Sử dụng kỹ thuật pcr rflp để phát hiện đột biến kháng lamivudine và đột biến basal core promter của virus viêm gan b

PHIẾU ĐĂNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KH-CN Tên đề tài: SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B Mã số: Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Địa chỉ: Số Phạm Ngọc Thạch, P Bến Nghé, Q1, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 8233363 Tổng chi phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách Nhà nước: - Kinh phí Bộ/Tỉnh: - Vay tín dụng: - Vốn tự có: - Thu hồi: Thời gian nghiên cứu: Thời gian bắt đầu: Thời gian kết thúc 50.000.000 VND 12 Tháng 9/2006 9/2007 Tên cán phối hợp nghiên cứu: PGS TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM GS.BSCKII Phạm Hòang Phiệt – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM ThS Nguyễn Chí Vinh – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM CN Hoàng Ngọc Diễm Mi – Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM CN Hồ Thị Thanh Thủy – Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM Số đăng ký đề tài: Số chứng nhận đăng ký KQNC: Ngày: Ngày: Bảo mật: A Phổ biến rộng rãi B Phổ biến hạn chế C Bảo mật Tóm tắt kết nghiên cứu Đã xây dựng Quy trình xác định đột biến basal core promoter kỹ thuật Nested PCR RFLP, khả phát đột biến 30% (3x103 sao/ml) Đã xây dựng Quy trình xác định đột biến kháng lamivudine rt180, rt204 kỹ thuật Nested PCR – RFLP, khả phát đột biến 10% (1x103 sao/ml), độ nhạy 6,25x102 sao/ml Đã tạo dòng mang đột biến 180M-204V có tỉ lệ tương đồng trình tự gene 96,3% dòng 204I có tỉ lệ tương đồng 95,8% plasmid pGEM-T Đã thử nghiệm quy trình 127 mẫu huyết bệnh nhân, đột biến basal core promoter chiếm tỉ lệ 32% nhóm khảo sát, đột biến kháng lamivudine chiếm tỉ lệ 74,4% nhóm khảo sát phổ biến dạng 204I 180M-204V Các kết xác định đột biến phù hợp với lâm sàng Kiến nghị quy mơ đối tượng áp dụng kết nghiên cứu: Kiến nghị sử dụng quy trình để ứng dụng cho bệnh nhân viêm gan B điều trị lamivudine, trước tiên bệnh nhân Bệnh viện Đại học Y dược TPHCM Kiến nghị chuyển giao kết nghiên cứu cho Công ty TNHH CNSH Khoa Thương để tiếp tục nghiên cứu sâu phổ biến quy trình Đề nghị mở rộng nghiên cứu tình hình kháng lamivudine bệnh nhân viêm gan B TPHCM nay, thực khảo sát theo thời gian điều trị (1, 2, năm) theo phân loại thuốc sử dụng (lamivudine, entecavir, telbivudine) Chức vụ Họ tên Học vị Ký tên Đóng dấu Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Chí Vinh ThS Cơ quan chủ trì đề tài Chủ tịch Hội đồng Đánh giá thức Cơ quan quản lý đề tài Nguyễn Công Tĩnh Nguyễn Văn Thanh Phan Minh Tân CN GS TS PGS.TS SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ -BÁO CÁO NGHIỆM THU (ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU) ĐỀ TÀI SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS NGUYỄN CHÍ VINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008 SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KH-CN TRẺ -BÁO CÁO NGHIỆM THU (ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG NGHIỆM THU) ĐỀ TÀI SỬ DỤNG KỸ THUẬT NESTED PCR – RFLP ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG LAMIVUDINE VÀ ĐỘT BIẾN BASAL CORE PROMOTER CỦA VIRUS VIÊM GAN B CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS NGUYỄN CHÍ VINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TT PHÁT TRIỂN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TRẺ CỐ VẤN CHUYÊN MÔN: PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG GS.BSCKII PHẠM HOÀNG PHIỆT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2008 THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: 09/2006 – 01/2008 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI: Khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM THÀNH PHẦN THAM GIA: ThS Nguyễn Chí Vinh: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y dược CN Hoàng Ngọc Bảo Mi: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược CN Dương Thị Thanh Hương: Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện ĐH Y dược CN Hồ Thị Thanh Thủy: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên CN Nguyễn Vũ Trung Kiên: Bộ môn Di truyền – ĐH Khoa học Tự nhiên CN Ngô Thị Thanh Tuyền: Trung tâm xét nghiệm Diag Center CỐ VẤN CHUYÊN MÔN: PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương – Bộ môn Di truyền Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM GS.BSCKII Phạm Hoàng Phiệt – Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Đại học Y dược TP.HCM Bảng ghi chữ viết taét: Antiviral BCP BET bp DNA dATP dCTP dGTP dTTP dUTP dNTP DW EDTA HBV IFN LAM M Mut Nu OLT PCR Phage Plasmid Primer RFLP rpm Sequencing Taq V YMDD Wt : Thuốc kháng virus : Basal core promoter : Ethidium bromide : base pair – caëp base : Deoxyribonucleic acid : 2’-deoxyadenosin- 5’- triphosphate : 2’-deoxycytidin- 5’- triphosphate : 2’-deoxyguanosin- 5’- triphosphate : 2’-deoxythymidin- 5’- triphosphate : 2’-deoxyuridin- 5’- triphosphate : 2’-deoxynucleosid- 5’- triphosphate : Distilled water – nước cất vô trùng : Ethyldiamin tetra-acetic acid : Hepatitis B Virus, Virus vieâm gan B : Interferon : Lamivudine : Methionine : Mutation – đột biến : Nucleotide : Orthotopic liver transplant – gheùp gan : Polymerase chain reaction : Thực khuẩn thể : Thể mang DNA mục tiêu – dùng kỹ thuật tạo dòng : Mồi – dùng phản ứng PCR : Restriction fragment length polymorphisms – tính đa hình kích thước trình tự giới hạn : rounds per minute – vòng phút : Giải trình tự nucleotide : Thermus aquaticus : Valine : Tyrosine Methionine Aspartate Aspartate : Wild type – hoang dại PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU PHẦN 2: NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP PHẦN 3: KẾT QUẢ – BÀN LUẬN MỤC LỤC Trang Bảng ghi chữ viết tắt Mục lục PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Việt Nam thuộc vùng nhiễm bệnh lý HBV nặng, số lượng bệnh nhân có định điều trị lớn Chẩn đoán đột biến Basal core promoter đột biến kháng lamivudine giúp ích cho việc theo dõi điều trị bệnh viêm gan B Nested PCR-RFLP kỹ thuật đơn giản tiện ích để xác định đột biến Basal core promoter đột biến kháng lamivudine 1 PHẦN 2: NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP Tạo vật liệu cho quy trình 1.1 Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương đột biến Basal core promoter 1.2 Tạo dòng lưu trữ dạng đột biến kháng lamivudine, từ tạo sản phẩm PCR chứng dương Thử nghiệm thay đổi số yếu tố 2.1 Tách chiết DNA phương pháp tủa thay cho phương pháp Boom 2.2 Nested PCR thay cho PCR bước 2.3 Phản ứng ủ thích hợp cho enzyme giới hạn 2.4 Điện di microfluidic thay cho điện di agarose 3% Thử khả phát đột biến huyết có hỗn hợp HBV đột biến/hoang dại 3.1 Khả phát đột biến Basal core promoter huyết hỗn hợp 3.2 Khả phát đột biến kháng lamivudine huyết hỗn hợp 3.3 Độ nhạy quy trình xác định đột biến kháng lamivudine Thực quy trình cải tiến huyết bệnh nhân 4.1 Xác định đột biến Basal core promoter huyết bệnh nhân 4.2 Xác định đột biến kháng lamivudine huyết bệnh nhân 14 14 PHẦN 3: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN Kết việc tạo vật liệu cho quy trình 1.1 Tạo sản phẩm Nested PCR chứng dương đột biến Basal core 15 8 10 11 12 12 13 13 Hình 3.15 biểu thị điện di sản phẩm PCR – RFLP thực quy trình Nested PCR-RFLP huyết pha loãng có nồng độ HBV DNA giảm dần (5x103; 2,5x103; 1,25x103; 6,25x102, 3,12x102, 1,55x102 sao/ml) ghi nhận ngưỡng phát quy trình 6,25x102 sao/ml – tương ứng với giếng số Quy trình không thực huyết có nồng độ HBV DNA < 6,25x102 sao/ml Như vậy, quy trình Nested PCRRFLP có độ nhạy 6,25x102 sao/ml Như vậy, sau thực nội dung đầu công việc xây dựng quy trình, thu số kết có ưu điểm so với quy trình cũ tác giả, tóm tắt bảng 3.2 Bảng 3.2: Tóm tắt ưu điểm quy trình so với quy trình cũ Nội dung Kết Quy trình cũ Quy trình So sánh Bằng Tốt Mới Chứng dương Không Có √ 1762T-1764A Chứng 180M dương Có, lấy từ đề Có, tự tạo √ tài khác 36 Chứng dương Có, lấy từ đề Có, tự tạo 204I tài khác Plasmid 204I Có, lấy từ đề Có, tự tạo √ √ tài khác Plasmid 180M- Có, lấy từ đề Có, tự tạo 204V So √ tài khác sánh tách Tủa chiết HBV DNA tốt Tủa tốt √ Quiagen – 10 Boom – lần lần Kiểu PCR Khảo sát phản PCR bước Không Nested-PCR √ Có √ Microfluidic √ ứng enzyme giới hạn Điện di Nhuộm SYBR Khả phát 10 % đột 10% √ biến dạng hỗn hợp Độ nhạy 104 6,25x102 sao/ml sao/ml Độ tương đồng 95 – 97% 95,8% trình tự gene 180M-204V √ √ 96,3% 204I 37 Phương pháp Nested PCR-RFLP (Nested Polymerase chain reaction – Restriction fragment length polymorphism) Huyeát Tách chiết DNA HBV DNA PCR Sản phẩm PCR PCR Sản phẩm Nested PCR Các enzyme giới hạn Sản phẩm Nested PCR – RFLP Điện di, So sánh kích thước Kết luận (gene hoang dại hay đột biến) Hình 3.16: Tóm tắt quy trình xác định đột biến Basal core promoter quy trình phát đột biến kháng lamivudine KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN THỰC TẾ Kết việc thực quy trình cải tiến bệnh nhân 4.1 Xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân Thực quy trình xác định đột biến Basal core promoter 25 mẫu huyết bệnh nhân có định xét nghiệm, ghi nhận tỉ lệ xuất đột biến Basal core promoter 32% (8/25) L C+ 38 Hình 3.16a: Xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân Theo kết hình 3.16a, mẫu số có đột biến Basal core promoter 1762T1764A, so với chứng dương (C+) Thang trọng lượng phân tử 100 bp (L) Các mẫu 1, 3, 4, 5, 6, đột biến