Nghiên cứu tạo dòng đột biến ở cây hoa chuông gloxinia speciosa bằng xử lý bức xạ tia gamma nguồn co60

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ CÂY HOA CHUÔNG (Gloxinia speciosa) BẰNG XỬ LÝ BỨC XẠ TIA GAMMA NGUỒN Co60 Mã số: TNCT01/15-17 Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phòng thực nghiệm trồng Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Hoàng Quân Cán thực hiện: TS Hà Thị Loan ThS Phan Diễm Quỳnh CN Trịnh Bá Uy ThS Đỗ Thị Lịch Sa KS Nguyễn Thị Ảnh KS Nguyễn Trường Giang Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC HÌNH TÓM TẮT I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI II.ĐẶT VẤN ĐỀ III TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 Giới thiệu chung hoa Chuông 11 1.1 Sơ lược nguồn gốc phân loại thực vật 11 1.2 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh 12 1.3 Kỹ thuật nhân giống hoa Chuông 12 1.4 Tình hình nghiên cứu hoa Chuông giới 13 1.5 Tình hình nghiên cứu hoa Chuông Việt Nam 13 Phương pháp gây đột biến chiếu xạ chọn tạo giống trồng 15 2.1 Nguồn phóng xạ 15 2.2 Cơ chế tác động ứng dụng đột biến phóng xạ 16 2.3 Đối tượng kỹ thuật chọn tạo giống phương pháp chiếu xạ 19 2.4 Những thành tựu nghiên cứu đột biến phóng xạ 20 2.5 Các nghiên cứu chiếu xạ nước 23 Ứng dụng thị phân tử chọn lọc dòng biến dị 27 IV VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 1.Vật liệu nghiên cứu: 29 Nội dung thực 29 2.1 Nội dung 1: Nhân nhanh giống hoa Chuông điều kiện in vitro Tạo mô sẹo cụm chồi làm nguồn vật liệu cho chiếu xạ 29C:\Users\CHAM\Desktop\bao cao.doc - _Toc505382754 2.2.Nội dung 2: Chiếu xạ phân lập dòng hoa Chuông biến dị điều kiện in vitro 30 2.3 Nội dung 3: Khảo sát khả sinh trưởng, phát triển phân lập dạng biến dị hoa Chuông điều kiện nhà màng 32 2.4 Nội dung 4: Phân tích đa dạng di truyền dịng hoa Chng biến dị kỹ thuật RAPD 33 Phương pháp xử lý số liệu 34 V KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 Nội dung 1: Nhân nhanh giống hoa Chuông điều kiện in vitro Tạo mô sẹo cụm chồi làm nguồn vật liệu cho chiếu xạ 35 a Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng đến vô trùng mẫu 35 b Ảnh hưởng nồng độ NAA lên phát sinh mô sẹo từ cuống 36 c Ảnh hưởng nồng độ BA lên tái tạo chồi từ mô sẹo 36 d Khảo sát khả nhân nhanh hoa chuông hệ thống TIS môi trường thạch 37 e Khảo sát ảnh hưởng tần suất bơm, thời gian ngập chìm lên nhân nhanh hệ thống TIS 38 Nội dung 2: Chiếu xạ phân lập dòng hoa Chuông biến dị điều kiện in vitro 39 2.1 Xác định LD50 hoa Chuông 39 2.2 Phân lập biến dị in vitro 42 2.3 Khảo sát khả sinh trưởng, phát triển phân lập dạng biến dị hoa Chuông điều kiện nhà màng 46 2.4 Phân tích đa dạng di truyền dịng hoa Chng biến dị kỹ thuật RAPD 58 VI.