Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến gen BTK gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính x

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** - NGÔ MẠNH TIẾN ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẨM SINH THỂ KHÔNG CĨ GAMMAGLOBULIN MÁU LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI *** - NGÔ MẠNH TIẾN ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BTK GÂY BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẨM SINH THỂ KHƠNG CĨ GAMMAGLOBULIN MÁU LIÊN KẾT NHIỄM SẮC THỂ GIỚI TÍNH X Chun ngành: Cơng nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS KHUẤT HỮU THANH HÀ NỘI - 2018 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Ngô Mạnh Tiến Đề tài luận văn: “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen btk gây bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X” Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CB160059 Tác giả, Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 10/10/2018 với nội dung sau: - Trang 1, phần mở đầu, thay “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase” - Trang 4, mục 1.2.2, thay “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase” - Trang 8, mục 1.2.3.3, thay “Tế bào mầm tạo máu” thành “tế bào gốc tạo máu”, thay “Tế bào đầu dòng lympho” thành “Tế bào tiền thân lympho” - Trang 8, muc 1.2.3.3, thay “Tế bào proB” thành “Tế bào hƣớng dòng B”, thay “tế bào PreB” thành “Tế bào tiền B” - Trang 10, mục 1.3.1, thay “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase” - Trang 11, mục 1.3.2, thay “Cytoplasmic tyrosine kinase” thành “Bruton tyrosine kinase” - Trang 14, mục 1.4.2.1, thay “suy giảm miễn dịch phối hợp trầm trọng” thành “bệnh suy giảm miễn dịch kết hợp nguy kịch” i - Trang 35, mục 3.3.1, bổ sung “các đột biến đƣợc thể phụ lục 3” - Trang 37, mục 3.3.1, thay “sự sau khác trình dịch mã tạo mRNA” thành “làm thay đổi vị trí báo hiệu cho việc cắt xác đoạn introng” - Trang 40, muc 3.3.1, bổ sung “Các đột biến vùng ghép nối exon/intron cần phải khẳng định thêm thực nghiệm thơng qua phân tích mRNA.” - Trang 47, mục 3.3.3, bổ sung “Trong số 31 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh XLA, 04 bệnh nhân có biểu lâm sàng ” Ngày 08 tháng 11 năm 2018 Tác giả luận văn Giáo viên hƣớng dẫn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ii LỜI CAM ĐOAN Tôi Ngô Mạnh Tiến, học viên lớp Cao học khóa 16B-CNSH, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn thầy PGS TS Khuất Hữu Thanh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác trung thực, phần đƣợc công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2018 Tác giả Ngô Mạnh Tiến i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin đƣợc cảm ơn chân thành đến ngƣời thầy khoa học, PGS.TS Khuất Hữu Thanh - Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo động viên em suốt trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn BS Ngô Diễm Ngọc, trƣởng khoa Di truyền Sinh học phân tử- Bệnh viện Nhi Trung Ƣơng tạo đạo điều kiện cho em hoàn thành