Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Ethyl methane sulfonate đến sự hình thành các đột biến ở cây hoa chuông (Sinningia speciose (G. Lodd.) Hiern). Đoạn thân của hoa chuông in vitro được xử lý bằng EMS với 6 nồng độ khác nhau (0%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%) trong 1 giờ và 2 giờ. Kết quả cho thấy nồng độ EMS càng cao, thời gian xử lý mẫu càng dài thì tỷ lệ mẫu sống, phát sinh chồi càng giảm và càng xuất hiện nhiều hình thái khác hơn so với đối chứng.
Chuyén san Khoa hoc Ty nhién KHAO SAT SU ANH HUONG CUA ETHYL METHANE SULFONATE DEN SU PHAT SINH DOT BIEN CAY HOA CHUONG (Sinningia speciosa (G Lodd.) Hiern) Đặng Thị Phương Thảo, Ngơ Minh Trí, Lâm Ngọc Kim Trúc, Trần Thị Mỹ Tiên, Nguyễn Bửu Thuận Nguyễn Thị Pha" Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ “Tac gia lién hé: ntpha@ctu.edu.vn Lich sw bai bao Ngày nhận: 18/11/2021; Ngày nhận chỉnh sửa: 19/01/2022; Duyét đăng: 23/02/2022 Tóm tắt Nghiên cứu (Sinningia speciose độ khác (0%; cao, thời gian xử lý ảnh hưởng Ethyl methane sulfonate đến hình thành đột biến hoa chng (Œ Lodd.) Hiern) Đoạn thân hoa chuông in vitro xử ÏJ EMS với nồng 0,2%; 0,4; 0,6%; 0,82%; 14) Kết cho thấy nông độ EMS mẫu dài tỷ lệ mẫu sống, phat sinh choi giảm xuất nhiều hình thái khác so với đối chứng Trong đó, nơng độ EMS 0,8% thời gian nông độ EMS 0,2% giị cho kiểu hình khác biệt so với đối chứng có khả tái sinh cao Ving ITS cia 02 nghiệm thức đọc trình tự ghi nhan 13 ddu SNPs (Single nucleotide polymorphism) xte ly EMS néng dé 0,8% gid ghi nhdn 12 dau SNPs, 0,2% ghỉ nhận dấu SNP Tir khéa: Cay hoa chuéng (Sinningia speciose (G Lodd.) Hiern), d6t bién, EMS, trinh tr ITS EFFECTS OF ETHYL METHANE SULFONATE ON THE MUTAGENESIS OF GLOXINIA (Sinningia speciose (G Lodd.) Hiern) UNDER IN VITRO CONDITIONS Dang Thi Phuong Thao, Ngo Minh Tri, Lam Ngoc Kim Truc, Tran Thi My Tien, Nguyen Buu Thuan, and Nguyen Thi Pha” Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University “Corresponding author: ntpha@ctu.edu.vn Article history Received: 18/11/2021; Received in revised form: 19/01/2022; Accepted: 23/02/2022 Abstract This study was to evaluate the effect of Ethyl methane sulfonate on mutant formation in gloxinia (Sinningia speciose (G Lodd.) Hiern) Stem segments with axillary buds of in vitro gloxinia samples were treated with six different EMS concentrations (0%, 0.2%, 0.4%; 0.6%; 0.8%; 1%) for hour and hours The results showed that, the higher EMS concentration, longer treatment time, the lower the survival rate, shoot regeneration rate and the more different morphologies appear compared to the control Among these, EMS concentration of 0.8% for hour and EMS concentration of 0.2% for hours treatments showed a different phenotype of the seedlings compared with the control, and had a high regeneration ability The ITS regions of these two treatments were