Nghiên cứu xây dựng bộ phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát hiện đột biến gen f8 gây bệnh hemophilia a

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A NGÔ THU HẰNG Thuhangngo15@gmail.com Ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Quang Hịa Chữ ký GVHD TS Dương Quốc Chính Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 10/2020 CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Ngô Thu Hằng Đề tài luận văn: Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: CA190018 Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày… .………… với nội dung sau: Bổ sung danh mục chữ viết tắt Sửa lỗi tả Bổ sung phương pháp hướng điều trị bệnh Hemophilia A Đưa hình ảnh minh họa phân tích kết giải trình tự gen F8 vào phần phụ lục Thêm trích dẫn tài liệu tham khảo Bàn luận kỹ mục tiêu Bổ sung danh sách mẫu bệnh nhân sử dụng số liệu thu thập có xác nhận Viện Huyết học - Truyền máu TW Ngày Giáo viên hướng dẫn tháng năm Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Giáo viên hướng dẫn Ký ghi rõ họ tên LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiêm cứu phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội TS Dương Quốc Chính, trưởng Khoa Di truyền – Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị đồng nghiệp Khoa Di truyền – Sinh học phân tử, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Bệnh Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X, dẫn đến giảm nồng độ hoạt tính yếu tố VIII máu Người mẹ mang gen bệnh có khả truyền bệnh cho 50% trai họ lần sinh Do vậy, thực tế gặp chủ yếu bệnh nhân nam Tỉ lệ mắc Hemophilia A 1: 5000 – 1: 10 000 bé trai [1] Việt Nam nước có tỉ lệ mắc Hemophilia A cao, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 25-60/1 000 000 người Triệu chứng lâm sàng thông thường tượng chảy máu kéo dài khớp cổ tay, cổ chân, chảy máu da, chảy máu nội tạng khó cầm máu Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII (F8) nằm vị trí Xq28 NST giới tính X Gen F8 gen lớn hệ gen người, có kích thước 186 kb, gồm 25 intron 26 exon, mã hóa cho tiền protein 2351 axit amin [2] Theo thống kê đến năm 22/6/2020 CDC, có 3700 đột biến gây bệnh Hemophilia A công bố [3] Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A trải rộng bao gồm: đột biến đảo đoạn intron 22, đảo đoạn intron 1, đột biến điểm, đột biến đoạn, đột biến lặp đoạn… Việc phát xác dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A có ý nghĩa việc lựa chọn phương pháp điều trị việc chẩn đoán trước sinh để ngăn ngừa giảm tình trạng sinh mắc bệnh, hạn chế tỉ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng Do gen F8 gen dài hệ gen người đột biến gen F8 đa dạng phức tạp, vậy, để phát dạng đột biến gen F8 cần phải sử dụng kỹ thuật khác cho dạng đột biến cụ thể Đối với đột biến đảo đoạn, phương pháp sử dụng PCR Để phát đột biến điểm, phương pháp coi chìa khóa vàng sử dụng giải trình tự gen Sanger Bên cạnh đó, phương pháp MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn Vì lí nhu cầu thực tế trên, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A” Mục tiêu nghiên cứu nhằm: (1) phát triển phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử bao gồm: PCR, giải trình tự gen Sanger MLPA để phát đột biến gây bệnh Hemophilia (2) Đánh giá mối tương quan đặc điểm kiểu đột biến mức độ bệnh Nghiên cứu thực 100 mẫu máu ngoại vi bệnh nhân hemophilia A, với xét nghiệm ban đầu phát đột biến đảo đoạn intron 22, âm tính, thực xét nghiệm phát đột biến đảo đoạn intron Nếu mẫu bệnh nhân tiếp tục cho kết âm tính, thực giải trình tự gen Sanger để