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 a Kết luận: 64 b Đề nghị: 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 65 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 66 TÀI LIỆU TRUY CẬP TỪ INTERNET 68 PHỤ LỤC 69 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Cây hoa chng (Gloxinia speciosa) 11 Hình Tỷ lệ phần trăm tác nhân gây đột biến tạo giống trồng năm 2005 16 Hình Tỷ lệ loại đột biến công bố giới năm 2014 21 Hình Sự phân bố giống đột biến lục địa giới năm 2015 24 Hình Quy trình nhân giống in vitro hoa chuông 30 Hình Quy trình trồng hoa chuông điều kiện nhà màng Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh 33 Hình Sơ đồ gậy tạo biến dị hoa chuông tia gamma nguồn Co60 34 Hình Chồi hoa chng vào mẫu thành công sau tuần 35 Hình Mơ sẹo sau tuần ni cấy 36 Hình 10 Cây hoa chng ni cấy hệ thống TIS 38 Hình 11 Mẫu đĩa petri hoa chng chiếu xạ 39 Hình 12 Đồ thị biểu thị tỷ lệ mẫu sống giống hoa chuông đỏ viền trắng sau chiếu xạ gamma 40 Hình 13 Đồ thị biểu thị tỷ lệ mẫu sống hoa chuông đỏ kép sau chiếu xạ gamma 41 Hình 14 Các mẫu chiếu xạ bị chết sau bị chiếu xạ 42 Hình 15 Các biến dị in vitro đỏ kép 44 Hình 16 Các kiểu hình biến dị in vitro đỏ viền trắng 46 Hình 17 Một số biến dị kiểu hình hoa hoa chng đỏ kép ngồi nhà màng 48 Hình 18 Sơ đồ phân nhóm di truyền dịng biến dị hoa chng đỏ kép theo kiểu hình 50 Hình 19 Đồ thị phân bố 12 dịng biến dị hoa chng đỏ kép theo kiểu hình 52 Hình 20 Biểu đồ khảo sát thị hiếu người tiêu dùng với dòng biến dị giống đỏ cánh kép 53 Hình 21 Một số biến dị kiểu hình đỏ viền trắng trồng ngồi nhà màng 55 Hình 22 Sơ đồ phân nhóm di truyền dịng biến dị hoa chng đỏ viền trắng theo kiểu hình 56 Hình 23 Đồ thị phân nhóm di truyền dịng biến dị hoa chng đỏ viền trắng theo kiểu hình 57 Hình 24 Tỷ lệ phần trăm u thích kiểu hình biến dị hoa chng đỏ viền trắng 58 Hình 25 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số ly trích băng kit 59 Hình 26 Hình điện di 10 dịng hoa chng biến dị với cặp mồi OPG 60 Hình 27 Sơ đồ phân nhóm di truyền dịng biến dị hoa chuông đỏ kép theo kiểu gene 61 Hình 28 Đồ thị phân bố nhóm dịng hoa chng đỏ kép liệu RAPD 62 Hình 29 Sơ đồ phân nhóm di truyền dịng hoa chuông đỏ viền trắng theo kiểu gene 62 Hình 30 Đồ thị phân bố nhóm di truyền dựa liệu RAPD 63 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Một số liều xạ kích thích sinh trưởng phát triển trồng 22 Bảng Các nghiệm thức liều xạ xác định LD50 chồi mô sẹo hoa chuông 31 Bảng Tỷ lệ mẫu chết nhiễm trung bình nghiệm thức 35 Bảng Thí nghiệm tạo sẹo từ hoa chuông sau tuần 36 Bảng Ảnh hưởng BA tái tạo chồi từ mô sẹo giai đoạn invitro 36 Bảng Ảnh hưởng điều kiện môi trường nhân giống hoa chuông in vitro 37 Bảng Khảo sát tần suất bơm hệ thống TIS 38 Bảng Khảo sát thời gian ngập mẫu hệ thống TIS 39 Bảng Các cá thể biến dị giai đoạn in vitro hoa chuông đỏ kép 43 Bảng 10 Các cá thể biến dị giai đoạn in vitro hoa chuông đỏ viền trắng 45 Bảng 11 Đánh giá kiểu hình hoa dịng biến dị ex vitro mẫu hoa chuông đỏ kép 49 Bảng 12 Một số tiêu chí đánh giá hoa chng đỏ kép biến dị 49 Bảng 13 Đánh giá kiểu hình hoa dịng biến dị ex vitro hoa chng đỏ viền trắng 53 Bảng 14 Đánh giá số tiêu chí hoa chuông đỏ viền trắng biến dị 54 Bảng 15 Kết ly trích DNA tổng số 10 mẫu hoa chuông 59 Bảng 16 Sản phẩm khuếch đại primer sử dụng nghiên cứu 10 dịng hoa chng 60 TÓM TẮT Sau 50 năm thành lập, Cơ quan lượng quốc tế (Reza Farzinebrahimi, 2014) tổ chức nông lương giới (FAO) tiến hành nhiều nghiên cứu tác nhân gây đột biến trồng, nhằm tạo giống có tính trạng ưu làm thay đổi kinh tế to lớn với sản phẩm nông nghiệp thực phẩm, phục vụ đời sống người