sequenced to detect 13 SNPs (Single nucleotide polymorphism), in which EMS treatment at a concentration of 0.8% for hour recorded 12 SNP markers, and 0.2% for hours recorded SNP marker Keywords: EMS, mutant, Sinningia speciosa (G Lodd.) Hiern, sequencing ITS DOI: https://doi.org/10.52714/dthu.11.2.2022.941 Trích dẫn: Đặng Thị Phương Thảo, Ngơ Minh Tri, Lâm Ngọc Kim Trúc, Trần Thị Mỹ Tiên, Nguyễn Bửu Thuận Nguyễn Thi Pha (2022) Khảo sát ảnh hưởng Ethyl methane sulfonate đến phát sinh đột biến hoa chuông (Si„ingia speciosa (G Lodd.) Hiern) Tap chi Khoa hoc Dai hoc Déng Thap, 74 11(2), 74-79 Tạp chí Khoa học Đại học Đồng Tháp, Tập 11, Số 2, 2022, 74-79 Đặt vấn đề Cây hoa chuông tên khoa học 1a Sinningia speciose (G Lodd.) Hiern, la m6t loại thân thảo, co dang than cu sống lâu năm, có nguồn gốc từ Đông Nam Brazil (Zaitlin, 2012, tr 1-17) Hoa chuông giống hoa nhập nội có giá trị kinh tế cao, nhờ có ưu điểm: đa dạng màu sắc (tím, đỏ tươi, hồng thẫm, hồng phớt ), kiểu dáng hoa (hoa cánh đơn, hoa cánh kép), nhiều hoa thời gian hoa kéo dài (thời gian có hoa kéo dài hàng tháng) (Nguyễn Quang Thạch és., 2004, tr 239244) Trong năm gần đây, với phát triển công nghệ tế bào thực vật, công nghệ xử lý d6t bién in vitro trở thành công cụ hữu hiệu chọn tạo giống trồng (Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh, 2013, tr 1092-1100), giúp giảm thiểu chi phí thời gian chọn tạo giống trồng Phương pháp xử lý đột bién in vitro bang tac nhân hóa học vật lý làm tăng tần số xuất đột biến với tính trạng có giá trị kinh tế lồi thực vật nói chung hoa nói riêng (Vũ Hồng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh, 2013, tr 1092-1100) EMS (Ethyl methane sulfonate) có cơng thức CH,SO,C,H,, chât hóa học biệt đên với khả gây đột biến nắm, thực vật, côn trùng tế bào người (Amini, 2014, tr 522-524) EMS làm thay đồi cấu trúc hóa học cdc nucleotide bang cach tương tác với DNA RNA tạo đột biến ngẫu nhiên cách thay nucleotide, cụ thể cách alkyl hoa guanine (Sarmiento vd cs., 2011, tr 43-73) EMS cé thẻ áp dung mau cay in vitro cua nhiều loài có thê xử lý đồng cho tế bào (Amini, 2014, tr 522-524) Nghiên cứu thực đề làm rõ tác động phát sinh đột biến việc xử lý EMS hoa chuông (Sïnningia speciose (G Lodd.) Hiern) dé tim kiếm phương pháp hitu hiéu va nong độ EMS thích hợp cho việc tạo dạng đột biến phục vụ cho công tác chọn tạo giống hoa chuông Việt Nam Nội dung nghiên cứu 2.1 Vật liệu phương pháp Vật liệu: Mau hoa chuéng in vitro duge mua tai Công ty cổ phan Dược Trang thiết bị y tế Bình Định (BIDIPHAR), có hoa màu tím viền trắng, dạng đối xứng Đoạn thân sử dụng đề làm vật liệu nuôi cấy khởi đầu Hình Mẫu mẹ túi mơ hoa chuông ¿¡ wifro sử dụng nghiên cứu (A: Mau cay me; B: tui m6 hoa chudng in vitro) Hóa chất: Mơi trường ni cấy MS (Murashige and Skoog) + 3% sucrose + 7% agar, pH (6.7-5,8) Một số hóa chất khác như: ø-Naphthaleneacetic acid (NAA), 