nghiên cứu Em xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức cho em trình học tập rèn luyện Trong thời gian học tập nghiên cứu em nhận đƣợc giúp đỡ tận tình đầy động viên khích lệ tập thể cán nhân viên khoa Di truyền Sinh học phân tử, em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, cổ vũ cho vững bƣớc đƣờng học tập nghiên cứu Ngô Mạnh Tiến ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ Nghĩa tiếng việt Bp Base pair Cặp bazơ BTK Burton’s tyrosine kinase c.DNA Complementary DNA Cs Cộng DNA Deoxyribonucleric acid dNTP Dideoxynucleoside triphosphate EtBr Ethidium bromide Kb Kilo base kDa Kilo Dalton MLPA Multiplex DNA bổ sung Ligation-dependent Kỹ thuật khuếch đại đa mồi dựa Probe Amplification vào phản ứng nối mRNA messenger RNA RNA thông tin RNA Ribonucleic acid NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp sIg Surface Immunoglobulin Kháng thể bề mặt SNPs Single nucleotide Đa hình nucleotid đơn polymorphisms SGMD Suy giảm miễn dịch SGMDBS Suy giảm miễn dịch bẩm sinh TVDT Tƣ vấn di truyền XLA X-linked agammaglobulinemia Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR .24 Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại gen BTK .25 Bảng 2.3 Trình tự mồi phản ứng PCR mồi đơn .27 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR mồi đơn 27 Bảng 3.1 Kết xác định đột biến kỹ thuật giải trình tự gen 35 Bảng 3.3 Danh sách đột biến gen BTK 36 Bảng 3.4 Kết xác định đột biến kỹ thuật MLPA 42 Bảng 3.5 Kiểu gen 31 bệnh nhân XLA .44 Bảng 3.6 Tỷ lệ đột biến gen BTK 46 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Nồng độ kháng thể trẻ .5 Hình 1.2: Sự phát triển biệt hóa lympho B bệnh XLA Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen BTK 10 Hình 1.4 Cấu trúc chiều protein BTK 11 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xác định đột biến gen BTK gây bệnh XLA .22 Hình 2.2 Sơ đồ nhân đoạn gen BTK 24 Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen BTK ngƣời bình thƣờng 33 Hình 3.2 Kết phân tích MLPA ngƣời bình thƣờng 34 Hình 3.3 Ảnh đột biến c.1735G>C (p.D579H) gen BTK 36 Hình 3.4 Ảnh đột biến c.1908+2_11delinsC gen BTK .37 Hình 3.5 Ảnh đột biến c.521-1G>A (p.IVS6-1G>A) gen BTK 38 Hình 3.6 Ảnh đột biến c.1578_1581del (p.C527Wfs*2) gen BTK 38 Hình 3.7 Ảnh điện di bệnh nhân XLA-26 XLA-27 gen BTK .41 Hình 3.8 Kết phân tích MLPA bệnh nhân XLA-26 XLA-27 42 Hình 3.9 Phân bố dạng đột biến gen BTK 45 Hình 3.10 Tỷ lệ phát đột biến vùng gen BTK 47 Hình 3.11 Vị trí tỷ lệ đột biến gen BTK gây bệnh XLA bệnh nhân nghiên cứu 48 v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG : TỔNG QUAN 1.1 Bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh 1.2 Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (XLA) 1.2.1 Định nghĩa bệnh XLA .4 1.2.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh XLA 1.2.3 Đặc điểm cận lâm sàng bệnh XLA .5 1.2.4 Dịch tễ học 1.3 Cơ sở di truyền bệnh XLA .10 1.3.1 Vị trí cấu trúc gen BTK 10 1.3.2 Cấu trúc chức protein BTK .10 1.3.3 Đặc điểm di truyền đột biến gen BTK 11 1.4 Chẩn đoán bệnh XLA 12 1.4.1 Tiêu chuẩn lâm sàng 13 1.4.