phát đột biến điểm đột biến đoạn nhỏ Nếu không phát đột biến, sử dụng kỹ thuật MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật bao gồm: quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 phương pháp RT-PCR; xây dựng quy trình giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger Ứng dụng quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật LD-PCR RT-PCR, quy trình phát đột biến đảo đoạn intron kỹ thuật Multiplex-PCR, quy trình phát đột biến điểm giải trình tự gen Sanger, quy trình phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn kỹ thuật MLPA để phát đột biến 100 mẫu bệnh nhân nghiên cứu nhằm đưa mối tương quan đột biến mức độ bệnh đặc điểm đột biến gen F8 Trong 100 bệnh nhân nghiên cứu, có 82 bệnh nhân mức độ nặng gồm 48.78% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4.88% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 1, đột biến điểm chiếm 34,15%, đột biến đoạn chiếm 10,98%, đột biến lặp đoạn lớn chiếm 1.22% Trong 11 bệnh nhân mức độ trung bình, 90.91% bệnh nhân măng đột biến điểm, 9.09% bệnh nhân mang đột biến đoạn nhỏ Còn lại 100% bệnh nhân mức độ nhẹ mang đột biến điểm Nghiên cứu phát 16 đột biến chưa công bố sở liệu EAHAD (Châu Âu) CHAMPS (CDC, Mỹ), phát 14/100 bệnh nhân có xuất kháng thể ức chế yếu tố VIII HỌC VIÊN Ký ghi rõ họ tên MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Hemophilia A 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Lịch sử bệnh Hemophilia A 1.1.3 Dịch tễ học bệnh Hemophilia A 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng phân loại mức độ bệnh 1.1.5 Điều trị 1.2 Cơ sở di truyền yếu tố VIII 1.2.1 Con đường đông máu vai trò yếu tố VIII 1.2.2 Đặc điểm sinh học yếu tố VIII 1.2.3 Cấu trúc gen F8 1.2.4 Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh Hemophilia A 11 1.3.1 Chẩn đoán xác định 11 1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố 13 1.3.3 Chẩn đoán phân biệt 13 1.3.4 Phát đột biến gen F8 kỹ thuật sinh học phân tử 14 1.4 Tình hình nghiên cứu kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A 20 1.2.5 Nghiên cứu Thế giới 20 1.2.6 Nghiên cứu Việt Nam 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng: 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 i 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 Tối ưu quy trình kỹ thuật phát đột biến 44 3.1.1 Tối ưu quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT-PCR 44 3.1.2 Tối ưu quy trình khuếch đại 26 exon gen F8 nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger 46 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng kỹ thuật tinh sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự 49 3.2 Đánh giá hiệu phát đột biến kỹ thuật PCR, giải trình tự gen Sanger MLPA 51 3.2.1 Phát đột biến đảo đoạn intron 22 51 3.2.2 Phát đột biến đảo đoạn intron 51 3.2.3 Phát đột biến phương pháp giải trình tự gen Sanger 52 3.2.4 Phát đột biến sử dụng kỹ thuật MLPA 54 3.2.5 Hiệu phát đột biến phương pháp PCR, Sanger sequencing MLPA 57 3.3 Đánh giá mối tương quan dạng đột biến gen F8 với mức độ bệnh hemophilia A đặc điểm đột biến gen F8 58 3.3.