C+ 10 11 12 13 Hình 3.16b: Xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân Theo kết hình 3.16b, mẫu 12, 13 có đột biến Basal core promoter 1762T1764A, so với chứng dương (C+) Các mẫu 8, 9, 10, 11 đột biến Hình 3.16c: Xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân 39 Theo kết hình 3.16c, mẫu 14, 16 có đột biến Basal core promoter 1762T1764A, so với chứng dương (C+) Các mẫu 15, 17, 18 đột biến L C+ C- 19 20 21 22 23 24 25 C+ C- Hình 3.16d, 16e: Xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân Theo kết hình 3.16d, mẫu số 20 có đột biến Basal core promoter 1762T1764A, so với chứng dương (C+), chứng âm (C-) Thang trọng lượng phân tử (L) Mẫu 19 đột biến Theo kết hình 3.16e, Mẫu số 22, 25 có đột biến Basal core promoter 1762T-1764A, so với chứng dương (C+), chứng âm (C-) Các mẫu 21, 23, 24 đột biến Bảng 3.3: Kết xác định đột biến Basal core promoter bệnh nhân STT 01 02 03 04 Kết Mã số BCP01 BCP02 BCP03 BCP04 wt √ 1762T-1764A √ √ √ 40 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 BCP05 BCP06 BCP07 BCP08 BCP09 BCP10 BCP11 BCP12 BCP13 BCP14 BCP15 BCP16 BCP17 BCP18 BCP19 BCP20 BCP21 BCP22 BCP23 BCP24 BCP25 Tổng cộng √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 17 4.2 Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Chúng thực quy trình Nested PCR-RFLP 102 mẫu huyết bệnh nhân bước đầu có biểu giảm hiệu điều trị Có đến 74,4% (76/102) bệnh nhân nhóm có HBV đột biến kháng thuốc, chủ yếu kháng thuốc cấp độ với tỉ lệ 61,7% - cao gấp 4,8 lần so với kháng thuốc cấp độ (12,7%) Trường hợp bệnh nhân có hỗn hợp đột biến hoang dại 17,6% Đây ưu điểm Nested PCR-RFLP thực hành lâm sàng, phù hợp với nhận định Allen MI 41 Hình 3.17a: Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Theo kết hình 3.17a, giếng số 1, đột biến rt180/NlaIII Các giếng số 2, đột biến rt204/NdeI; thể giếng số 3, 6/NlaIII 42 Hình 3.17b: Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Theo kết hình 3.17b: Các giếng số 2, có hỗn hợp đột biến 204I hoang dại Các giếng số 5, 11 có đột biến 204I hoàn toàn Các giếng số 4, 10 có hỗn hợp đột biến 180M hoang dại Các giếng 1, giếng hoang dại rt180 Hình 3.17c: Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Theo kết hình 3.17c: Giếng số 10 có đột biến 180M hoàn toàn Giếng đột biến rt180 Các giếng số 4, có hỗn hợp đột biến 180M hoang dại Giếng số đột biến rt204 Giếng 8, thể đột biến 204V hoàn toàn 43 Hình 3.17d: Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Theo kết hình 3.17d: Các giếng số 1, 4, có hỗn hợp đột biến 180M hoang dại Giếng 10 có đột biến 180M hoàn toàn Giếng số 8, thể đột biến 204I hoàn toàn Giếng số 11, 12 thể đột biến 204V hoàn toàn Hình 3.17e: Xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân Theo kết hình 3.17e: Các giếng số 1, 4, 7, 10 đột biến rt180 Các giếng 2, 5, 8, 11 thể dạng hỗn hợp 204I hoang dại Bảng 3.4: Kết xác định đột biến kháng lamivudine bệnh nhân STT Mã số Kết rt180 001 002 003 004 005 006 KL01 KL02 KL03 KL04 KL05 KL06 wt √ M √ √ wt √ rt204 V I √ √ √ √ √ √ √ √ 44 007 008 009 010 011 012 013 014 015 016 017 018 019 020 021 022 023 024 025 026 027 028 029 030 031 