nghiên cứu phát đột biến gen gây bệnh Hemophilia chẩn đoán trước sinh cho thai phụ mang kiểu gen dị hợp tử” Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh chủ trì, Tôi tên là: ……………………………………………………………………………… Sinh năm: ……………………………………………………………………………… Địa chỉ: ………………………………………………………………………………… Điện thoại: ……………………………………………………………………………… Đồng ý để (con tôi) tham gia vào nghiên cứu Tôi đồng ý: - Lấy ml máu tĩnh mạch làm xét nghiệm - Cung cấp thông tin theo yêu cầu Tôi đề nghị: - Các thông tin cá nhân kết xét nghiệm phải giữ kín - Thơng báo kết tư vấn cho cần ……, Ngày…… tháng…… năm 20… Ký ghi rõ họ tên 121