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu (giới tính) 58 3.3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo mức bệnh (Nặng, Trung bình, Nhẹ) 59 3.3.3 Tương quan kiểu đột biến mức độ bệnh 59 3.3.4 Thống kê đột biến chưa công bố sở liệu (EAHAD CHAMP) 61 3.3.5 Phân bố đột biến điểm đoạn nhỏ exon/ intron 62 3.3.6 Tỷ lệ bệnh nhân xuất kháng thể kháng yếu tố VIII loại đột biến 63 ii CHƯƠNG KẾT LUẬN 65 1.1 Kết luận 65 1.2 Hướng phát triển đồ án tương lai 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 70 iii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Các giai đoạn q trình đơng máu Hình 1.2 Sơ đồ đơng máu theo đường nội sinh ngoại sinh Hình 1.3 Cấu trúc gen yếu tố đơng máu FVIII [2][8][12] Hình 1.4 Cấu trúc gen F8A F8B Hình 1.5 Đột biến đảo đoạn intron 22 [2] Hình 1.6 Đột biến đảo đoạn intron [2] 10 Hình 1.7 Sơ đồ di truyền bệnh Hemophilia A 11 Hình 1.8 Phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật Southern Blot 15 Hình 1.9 Sơ đồ vị trí mồi chiều dài sản phẩm LD-PCR 16 Hình 1.10 Sơ đồ vị trí mồi chiều dài sản phẩm phản ứng PCR phát đột biến đảo đoạn intron 17 Hình 1.11 Nguyên lý kĩ thuật I-PCR 18 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 27 Hình 2.2 Phác đồ chẩn đốn phân tử bệnh hemophilia A 28 Hình 2.3 Nguyên lý tinh ExoSap-IT 36 Hình 2.4 Nguyên lý tinh hạt từ 37 Hình 2.5 Cấu trúc ddNTPs gắn huỳnh quang 38 Hình 2.6 Các bước phương pháp MLPA 41 Hình 3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 44 Hình 3.2 Tối ưu số chu kỳ nhiệt 45 Hình 3.3 Giới hạn phát phản ứng RT-PCR 45 Hình 3.4 So sánh kết phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT-PCR (mẫu RNA) kỹ thuật LD-PCR (mẫu DNA) 46 Hình 3.5 Kết sản phẩm khuếch đại 26 exon với điều kiện Bảng 3.1 47 Hình 3.6 Kết phản ứng PCR khuếch đại 26 exon với điều kiện ta=58oC, 35 chu kỳ 48 iv CHƯƠNG KẾT LUẬN 1.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu bước đầu rút số kết luận sau:  Đã xây dựng tối ưu kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A, bao gồm: + Quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT_PCR + Quy trình khuếch đại 26 exon gen F8 nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger + Quy trình tinh sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger Kết phác đồ định phát đột biến gen F8 đạt hiệu chẩn đoán 100% Đồng thời, nghiên cứu phát 16 đột biến chưa công bố sở liệu quốc tế, chủ yếu xuất exon 14  Đánh giá mối tương quan dạng đột biến gen F8 với mức độ bệnh hemophilia A đặc điểm đột biến gen F8, đó: Ở nhóm bệnh nhân mức độ nặng, xuất chủ yếu đột biến đảo đoạn intron 22 (48.78%), đột biến điểm (34.15%) đột biến đoạn (10.98%) Ở nhóm bệnh nhân mức độ trung bình, xuất chủ yếu đột biến điểm (90.91%), đột biến đoạn nhỏ chiếm 9.09% Ở nhóm bệnh nhân mức độ nhẹ, 100% bệnh nhân mang đột biến điểm Trong 100 bệnh nhân nghiên cứu, có 14 bệnh nhân xuất kháng thể kháng yếu tố VIII, chiếm 17.07% bệnh nhân mức độ nặng; đó, bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22 xuất chất ức chế chiếm 50% bệnh nhân xuất chất ức chế 1.2 Hướng phát triển đồ án tương lai Thông qua nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu kiến nghị tiếp tục nghiên cứu với số mẫu lớn để tìm thêm đột biến đánh giá chi tiết vai trị đột biến tình trạng bệnh nguy sinh ức chế yếu tố đông máu 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] De Brasi, C D et al “Genética molecular de la hemofilia A” [Molecular genetics of hemophilia A] Medicina vol 56,5 Pt (1996): 509-17 [2] Graw, Jochen et al “Haemophilia A: from mutation analysis to new therapies.” Nature reviews Genetics vol 6,6 (2005): 488-501 [3] CDC “CHAMP F8 Mutation in the United States” (2020) [4] WFH “Guidelines for the management of hemophilia” (2012) [5] MCKUSICK, V A “THE ROYAL HEMOPHILIA.” Scientific American vol 213 (1965): 88-95 [6] Nguyễn Hoàng Hà, Nguyễn Thị Nữ, Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí “Đặc điểm lâm sàng xét nghiệm người phụ nữ mang gen hemophilia viện Huyết học – truyền máu TW” Y học Việt Nam Tập 423, trang 