032 033 034 035 036 037 038 039 040 041 042 043 044 045 046 KL07 KL08 KL09 KL10 KL11 KL12 KL13 KL14 KL15 KL16 KL17 KL18 KL19 KL20 KL21 KL22 KL23 KL24 KL25 KL26 KL27 KL28 KL29 KL30 KL31 KL32 KL33 KL34 KL35 KL36 KL37 KL38 KL39 KL40 KL41 KL42 KL43 KL44 KL45 KL46 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 45 047 048 049 050 051 052 053 054 055 056 057 058 059 060 061 062 063 064 065 066 067 068 069 070 071 072 073 074 075 076 077 078 079 080 081 082 083 084 085 086 KL47 KL48 KL49 KL50 KL51 KL52 KL53 KL54 KL55 KL56 KL57 KL58 KL59 KL60 KL61 KL62 KL63 KL64 KL65 KL66 KL67 KL68 KL69 KL70 KL71 KL72 KL73 KL74 KL75 KL76 KL77 KL78 KL79 KL80 KL81 KL82 KL83 KL84 KL85 LAM01 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 46 087 088 089 090 091 092 093 094 095 096 097 098 099 100 101 102 LAM02 LAM03 LAM04 LAM05 LAM06 LAM07 LAM08 LAM09 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM16 LAM17 Tổng cộng √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 80 (6mix) √ 28 51 (12 mix) 23 40 Tỉ lệ xuất cấp độ đột biến kháng thuốc nhóm khảo sát ghi nhận bảng 3.4 Bảng 3.4: Tỉ lệ đột biến kháng lamivudine nhóm khảo sát Kết wt Kháng thuốc Kháng thuốc Hỗn hợp cấp độ cấp độ (wt+đột biến) 180M đơn lẻ 204I 204V 40 23 Số mẫu 24 13 Tỉ lệ (%) 25,6 12,7 61,7 18 17,6 47 Tổ Tổng ng kế kết thử thử nghiệ nghiệm quy trì trình xá xác định đột biế biến kháng ng lamivudine 100 80 60 40 % 20 n=102 % n=102 Hoang Đột biến 180M dại 204I 204V 180-204 Hỗn hợp Hoang dại Đột biến 180M 204I 204V 180-204 Hỗn hợp 25,6 74,4 12,7 39,2 22,5 14,7 17,6 24 78 13 40 23 15 18 Hình 3.18: Đồ thị minh họa dạng đột biến kháng lamivudine nhóm khảo sát 48 Kết luận: Từ kết thu nhận được, rút số kết luận sau: Chúng thực cải tiến thành công Quy trình xác định đột biến Basal core promoter Quy trình xác định đột biến kháng lamivudine rt180 – rt204 virus viêm gan B kỹ thuật Nested PCR-RFLP Chúng tạo dòng thành công dạng đột biến kháng lamivudine phổ biến: dạng M204I dạng L180M phối hợp với M204V Độ tương đồng trình tự gene dòng 96,3% 95,8% Quy trình phát đột biến Basal core promoter sau cải tiến có khả phát đột biến tỉ lệ 30% huyết có hỗn hợp HBV đột biến hoang dại, tương ứng với 3x103 sao/ml Quy trình phát đột biến kháng lamivudine sau cải tiến có khả phát đột biến tỉ lệ 10% huyết có hỗn hợp HBV đột biến hoang dại Độ nhạy quy trình Nested PCR-RFLP xác định đột biến kháng lamivudine 6,25x102 sao/ml Kỹ thuật Nested PCR-RFLP có ưu điểm việc phát hỗn hợp HBV hoang dại đột biến Việc kết hợp với điện di microfluidic giúp quy trình phát huy ưu điểm chẩn đoán thường quy Kết xác định đột biến bệnh nhân cho thấy: - Đột biến Basal core promoter chiếm tỉ lệ 32% nhóm khảo sát - Đột biến kháng lamivudine có tần suất cao nhóm khảo sát (74,4%), phổ biến dạng M204I (39,2%) L180M/M204V (14,7%) 49 Đề nghị: Chúng đề xuất ứng dụng quy trình Nested PCR-RFLP để phục vụ cho lâm sàng quy trình có giá thành tiết kiệm so với kỹ thuật phát khác, kỹ thuật lại đơn giản Cần thực nghiên cứu mở rộng nhóm đối tượng bệnh nhân: trước điều trị, điều trị năm thứ 1, 2, số lượng mẫu lớn để có đánh giá cụ thể tình trạng kháng lamivudine 50