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 13 1.4.3 Xét nghiệm sinh học phân tử phân tích gen BTK 15 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh XLA 16 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 16 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 18 CHƢƠNG : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 vi KIẾN NGHỊ Phân tích đột biến gen BTK cho thành viên gia đình bệnh nhân, nhằm phát sớm ngƣời bị bệnh ngƣời mang gen bệnh để làm sở cho tƣ vấn di truyền chẩn đoán trƣớc sinh bệnh XLA Nghiên cứu chế gây bệnh đột biến ảnh hƣởng đột biến bao gồm: p.D579H, p.IVS18+2_11delinsC, p.C527Wfs*2 p.IVS61G>A mơ hình cấu trúc 3D mức độ protein 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Nguyễn Thị Vân Anh, Lê Thị Minh Hƣơng, Trƣơng Ngọc Dƣơng (2013), “Báo cáo ca bệnh vô gammaglobulin huyết liên quan đến nhiễm sắc thể X trẻ em”, Tạp chí y dược lâm sàng, 108, tập (2), tr 65-69 Lê Đình Lƣơng (2001), Nguyên lý kĩ thuật di truyền, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội Lâm Thị Mỹ (2011), “Đặc điểm bệnh nhân thiếu Gammaglobulin máu có liên quan nhiễm sắc thể giới tính bệnh viện Nhi đồng TP Hồ Chí Minh”, Tạp chí nghiên cứu y học, tập 1, phụ san số 4 Hoàng Anh Vũ (2013), “Đột biến gen BTK bệnh nhân thiếu Gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể X”, Tạp chí Nghiên cứu y học, tập 17, số Tiếng Anh: Akintunde Akinleye, Yamei Chen (2013), “Ibrutinib and novel BTK inhibitors in clinical development”, Journal of Hematology & Oncology , (1): 59 Basile Natalia, Silvia Danielian (2009), “Clinical and Molecular Analysis of 49 Patients With X-linked Agammaglobulinemia From A Single Center in Argentina”, Volume 29, Issue 1, pp 123–129 Boyle Jm, Buckley Rh (2007), “Population prevalence of diagnosed primary immunodeficiency diseases in the United States”, J Clin Immunol, 27(5), 497– 502 Broides A., Yang W., Conley ME (2006), “Genotype/phenotype correlations in X-linked agammaglobulinemia”, Clin Immunol, 118, 195–200 Burton O.C (1952), “Agammaglobulinemia”, Pediatrics, 9(6): 722-728 10 Conley M.E., Mathias D., Treadaway, J., Minegishi, Y., and Rohrer, J (1998), “Mutations in btk in patients with presumed X-linked agammaglobulinemia”, Am J Hum Genet, 62, 1034–1043 52 11 Conley, V Howard (2002), “Clinical findings leading to the diagnosis of Xlinked agammaglobulinemia”, J Pediatr, 141, 566–571 12 David Vetrie, Igor Vorechovský, Paschalis Sideras et al., (1993), “The Gene Involved in X-linked Agammaglobulinaemia Is a Member of the Src Family of Protein-Tyrosine Kinases” Nature, 361, 226 −233 13 Eduardo Lopez-Granados, Rebeca Perez de Diego, Antonio Ferreira (2005), “A genotype- phenotype correlation study in a group of 54 patients with X-linked Agammaglobulinemia”, Journal Allergy Clinical Immunology, Volume 116, number 14 Edvard Smith, Anna Berglöf (2016), “X-Linked Agammaglobulinemia, Europen Group for Blood and Transplantation (EBMT) European Society for