139-143 [7] Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Anh Trí, Bạch Quốc Khánh “Tình hình chăm sóc hemophilia viện Huyết học – Truyền máu Trung ương” Kỉ yếu Hội nghị khoa học thường niên lần thứ tư, (2015) P66-67 [8] Nguyễn Thị Mai “Nghiên cứu phát bệnh nhân người mang gen bệnh Hemophilia A dựa phân tích phả hệ” Luận án tiến sĩ y học (2018) [9] Nguyễn Anh Trí “Sinh lý q trình đơng máu Đơng máu ứng dụng lâm sàng” Nhà xuất y học, (2000): 40-63 [10] Meyer, D et al “von Willebrand factor: structure and function.” Mayo Clinic proceedings vol 66,5 (1991): 516-23 [11] Samuelson Bannow, Bethany et al “Factor VIII: Long-established role in haemophilia A and emerging evidence beyond haemostasis.” Blood reviews vol 35 (2019): 43-50 [12] Lưu Vũ Dũng “Phát đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia” Luận văn Thạc sỹ (2014) [13] Oldenburg, Johannes et al “Historical review on genetic analysis in hemophilia A.” Seminars in thrombosis and hemostasis vol 40,8 (2014): 895902 66 [14] Nguyễn Ngọc Minh, Đỗ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Băng Sương “Xây dựng quy trình chẩn đốn đột biến gen yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A” Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 17 (2013) Phụ Số [15] Goodeve, Anne C, and Ian R Peake “The molecular basis of hemophilia A: genotype-phenotype relationships and inhibitor development.” Seminars in thrombosis and hemostasis vol 29,1 (2003): 23-30 [16] A Miguel Escobar and S Key Nigel “Hemophilia A and Hemophilia B”, Williams Hematology, Chapter 123, McGrow - Hill Medical, USA, (2016): 2113 – 2132 [17] Ljung, Rolf, and ulf Tedgård “Genetic counseling of hemophilia carriers.” Seminars in thrombosis and hemostasis vol 29,1 (2003): 31-6 [18] Poláková, H et al “Long distance PCR in detection of inversion mutations of F8C gene in hemophilia A patients.” General physiology and biophysics vol 22,2 (2003): 243-53 [19] Liu, Q et al “Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in hemophilia A.” Blood vol 92,4 (1998): 1458-9 [20] Bagnall, Richard D et al “Recurrent inversion breaking intron of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A.” Blood vol 99,1 (2002): 168-74 [21] UKHCDO “Practice guidelines for the molecular diagnosis of Hemophilia A” (2010) [22] MRC-Holland “Product description SALSA MLPA Probemix P178-B4 F8” (2019) [23] Sauna, Zuben E et al “The intron-22-inverted F8 locus permits factor VIII synthesis: explanation for low inhibitor risk and a role for pharmacogenomics.” Blood vol 125,2 (2015): 223-8 [23] MRC-Holland “MLPA General Protocol” (2019) [24] Pruthi, Rajiv K “Hemophilia: a practical approach to genetic testing.” Mayo Clinic proceedings vol 80,11 (2005): 1485-99 67 [25] Pezeshkpoor, B et al “Deep intronic 'mutations' cause hemophilia A: application of next generation sequencing in patients without detectable mutation in F8 cDNA.” Journal of thrombosis and haemostasis : JTH vol 11,9 (2013): 1679-87 [26] de Brasi, C et al “Genetic testing in bleeding disorders.” Haemophilia : the official journal of the World Federation of Hemophilia vol 20 Suppl 4,0 (2014): 54-8 [27] Jayandharan, Giridhara Rao et al “Role of molecular genetics in hemophilia: from diagnosis to therapy.” Seminars in thrombosis and hemostasis vol 38,1 (2012): 64-78 [28] Bowen, D J “Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights.” Molecular pathology: MP vol 55,2 (2002): 127-44 [29] Schwaab, R et al “Haemophilia A: mutation type determines risk of inhibitor formation.” Thrombosis and haemostasis