6-Benzylaminopurine (BAP), EMS (Sigma Aldrich), cap méi ITS1/ITS4 (ITS1: 5°TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3), ITS4: 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 37’) (White va cs., 1990, tr 317), hóa chất thực ly trích DNA thực phản ứng PCR 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ thời gian xứ lý EMS đến tái sinh chỗi Đoạn thân hoa chuông in vi/ro ngâm EMS 66 nồng độ khác (0%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%) | gid va gid dé khảo sát đến tái sinh chéi Sau xử lý, mẫu rửa lại nước cất vô trùng (MS + 0,5 mg/L Quang Thạch chồi tái sinh sau cấy vào môi trường tái sinh chéi BAP + 0,2 mg/L NAA) (Nguyễn cš., 2004, tr 239-244) ghi nhận số 30 ngày (mỗi nghiệm thức 15 mẫu) Chồi tái sinh thời điểm 30 ngày tiếp tục cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh chôi (MS + 2,0 mg/L BAP + 0,2 mg/L NAA) va ghi nhan sé chéi hình thái chồi thời điểm 60 ngày, 90 ngày 120 ngày Mẫu nuôi cấy nhiệt độ 25+2°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày Thí nghiệm 2: Xác định dấu SNPS cúa vùng TS mẫu tái sinh sau xử ly EMS Các mẫu chồi tái sinh có khác biệt hình thái so với đối chứng thu nội dung sử dụng để ly trích DNA tổng số theo quy trình CTAB mô tả Rogers Bendich (1988, tr 1-10) có hiệu chỉnh (Trần Nhân Dũng, 2011) kiểm tra kỹ thuật điện di gel agarose 75 Chuyén san Khoa hoc Ty nhién 0,8% Phản ứng khuếch đại vùng ITS với cặp mơi ITSI/ITS4 có tổng thể tích phản ứng 25 pl, bao gồm: 15,75 wl: Nước cất lần tiệt trùng, H: Master buffer (5X), 1,0 ul méi ITS1 ul méi ITS4 (10 pmol), 0,25 wl: Tag unit/ul), wl DNA khu6én (~50 ng) 94°C: phut; lap lai 35 chu ky: 94°C: (10 pmol), 1,0 polymerase (5 Chu kỳ nhiệt: 30 giay, 54°C: Bang Kết khảo sát ánh hưởng cia EMS đến tái sinh chồi sau 30 ngày nuôi cấy ° Nghiệm Thời : Nong : thức gian xử lý (giờ) độ EMS (%) ĐC x JƠnE sơ mẫu x Tổng sơ chơi/ SA Nghiệm : Nghiệm 15 93 NTI 0,2 15 97 phút Điện di san pham PCR trén gel agarose 1,5% hiệu điện 25V, thời gian 60 phút Sản NT2 0,4 15 phẩm PCR rõ nét đọc trình tự Công ty First 0,6 15 NT4 0,8 15 66 NTS 1,0 15 NT6 0,2 15 NT7 0,4 15 0,6 15 0,8 15 1,0 15 30 giây, 72°C: 45 giây kết thúc 72°C: BASE Laboratories, Malaysia Chọn vùng tín hiệu ôn định giản đồ phần mềm BioEdit, tiến hành phân tích tìm dấu SNPs vùng trình tự ITS để xác định ảnh hưởng EMS đến phát sinh biến dị hoa chng Phân tích xứ lý số liệu Số liệu thu thí nghiệm phân NT3 NT8 " gid gid NT9 NT10 ° thức — thức tích phần mềm Minitab 16 phân tích trình tự phần mềm Bioedit Kết thảo luận 3.1 Kết khảo sát ánh hưởng Ethyl methane sulfonate dén kha nang tai sinh chỗi Từ kết Bảng Hình cho thấy: Sau 30 ngày khảo sát, có 6/10 NT (nghiệm thức) có chi tái sinh với số chồi nhiều NT xử lý EMS nồng độ 0,2% đạt 97 chồi tương đương với đối chứng không xử lý EMS (93 chồi) điều cho thấy nồng độ 0,2% EMS chưa ảnh hưởng đến trình tái sinh chồi