Immunodeficiencies (ESID) 15 Feder E H et al., (1998), “Mutation screening of the BTK Gene in 56 Families with X-linked Agammaglobulinemia (XLA): 47 Unique Mutations without orrelation to Clinical Course”, Pediatrics, 101(2), 276-284 16 Fiorini M, Franceschini R, Soresina A et al., (2004), “BTK: 22 novels and 25 recurrent mutations in European patients with X-linked agammaglobulinemia”, Hum Mutat, 23, 286 17 Fausto Cossu (2010), “Genetics of SCID”, Italian Journal of Pediatrics, 36, 76 18 Futatani T, Miyawaki T, Tsukada S et al., (1998), “Deficient expression of Bruton’s tyrosine kinase in monocytes from X‐linked agammaglobulinemia as evaluated by a flow cytometric analysis and its clinical application to carrier detection” Blood, 91, 595–602 19 Futatani T, Watanabe C, Baba Y, Tsukada S, Ochs HD (2001), “Bruton’s tyrosine kinase is present in normal platelets and its absence identifies patients with X-linked agammaglobulinaemia and carrier females”, British Journal of Haematology, 114, 141±149 53 20 Gathmann B., Goldacker S., Melohradsky Klima, Al Ritterbusch H Et (2013), “The German national registry for primary immunodeficiencies”, Clin Exp Immunol, 173(2), 372–380 21 Gertjan Driessen, Burg Vander (2011), “Educational paper: primary antibody deficiencies”, EurJ Pediatr, 170(6), 693–702 22 Hashimoto S., Tsukada S et al (1996), “Identification of Brutonʹs tyrosine kinase (Btk) gene mutations and characterization of the derived proteins in 35 X‐linked agammaglobulinemia families: a nationwide study of Btk deficiency in Japan”, Blood, 88(2), 561‐573 23 Jouni V aliaho, C.I Edvard Smith, Mauno Vihinen (2006), “BTKbase: The Mutation Database for X-Linked Agammaglobulinemia”, Human Mutation, 27 (12), 1209-1217 24 Kristufek D, Aspalter RM, Eibl MM, Wolf HM (2007), “Characterization of novel Bruton’s tyrosine kinase gene mutations in central European patients with agammaglobulinemia” Mol Immunol, 44, 1639–1643 25 Kwan SP et al (1986), “Mapping of the X-linked Agammaglobulinemia locus by use of restrictive fragment–length polymorphism”, J Clin Invest, 77, 649-52 26 Lindvall J., Kem Blomberg, Al Valiaho J Et (2005), “Bruton’s tyrosine kinase: cell biology, sequence conservation, mutation spectrum, siRNA modifications and expression profiling”, Immunol Rev, 203, 200–215 27 Manning G, Whyte DB, Martinez R (2002), “The protein kinase comple- ment of the human genome”, Science, 298, 1912–1934 28 Mary Ellen Conley, Vanessa Howard (2002), “Clinical findings leading to the diagnosis of X-linked agammaglobulinemia”, The Journal of Pediatrics, Volume 141, number 29 Minegishi Y, Coustan-Smith E Wang YH, Cooper MD, Campana D, Conley ME (1998), “Mutations in the human  5/14.1 gene result in B cell deficiency and agammaglobulinemia”, J Exp Med, 187, 71-77 54 30 Moschese V, Orlandi P, Plebani A et al and in collaboration with the Italian XLA collaborative group (2000), “X-chromosome inactivation and mutation pattern in the Bruton´s tyrosine kinase gene in patients with X-linked