đảm bảo an ninh lương thực đồng thời đáp ứng yêu cu biến đổi khí hậu tồn cầu gây Bên cạnh đó, nhiều nước ứng dụng xạ tác động lên hoa kiểng nhằm tạo đa dạng nguồn gene, màu sắc phong phú, kiểu dáng hoa, đặc tính sinh trưởng phát triển hoa… nhằm phục vụ nhu cầu làm đẹp sống ngày cùa người tồn giới Hoa chng (Gloxinia speciosa) thân thảo, hoa đẹp, trồng làm kiểng, có nguồn gốc Brasil Nhiều giống trồng Việt Nam, đáp ứng nhu cầu trang trí người tiêu dùng đem lại giá trị kinh tế cho người trồng Vì vậy, giống phù hợp với điều kiện trồng thị trường cần phải làm đa dạng nguồn di truyền, tăng phong phú kiểu hoa vật liệu làm lai tạo Hoa Chuông chủ yếu nhân giống in vitro để tạo số lượng lớn con, đồng đều, khỏe mạnh không mang mầm bệnh Vì vậy, nhóm nghiên cứu áp dụng phương pháp nhân giống tạo sẹo làm nguồn vật liệu chiếu xạ tia gamma nguồn Co60 Các mẫu sau bị xạ xác định liều xạ gây chết 50%; giống hoa chuông đỏ kép sau tháng 114 Gy, sau tháng 112 Gy; giống hoa chuông đỏ viền trắng sau tháng 97,2 Gy, sau tháng 85 Gy Các mẫu chồi tái sinh chọn lọc kiểu hình biến dị nhân dịng in vitro: Giống đỏ kép dòng, đỏ viền trắng dòng Các dòng biến dị in vitro chọn lọc mẫu hoa chuông bị chiếu xạ in vitro đưa vườn trồng nhà màng Sau hoa, đề tài chọn lọc đánh giá 12 dịng biến hoa chng đỏ kép 12 dòng biến dị đỏ viền trắng Các dòng biến dị phân tích di truyền kiểu hình, kiểu gen chọn dòng B- đỏ kép, dòng K, L- đỏ viền trắng I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI I.1 Tên đề tài: Nghiên cứu tạo dòng biến dị hoa Chuông (Gloxinia speciosa) xử lý xạ tia gamma nguồn Co60 (Mã số: TNCT01/15-17) I.2 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM Địa chỉ: 2374, QL1A, phường Trung Mỹ Tây, Q12, TP Hồ Chí Minh Điện thoại: 08 38225202 I.3 Đơn vị: Phòng Thực nghiệm trồng Địa chỉ: 2374, QL1A, Phường Trung Mỹ Tây, Q.12, TP.HCM Điện thoại: 08 37155739 I.4 Cơ quan phối hợp chính: I.5 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Hồng Qn Phịng Thực nghiệm Cây trồng - Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP.HCM I.7 Nhóm thực hiện: ThS Hà Thị Loan ThS Phan Diễm Quỳnh ThS Nguyễn Hoàng Quân CN Trịnh Bá Uy ThS Đỗ Thị Lịch Sa KS Nguyễn Thị Ảnh Nguyễn Trường Giang I.8 Thời gian thực hiện: 36 tháng (Từ tháng 01/2015 đến tháng 01/2017 ) 1.9 Kinh phí dự kiến: 390,000,000 VNĐ Năm 120,000,000 vnd Năm 170,000,000 Năm 100,000,000 10 Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký TT Các nội dung công việc chủ yếu cần thực Nội dung 1: Nghiên cứu môi trường tạo chồi sẹo tối ưu, tạo nguồn vật liệu cho công tác chiếu xạ Kết phải đạt Thời gian (bắt đầu, kết thúc) Chọn mơi 01/2015 – trường tạo chồi thích 06/2015 hợp, phục vụ cho việc xử lý đột biến Đánh giá Đạt Xác định liều lượng tia gamma thích hợp để xử lý hoa Chng - Phân lập dịng hoa Chng biến dị điều kiện in vitro Nội dung 3: Khảo sát khả Chọn lọc sinh trưởng, phát triển cá thể mang phân lập dạng đột biến đột biến mong hoa Chuông muốn điều kiện nhà màng 07/2015 – 12/2016 Đạt 01/2017 – 06/2017 Đạt Vẽ di truyền 07/2017 – dòng biến 12/2017 dị chọn lọc lại dòng biến dị có khác biệt dịng biến dị nhân dòng Đạt Nội dung 2: Chiếu xạ phân lập biến dị điều kiện in