mẫu cấy Kết xử lý EMS nồng độ 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% thời gian cho thấy: Số chồi tái sinh bị ảnh hưởng tăng nồng độ nhiên số tái sinh thu chưa theo quy luật định với nồng độ cụ thể nồng độ 0,4% EMS số chồi thu chồi, nồng độ 0,6% không thu chồi tái sinh, nhiên nồng độ 0,8% số chồi tái sinh tăng cao với 66 chồi giảm chéi nghiệm thức bổ sung 1,0% EMS Kết xử lý EMS thời gian thu tương tự mẫu xử lý EMS giờ, số lượng chỗi tái sinh giảm cách đáng kể: NT bổ sung 0,2% EMS có số chổi nhiều chồi, không thu chỗi nồng độ 0,4 0,6% EMS lại thu chéi nồng độ 0,8% tăng lên 1,0% khơng có chơi hình thành 76 Hình Choi tái sinh sau 30 ngày nuôi cấy Đối với việc xử lý gây đột biến, quan sát hình thái chỗi có ý nghĩa quan trọng giúp nhận biết khác biệt kiểu hình từ lựa chọn nồng độ chất gây đột biến phù hợp Nhìn chung, thời điểm 30 ngày kích thước chồi nhỏ chưa ghi nhận khác biệt rõ hình thái Dé khảo sát hình thái chồi tốt hon, chồi 30 ngày tiếp tục cấy chuyền sang môi trường MS bồ sung 2,0 mg/L BAP va 0,2 mg/L NAA Két qua quan sat hình thái cac chéi thời điểm 60 90 ngày mô tả Bảng 3, Hình Hình Nhìn chung thời điểm 60 90 ngày quan sát, nghiệm thức có khác biệt hình thái chồi so với đối chứng Đối chứng có chéi cao, to, màu xanh đậm Ngoại trừ nghiệm thức xử lý với EMS 0,2% NT lại nồng độ từ 0,4%-1% EMS có khác biệt mặt hình thái so với đối chứng như: chồi thấp, phiến xoăn, xuất nốt thân (Hình Hình 4) Tạp chí Khoa học Đại học Đồng Tháp, Tập 11, Số 2, 2022, 74-79 Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng EMS đến hình thái chỗi sau 60 90 ngày nuôi cấy ee > Nghiệm thức Thời gian xửlý ĐC , (giờ) À aA Nông oe EMS - (%) Hi tin h th Sau 60 ngày nuôi Chôi cao, to, màu NT2 NT3 “ 0,8 NTS 1,0 to màu xanh đậm, 44 ChOi cao, to, phiến xoăn nơt màu xanh, rễ ít, ngắn Chồi thấp, to, phiến xoăn, Chồi thấp, to, phiến xoăn bê in có màu xanh đậm 0,6 NT4 Sau 90 ngày nuôi cấy Choi cao, to, phiên XOăn, màiHàm xanh nhạt, xsdưới thân có có màu xanh đậm ý 0,4 gid củ ré it, ngan 02 hi Ae xanh Choi cao, đậm NTI ne choi x, màu xanh nhạt, rễ ít, ngăn - A946 a x x1, Chéi thấp, to, phiến xoăn Chỗi thập, to, phien Id xoan, màu xanh nhạt, X đưới thânTY: có có màu xanh đậm ng TC TIÀ nôt màu xanh, rễ nhiêu, dài Chéi thấp, nhỏ, có màu Chồi thấp, nhỏ, sẹo N màu xanh nhạt xanh nhạt Chồi thấp, to, phiến xoăn, NT6 0,2 NT7 0,4 NT8 gid phan cuống dính lại với Chi thấp, to, phiến xoăn bao quanh xanh nhạt 0,6 NT9 08 ° NTI0 1,0 re thân, có màu “ mau xanh nhạt # Chỏi thấp, nhỏ, phiến xoăn, dày phân cng dính lại với bao quanh thân, có màu xanh rât nhạt - # Chơi thâp, nhỏ, phiên xoăn màu xanh rât nhạt - Ghi chu: “-” biểu thị mẫu khảo sát nghiệm thức không thu kết Quan sát chồi 120 ngày cho thấy có khác biệt rõ rệt màu sắc số nghiệm thức Cụ thể, nghiệm thức xử lý 0,2% EMS chồi có màu trắng, hồng, tồn phần phần Nghiệm thức xử lý 0,8% EMS 1h chi xuất