agammaglobulinemia”, Mol Med, 6, 104-113 31 Lee PP, Chen TX, Jiang LP et al (2010), “Clinical characteristics and genotype‐ phenotype correlation in 62 patients with X‐linked agammaglobulinemia”, J Clin Immunol, 30, 121–31 32 Lau YL (2011), “PID genetic diagnosis in ASIA”, Cellular & Molecular Immunology,6(6), 397-406 33 Ohta, Y., Haire, R N., Litman, R T., Fu, S M., Nelson, R P., Kratz, J., Kornfeld, S J., de la Morena, M., Good, R A., Litman, G W (1994), “Genomic organization and structure of Bruton agammaglobulinemia tyrosine kinase: localization of mutations associated with varied clinical presentations and course in X chromosome-linked agammaglobulinemia”, Proc Nat Acad Sci, 91, 9062-9066 34 R C Allen, R G Nachtman, H M Rosenblatt, J W Belmont (1994), “Application of carrier testing to genetic counseling for X-linked agammaglobulinemia”, Am J Hum Genet 54(1): 25–35 35 Rebeca BE (1999), “Hematopoietic Stem cell transplantation for the treatment of severe combined Immunodeficiency”, The New England Journal of Medicine, Volume 34, Number 36 Rodríguez MC, Granados EL, Cerdán AF, Casariego GF (2001), “Molecular analysis of Bruton’s tyrosine kinase gene in Spain”, Hum Mutat, 18(1), 84 37 Sanger F, S Nicklen and A R Coulson (1992), “DNA sequencing with chainterminating inhibitors”, Biotechnology, 24(1), pp 104-108 38 Speletas M, Kanariou M, Kanakoudi‐Tsakalidou F, Papadopoulou‐Alataki E, Arvanitidis K, Pardali E, Constantopoulos A, Kartalis G, Vihinen M, Sideras P, Ritis K (2001), “Analysis of Btk mutations in patients with X‐linked agammaglobulinaemia (XLA) and determination of carrier status in normal 55 female relatives: a nationwide study of Btk deficiency in Greece” Scand J Immunol, 54, 321‐327 39 Stiehm ER et al (2004), Immunodeficiency Disorders: General Considerations In: Stiehm ER.Immunologic Diseases in Infant &Children, 5th edition, 40 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001), “Molecular Cloning: A Laboratory manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 41 Tobon G J., Izquierdo J H., Canas C A (2013), “B lymphocytes: development, tolerance, and their role in autoimmunity-focus on systemic lupus erythematosus”, Autoimmune Dis, 827254 42 Tsukada S et al., (1993), “Deficient expression of a B cell cytoplasmic tyrosine kinase in human X-linked agammaglobulinemia”, Cell, 72(2), 79-90 43 Väliaho J., Smith CI., Vihinen M., (2006), “BTKbase: the mutation database for X-linked agammaglobulinemia”, Hum Mutat, 27(12):1209-17 44 Vihinen, M., Iwata, T., Kinnon, C., Kwan, S.-P., Ochs, H D., Vorechovsky, I., Smith (1996), “C I E BTKbase, mutation database for X-linked agammaglobulinemia (XLA)” Nucleic Acids Res, 24, 160-165 45 Vihinen, M., Kwan, S.