vitro - Chiếu xạ tạo nguồn biến dị - Chọn lọc tái sinh dịng biến dị Nội dung 4: Phân tích đa dạng di truyền dịng hoa Chng biến dị kỹ thuật RAPD Viết báo cáo nghiệm thu 11 Kết nghiên cứu TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học dự kiến đạt Chọn - dịng hoa - Có khác biệt màu sắc kiểu hình Chng biến dị hoa lá, phù hợp với điều kiện khí hậu TP.HCM thị hiếu người chơi hoa Bài báo khoa học: Đào tạo Đại học: Cử nhân - Đăng Tạp chí chun ngành - Cơng nghệ sinh học Ghi Đạt Đạt II.ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống phát triển, nhu cầu hoa ngày tăng nên ngành sản xuất kinh doanh hoa ngày coi trọng Theo báo cáo năm 2005 FAO, giá trị sản lượng hoa cảnh toàn giới năm 1995 đạt 35 tỷ USD, đến năm 2004 tăng lên 56 tỷ USD (tốc độ tăng bình quân năm 20%); giá trị xuất đạt từ 8,5-10 tỷ USD/năm Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho việc phát triển đa dạng loại hoa Nghề trồng hoa coi ngành kinh tế có giá trị hàng hóa trừ năm 1980, diện tích trồng hoa cảnh nước ta ngày mở rộng Hiện nay, giống hoa thị trường nước ưa chuộng trồng nước ta chủ yếu nhập từ nhiều nước khác như: Hà Lan, Pháp, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan Các giống có ưu điểm: kích thước lớn, màu sắc đẹp, kiểu dáng hấp hẫn so với giống địa phương Tuy nhiên, giống địa cần có q trình thích ứng lâu dài, giống nhập nội biểu số nhược điểm liên quan đến khả thích ứng, chống chịu sâu bệnh, độ bền hoa… Đặc biệt, chi phí cho việc sản xuất giống hoa có nguồn gốc nhập nội trở nên đắt đỏ phải tạo số điều kiện thích ứng định Mục tiêu cần hướng tới công tác chọn tạo giống thị trường chơi hoa tạo tính trạng lạ, hấp dẫn màu sắc, hình dạng, kích thước, hương thơm, độ bền khả chống chịu sâu bệnh, thích ứng tốt với điều kiện thời tiết khí hậu vùng Để đạt mục tiêu này, việc cải tiến, thay đổi mặt di truyền đóng vai trị quan trọng Trong chọn tạo giống trồng việc gây đột biến thực nghiệm để đa dạng hoá di truyền vật liệu khởi đầu coi kỹ thuật có tính ứng dụng cao Hơn nữa, với phát triển công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý đột biến in vitro trở thành công cụ hữu hiệu tạo giống trồng cho phép rút ngắn thời gian giảm bớt chi phí chọn tạo giống trồng Công nghệ xử lý đột biến in vitro đặc biệt hiệu tạo giống hoa Cho đến có 187 giống hoa cúc, 34 giống hoa thược dược, 27 giống hoa hồng, giống hoa phượng tiên, 25 giống hoa thu hải đường, 18 giống hoa cẩm chướng tạo đường đột biến, chủ yếu xử lý in vitro chồi mầm, callus, hạt phấn, bao phấn, phôi soma…(Ahloowalia Maluszynski, 2001) Hiện thị trường Tp Hồ Chí Minh thành phố lớn, nhiều loại hoa xuất bên cạnh lồi hoa truyền thống, số có hoa Chng (Gloxinia speciosa) Lồi hoa có xuất xứ từ châu Phi nhiều người ưa thích Cây trồng chậu, hoa có nhiều màu sắc khác nhau, cánh nhung, viền trắng, phát triển tốt với điều kiện ánh sáng nhẹ nơi thống mát Do đó, hoa Chng thích hợp để trang trí nhà, công ty, khách sạn du lịch để bàn làm việc Để tiến xa công tác giống, cung cấp số lượng lớn giống hoa Chng có màu sắc đặc biệt, lạ cho thị trường hoa Việt Nam nhu cầu sản xuất - xuất loại hoa cách áp dụng tiến khoa học kỹ thuật nuôi cấy mơ tế bào thực vật xạ Chính