kiểu hình khác biệt, chồi có màu hồng đậm so với BS: 1.6% 08% - Hinh Mau choi khảo sát thời điểm 60 ngày nghiệm thức 0,2% EMS chồi có màu cam toàn phần I phần Sự khác biệt kiểu hình màu phiến hoa chng ni cấy diéu kién in vitro, chimg tỏ có thay đổi vật chất truyền mẫu hoa chuông sau xử lý đột biến tác nhân EMS, dẫn đến thay đổi protein sắc tố, tạo nên đa dạng màu sắc thân phiến EMS hóa chất dtl thường dùng để xử lý, tạo đột biến nhằm kích NTS—EMS 1,0% 1h NTI6-EMS02%2h NT9-EMS08%2h Hình Mẫu chồi khảo sát thời điểm 90 ngày ni cấy thích, tìm đặc tính trồng (Altindal va Altindal, 2018) Từ kết nghiên cứu này, cho thay EMS hóa chất thích hợp ứng dụng chọn tạo giống hoa chuông Kết tương tự 77 Chuyén san Khoa hoc Ty nhién nghiên cứu Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013, tr 1092-1100) cẩm chướng; Senapati Rout (2008, tr 218-222) hoa hồng; Devi Mullainathan (201 1, tr 368-374) ớt xử lý đột biến đề tài lần khẳng định tác dụng gây biến dị hóa chất EMS qua việc ghi nhận xuất dấu SNPs vùng bảo tồn ITS Kết luận Xử lý đoạn thân với thời gian (I giờ) nồng độ EMS từ 0,2% đến 1,0% cho thấy, nồng độ EMS cang cao, thời gian xử lý mẫu dai tỷ lệ mẫu sống, phát sinh chồi giảm Quan sát hình thái ghi nhận 02 NT tạo kiểu hình khác biệt so với đối chứng có sức sống tốt NT 0,8% EMS Hình Mẫu chồi xử lý EMS sau 120 ngày nuôi cấy 3.2 Xác định dầu NSPs mẫu tái sinh sau xử lý EMS vùng ITS Doi_Chung hóa chất EMS khảo sát, xử lý mẫu cấy với EMS EMS _NT6_(2h/0, 28) 0,8% thời gian phù hợp để cảm ứng Doi_chung EMS_WP4_(1h/0,8%) EMS_NT6_(2h/0,28) đột biến mẫu cấy hoa chuông với 12 dấu SNPs CCACTAGCGG TGGCTGGACC CTTCGCGCGC TGGAGTGACA ATACTTGTCT sỒ Bee wee! Tc ÀA T TT G .AT Hình Vị trí SNPs xuất so sánh dãy trình tự xử lý EMS so với mâu đôi chứng: A: Adenine; T: Thymine; G: Guanin; C: Cytosine; "." biéu thi vi tri không xuất vi tri SNPs Dau "-" biéu thị nghiệm thức không ghi nhận nucleotide Từ kết xử lý EMS nồng độ thời gian khác ghi nhận NT có chồi tái sinh (các NT: 0,2; 0,4; 0,8 1,0% EMS gio va 0,2; 0,8% EMS giờ), có NT có hình thái chồi khác biệt nhiều so với ĐC có sức sống tốt NT 0,8% EMS Ih NT 0,2% EMS 2h (Hình 5) Các mẫu chồi tái sinh NT ly trích DNA đọc trình tự vùng ITS với mẫu đối chứng Kết có 13 dấu SNPs ghi nhận, gồm 12 SNPs xuất mẫu xử lý EMS nồng độ 0,8% bao gồm vị trí nucleotide số: 474, 501, 508, 514, 521, 522, 528, 533, 534, 542 va 543 va SNPs & mau xtr ly EMS 0,2% vị trí 424 bp (Hình 5) EMS nhiều báo cáo cho thấy khả làm phát sinh đột biến q trình ni cay m6 (Jabeen va Mirza, 2004, tr 340-345; Senapati va Rout, 2008, tr 218-222), két 78 SNPs, đó, mẫu xử lý EMS 0,8% SNPs vị trí 424 Từ kết nghiên cứu dựa EMS_N?4_ (1h/0,88) EMS_NT4_(1h/0, 84) EMS_NT6_(2h/0, 24) tự vùng ITS chồi từ NT nảy phát I3 dấu cho 12 SNPs vi tri (474, 501, 508, 514, 521, 522, 528, 533, 534, 542, 543) va EMS 0,2% có 420 Doi_Chung I 0,2% EMS Phân tích trình