-P., Lester, T., Ochs, H D., Resnick, I., Valiaho, J., Conley, M E., Smith (1999), “C I E Mutations of the human BTK gene coding for Bruton tyrosine kinase in X-linked agammaglobulinemia”, Hum Mutat, 13, 280-285 46 Volokha TóTh, Pacm Mihas, Al Kondratenkoi Et (2009), “Genetic and demographic features of X-linked agammaglobu‐ linemia in Eastern and Central Europe: a cohort study”, Mol Immunol, 46(10), 2140–2146 47 Vorechovsky, I., Luo, L., Hertz, J M., Froland, S S., Klemola, T., Fiorini, M., Quinti, I., Paganelli, R., Ozsahin, H., Hammarstrom, L., Webster, A D B., Smith, (1997), “Mutation pattern in the Bruton’s tyrosine kinase gene in 26 unrelated patients with X-linked agammaglobulinemia”, Hum Mutat, 9, 418425 56 48 Wang Qi, Erik M Vogan (2015), “Autoinhibition of Bruton’s tyrosine kinase (Btk) and activation by soluble inositol hexakisphosphate”, eLife;4:e06074 49 Wang XC, Wang Y, Kanegane H, Toshio M, Yu YH (2005), “Gene diagnosis of X-linked agammaglobulinemia”, Zhonghua Er Ke Za Zhi, 43(6), 449-52 50 Xia-Fang Chen, Wei-Fan Wang,Yi-Dan Zhang (2016), “Clinical characteristics and genetic profiles of 174 patients with X-linked agammaglobulinemia”, Medicine (Baltimore) 2016 Aug; 95(32): e4544 51 Yel L, Minegishi Y, Coustan-Smith E, Buckley RH, Trubel H, Pachman LM, Kitchingman GR, Campana D, Rohrer J, Conley ME (1998) “Mutations in the m heavy chain gene in patients with agammaglobulinemia” N Engl J Med, 335, 1486-1493 52 Zhang Z-Y, Zao X-D (2010), “Clinical Characteristics and Molecular Analysis of 21 Chinese Children with Congenital Agammaglobulinemia”, Scandinavian Journal of Immunology, 72, 454–459 Trang web:  HGMD hompage http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php  LOVD homepage http://www.lovd.nl/3.0/home  Sequence Variant Nomenclature homepage http://varnomen.hgvs.org 57 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách, kết tách DNA tổng số 31 bệnh nhân XLA Stt Mã số BN 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 XLA-01 XLA-02 XLA-03 XLA-04 XLA-05 XLA-06 XLA-07 XLA-08 XLA-09 XLA-10 XLA-11 XLA-12 XLA-13 XLA-14 XLA-15 XLA-16 XLA-17 XLA-18 XLA-19 XLA-20 XLA-21 XLA-22 XLA-23 XLA-24 XLA-25 XLA-26 XLA-27 XLA-28 XLA-29 XLA-30 XLA-31 Họ tên Nguyễn A Hồ Nam P Phùng Minh H Lê Khải A Hoàng Duy A Nguyễn Tiến Đ Nguyễn Xuân L Đỗ Đại D Đỗ Gia H Đỗ Văn N Nguyễn Hồng H Đƣờng Minh P Đỗ Đình D Nghiêm Xn H Vũ Nguyên K Cao Viết Á Nguyễn Duy H Phạm Văn Đ Lê Việt B Nguyễn Gia B Trình Cơng H Đồn Đình Gia B Vũ Đăng K Vũ Đức P Trần Công H Mai Quang V Mai Xuân P Bùi Văn Q Vũ Văn H Lê Tuấn A Lị Văn T Tuổi Chẩn đốn 2012 2011 2010 2011 2011 2003 2013 2011 2012 2014 2015 2001 2011 2010 2008 2011 2008 2015 2016 2005 2006 2013 2010 2013 2012 2014 2016 2008 2004 2011 2008 XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA XLA 58 Nồng độ DNA (ng/µl) 56 44 66 46 45 65 35 44 48 54 36 48 66 55 38 55 34 42 35 45 46 23 28 75 49 35 33 78 54 56 38 Độ tinh (A260/A280) 1,9 1,8 1,85 1,95 1,8 1,9 1,9 2,0 2,0 1,9 1,8 1,9 1,85 1,95 1,9 1,8 1,9 1,9 1,9 2,0 2,0 2,8 1,9 1,9 2,0 1,9 1,8 2,0 1,9 1,9 2.0 Phụ lục Danh sách, kết tách DNA tổng số 30 ngƣời bình thƣờng Stt Mã số BN Họ tên Tuổi Chẩn đốn Nồng độ DNA (ng/µl) Độ tinh (A260/A280 ) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 BT-01 BT-02 BT-03 BT-04 BT-05 BT-06 BT-07 BT-08 BT-09 BT-10 BT-11 