vậy, nhóm nghiên cứu đề xuất thực đề tài: “Nghiên cứu tạo dịng đột biến hoa Chng (Gloxinia speciosa) xử lý xạ tia gamma nguồn Co60” cần thiết Mục tiêu chung: Nghiên cứu nhằm chọn, tạo dịng hoa Chng làm phong phú thêm nguồn hoa kiểng Tp Hồ Chí Minh, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ hoa kiểng thành phố vùng lân cận Mục tiêu cụ thể: - Hồn thiện quy trình cơng nghệ tạo dịng hoa Chng phương pháp chiếu xạ - Chọn tạo – dịng hoa Chng biến dị có khác biệt kiểu hình hoa, kiểu hình lá, màu sắc hoa lá, đưa vào sản xuất thử nghiệm Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Nội dung thực đề tài Nội dung 1: Nhân nhanh giống hoa Chuông điều kiện in vitro Tạo mô sẹo cụm chồi làm nguồn vật liệu cho chiếu xạ Nội dung 2: Chiếu xạ phân lập dịng hoa Chng biến dị điều kiện in vitro Nội dung 3: Khảo sát khả sinh trưởng, phát triển phân lập dạng biến dị hoa Chuông điều kiện nhà màng Nội dung 4: Phân tích đa dạng di truyền dịng hoa Chng biến dị kỹ thuật RAPD 10 d Tính trạng kiểu hình 12 dịng biến dị hoa chng đỏ viền trắng theo kiêu hình ĐẶC ĐIỂM KIỂU HÌNH TÍNH TRẠNG DỊNG BIẾN DỊ Tiêu chí đánh giá Tính trạng kiểu hình A B C D E F G H I J K A 1 0 1 0 1 Thời gian sinh Ab 0 0 1 0 trưởng B 0 0 0 0 0 Thời gian hoa (ngày) A 1 1 1 1 1 A 0 0 0 0 Độ bền hoa Ab 0 0 1 0 B 0 1 0 1 A 1 0 0 1 1 Ab 0 1 0 0 0 đường kính hoa B 0 0 1 0 0 A 0 0 0 1 1 B 1 1 1 0 0 số nụ hoa C 0 0 0 0 0 Mỏng 1 1 0 1 Độ dày Dày 0 0 1 0 Tỷ lệ viền trằng đỏ giống đối chứng 1 0 0 0 0 Tỷ lệ trắng đỏ: (nghiêng đỏ) 0 1 0 0 Tỷ lệ trắng đỏ: nghiên trắng 0 0 0 1 1 cánh có màu xanh 0 0 1 0 0 Màu sắc cánh hoa Đỏ trắng đan xen 0 0 0 1 0 Bung đối chứng 1 0 0 0 cách hoa đan xen dày đặc 1 1 0 1 1 Cánh hoa dị dạng 0 0 1 Hình dạng cánh hoa Cụp rũ xuống 0 1 1 0 0 71 L 0 1 0 0 0 0 0 1 0 e Hệ số đồng dạng di truyền 12 dòng biến dị hoa chng đỏ viền trắng theo kiểu hình f Hệ số boostrap dịng biến dị hoa chng đỏ viền trắng theo kiểu hinh 72 g Bảng số liệu mã hoa di truyền dòng biến dị hoa chuông Mồi Avt OPE11 OPE17 OPF14 1 OPF16 0 0 OPG12 0 OPG13 1 1 OPI08 OPI10 0 0 ỌP04 0 Adk 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 DÒNG BIẾN DI CỦA 10 DÒNG BIẾN DỊ B XLCXXLPH- K- XPH- CX(dk) dk dk vt vt vt 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 73 Lvt 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 Gdk 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 h Hệ số đồng dạng di truyền dịng biến dị hoa chng đỏ kép khảo sát với mồi RAPD i Hệ số đồng dạng di truyền dịng biến dị hoa chng đỏ viền trắng khảo sát với mồi RAPD 74 j Hệ số boostrap dòng biến dị đỏ kép k Hệ số boostrap dòng biến dị viền trắng 75 k Kết diện di Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPE10 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPE11 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPE17 76 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPF14 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPF16 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPG12 77 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPI08 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPI10 Kết điện di sản phẩm PCR 10 mẫu hoa chuông OPJ04 78 79 80 81 82 83 84 85