ghi nhận sở cho thấy triển vọng việc làm thay đổi kiểu gen mẫu xử lý EMS so với đối chứng làm sở cho việc chọn tạo giống Tài liệu tham khảo Altindal, D., and N Altindal (2018) Effect of Ethyl Methanesulphonate (EMS) applications on in vitro growth of sunflower (Helianthus annuus L ev Palanci-I) under salinity conditions Journal of the Institute of Science and Technology, 8(4), 351-359 Amini, M (2014) Ethyl Methanesulfonate In Philip Wexler (Editor), Encyclopedia of Toxicology, (522-524) Academic Press Devi, A., and L Mullainathan (2011) Genotoxicity effect of ethyl methanesulfonate on root tip cells of chilli (Capsicum annuum L.) World Journal of Agricultural Sciences, 7(4), 368-374 Jabeen, N., and B Mirza (2004) Ethyl methanesulfonate induces morphological mutations in Capsicum annuum /nternational Journal of Agriculture & Biology, 6(2), 340-345 Nguyễn Quang Thạch, Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Xuân Trường, Nguyễn Công Hoan Nguyễn Thị Lý Anh (2004) Nghiên cứu nhân nhanh hoa Tạp chí Khoa học Đại học Đồng chng (Sinningia speciosa) Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nơng nghiệp, 4, 239-244 Rogers S.O., and A.J Bendich (1988) Extraction of DNA from plant tissues Plant Molecular Biology Manual, A6, 1-10 Sarmiento, F.B., J A Leigh, and W B Whitman (2011) Chapter three-Genetic Systems for Hydrogenotrophic Methanogens Methods in Enzymology, 494, 43-73 Senapati, S.K., and G R Rout (2008) In vitro mutagenesis of rose with ethylmethanesulphonate (EMS) and early selection using RAPD markers Advances in Horticultural Science, 22(3), 218-222 Tháp, Tập 11, Số 2, 2022, 74-79 Vũ Hoàng Hiệp Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Ảnh hưởng xử lý đột biến in vitro bang Ethyl Methane Sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia gamma đến biến dị hoa câm chướng (Dianthus caryophyllus L.) Tạp chí Khoa học va Phat trién, 11(8), 1092-1100 White, T J., T D Bruns, S B Lee, and J W Taylor (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA Genes for phylogenetics Academic Press, 38, 317 Zaitlin, D (2012) Intraspecific diversity in Sinningia speciosa (Gesneriaceae: Sinningieae), and possible origins of the cultivated florist’s gloxinia AoB Plants, pls039, 1-17 79 ... thảo luận 3.1 Kết khảo sát ánh hưởng Ethyl methane sulfonate dén kha nang tai sinh chỗi Từ kết Bảng Hình cho thấy: Sau 30 ngày khảo sát, có 6/10 NT (nghiệm thức) có chi tái sinh với số chồi nhiều... nghiệm 1: Khảo sát nồng độ thời gian xứ lý EMS đến tái sinh chỗi Đoạn thân hoa chuông in vi/ro ngâm EMS 66 nồng độ khác (0%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%) | gid va gid dé khảo sát đến tái sinh chéi... làm rõ tác động phát sinh đột biến việc xử lý EMS hoa chuông (Sïnningia speciose (G Lodd.) Hiern) dé tim kiếm phương pháp hitu hiéu va nong độ EMS thích hợp cho việc tạo dạng đột biến phục vụ cho