BT-12 BT-13 BT-14 BT-15 BT-16 BT-17 BT-18 BT-19 BT-20 BT-21 BT-22 BT-23 BT-24 BT-25 BT-26 BT-27 BT-28 BT-29 BT-30 Trần Trung K Đỗ Duy C Trƣơng Khánh P Vƣơng Sỹ Vũ B Nguyễn Thọ N Nguyễn Hoàng H Nguyễn Đức M Hoàng Minh T Trần Khắc D Nguyễn Duy T Nguyễn Tấn D Đỗ Đức H Nguyễn Hồng L Hà Quang T Nguyễn Chí T Trần Hoàng Gia B Kiều Gia B Đàm Văn M Trƣơng Khải Đ Trƣơng Quốc Đ Phạm Văn V Trần Tuấn T Lê Văn T Nguyễn Văn N Hồng Đình D Phùng Tuấn A Nguyễn Minh T Lý Phúc H Ân Văn Đ Đinh Thế H 2013 2006 2008 2005 2002 2015 2012 2012 2013 2005 2004 2003 2017 2012 2012 2013 2012 2016 2014 2012 2009 2010 2004 1987 2013 2009 2005 2016 2010 2009 Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng Bình thƣờng 59 56 1,96 1,85 41 1,9 45 29 36 59 44 32 48 46 45 37 43 34 47 42 35 53 56 54 41 38 41 37 28 1,9 1,95 1,9 1,9 2,0 1,8 1,8 1,9 1,8 1,9 1,9 1,8 2,0 1,9 1,9 1,9 1,8 1,8 1,8 1,8 2,0 1,9 2,0 33 78 54 56 1,8 2,0 1,9 1,9 59 Phụ lục Danh sách đôt biến gen 31 bệnh nhân XLA Mã số BN XLA-01 XLA-02 XLA-03 XLA-04 XLA-05 XLA-06 XLA-07 XLA-08 XLA-09 XLA-10 XLA-11 XLA-12 XLA-13 XLA-14 XLA-15 XLA-16 XLA-17 XLA-18 XLA-19 XLA-20 XLA-21 XLA-22 XLA-23 XLA-24 XLA-25 XLA-26 XLA-27 XLA-28 XLA-29 XLA-30 XLA-31 Phân tích gen bệnh nhân c.DNA Protein Dạng đột biến Vị trí c.1735G>C p.D579H Sai nghĩa Exon 17 c.1908+2_11delinsC p.IVS18+2_11delinsC Vị trí cắt, nối Intron 18 c.752G>A p.W251X Vô nghĩa Exon c.117_119del p.Y39Yfs* Dịch khung Exon c.521-1G>A p.IVS6-1G>A Vị trí cắt, nối Intron c.37C>T p.R13X Vô nghĩa Exon c.1876delG p.A582Lfs*5 Dịch khung Exon 17 c.1768A>T p.I590F Sai nghĩa Exon 18 Không tìm thấy đột biến Khơng tìm thấy đột biến c.763C>T R255X Vô nghĩa Exon c.1782delG p.G594Gfs*52 Dịch khung Exon 18 c.1714_1715insTA p.S572Ifs*15 Dịch khung Exon 17 c.1657delA p.S553Afs*3 Dịch khung Exon 17 c.1610delT p.V537Dfs*2 Dịch khung Exon 16 c.1908+2_11delinsC p.IVS18+2_11delinsC Vị trí cắt, nối Intron 18 c.953C>T p.S318F Sai nghĩa Exon 11 c.843G>A p.W281X Vô nghĩa Exon 10 c.1578_1581del p.C527Wfs*2 Dịch khung Exon 16 Khơng tìm thấy đột biến c.1249A>T p.K417X Vơ nghĩa exon 14 c.649+5G>C p.IVS11+5G>C Vị trí cắt, nối Intron 11 c.118T>G p.Y40D Sai nghĩa Exon c.628insA p.P210Tfs*6 Dịch khung Exon c.1651T>A p.Y551N Sai nghĩa Exon 17 Mất đoạn exon 2-5 Mất đoạn Exon 2-5 Mất đoạn exon 2-5 Mất đoạn Exon 2-5 c.862C>T p.R288W Sai nghĩa Exon 10 c.456delT p.Y152Yfs*19 Dịch khung Exon Khơng tìm thấy đột biến c.753G>A p.W251X Vơ nghĩa exon 60 Phụ lục 61 62 63 64 65 ... ĐẦU Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (X- linked agammaglobulinemia – bệnh XLA): bệnh di truyền nhiễm sắc thể giới tính X đột biến gen BTK. .. nhiễm sắc thể giới tính X (XLA) 1.2.1 Định nghĩa bệnh XLA Bệnh suy giảm miễn dịch thể không gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X (X- linked agammaglobulinemia ? ?bệnh XLA) bệnh suy. .. gen BTK gây bệnh Suy giảm miễn dịch bẩm sinh thể khơng có gammaglobulin máu liên kết nhiễm sắc thể giới tính X? ?? Mục tiêu đề tài: - Sử dụng kỹ thuật MLPA giải trình tự gen phát đột biến gen BTK gây