vol 74,6 (1995): 1402-6 [30] Rost, S et al “Detection of large duplications within the factor VIII gene by MLPA.” Journal of thrombosis and haemostasis: JTH vol 6,11 (2008): 1996-9 [31] Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A kỹ thuật microsatellite DNA [32] Lakich, D et al “Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A.” Nature genetics vol 5,3 (1993): 236-41 [33] Rossetti, Liliana Carmen et al “Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR.” Clinical chemistry vol 51,7 (2005): 1154-8 [34] Rossetti, L C et al “Developing a new generation of tests for genotyping hemophilia-causative rearrangements involving int22h and int1h hotspots in the factor VIII gene.” Journal of thrombosis and haemostasis : JTH vol 6,5 (2008): 830-6 [35] Dutta, Debargh et al “Accurate, simple, and inexpensive assays to diagnose F8 gene inversion mutations in hemophilia A patients and carriers.” Blood advances vol 1,3 231-239 14 Dec 2016 68 [36] Wang, Xiong et al “Rapid genotyping of F8 intron 22 inversion by nested PCR based on long-distance PCR.” Journal of thrombosis and thrombolysis vol 49,4 (2020): 591-601 69 PHỤ LỤC A1 Danh sách bệnh nhân thực nghiên cứu Bệnh nhân H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H38 PID 12011282 7006125 11003027 6002163 16003061 15010098 16045614 1920065543 12011158 17006955 10005882 10009130 7002860 6001344 11008880 10008240 13020451 18009412 10003581 16016060 1920007558 6003553 15000766 7005406 17034900 12016390 11009949 2020122945 17028549 17041678 8002040 1920027679 18017314 15039984 1920051439 7006187 12011025 13024886 Họ tên BẾ THÀNH Đ BÙI NGUYỄN D BÙI QUANG K BÙI VĂN T CAO ĐĂNG N ĐẶNG HẢI A ĐẶNG MINH H ĐẶNG VĂN T ĐÀO VĂN K ĐINH BẢO B ĐINH VĂN T ĐỖ MINH Đ ĐỖ QUANG D ĐỖ TRỌNG Đ ĐỖ VĂN Đ ĐOÀN LÊ QUỐC B ĐỒNG HOÀNG A ĐỒNG VĂN T DƯƠNG GIA B DƯƠNG HẢI Đ DƯƠNG MINH K HỒ NGHĨA P NGUYỄN VĂN T HOÀNG TUẤN A ĐỖ VĂN H LÊ VĂN M LÂM QUANG M LÊ ĐỨC H LÊ TRỌNG ĐỨC N LÊ VĂN Ư LÊ VIỆT H LÒ HUY N MAI HỒNG P NGƠ ĐỨC T NGƠ DUY L NGƠ QUANG M NGUYỄN ANH S NGUYỄN CHU UY V 70 Năm sinh 2005 2004 1996 1995 2005 2006 2015 1941 1998 2013 1975 2008 2007 1985 2010 2003 2010 1986 2009 2016 2018 1999 2013 1987 2012 1998 1973 2017 2016 1987 1999 2010 2017 2015 1989 1998 2006 2012 Giới tính Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam H39 H40 H41 H42 H43 H44 H45 H46 H47 H48 H49 H50 H51 H52 H53 H54 H55 H56 H57 H58 H59 H60 H61 H62 H63 H64 H65 H66 H67 H68 H69 H70 H71 H72 H73 H74 H75 H76 H77 H78 H79 H80 H81 H82 12001515 15068921 13008687 17036992 12011499 11007889 16001259 18012983 15008356 13014928 16068459 11001198 8001952 18005520 7005928 13005585 7001983 13005263 16013615 17041174 13006502 10001865 13024402 13026616 13008812 7001919 7005980 11004074 12009151 11003486 9003614 15017115 2020109899 18033515 6002142 16003541 6004000 10009458 10004859 16027366 6000555 7007289 11043605 15017422 NGUYỄN CÔNG M NGUYỄN ĐĂNG K NGUYỄN ĐÌNH H NGUYỄN ĐÌNH T NGUYỄN ĐỨC D NGUYỄN ĐỨC L NGUYỄN ĐỨC T NGUYỄN GIA B NGUYỄN GIA B NGUYỄN HỒNG Đ NGUYỄN HỮU MINH K NGUYỄN HUY K NGUYỄN KHẢ TRỌNG A NGUYỄN KHẮC Q NGUYỄN KHẮC V NGUYỄN L NGUYỄN MẠNH L NGUYỄN NGUYÊN H NGUYỄN NHẬT M NGUYỄN QUANG D NGUYỄN QUANG K NGUYỄN QUANG T NGUYỄN QUỐC T NGUYỄN SỸ K NGUYỄN SỸ T NGUYỄN THÁI B NGUYỄN THÀNH Đ NGUYỄN THANH L NGUYỄN THÀNH N NGUYỄN TIẾN H NGUYỄN TIẾN T NGUYỄN TRỌNG P NGUYỄN TRUNG T NGUYỄN TÙNG D NGUYỄN VĂN H NGUYỄN VĂN K NGUYỄN VĂN L NGUYỄN VĂN TUẤN H NÙNG VĂN T PHẠM ĐÌNH H PHẠM TUẤN A PHẠM VĂN T THÁI TRUNG K THIỀU ĐẠI TH 71 2011 2012 1987 1992 2012 2003 2015 2011 2014 1987 2015 1997 2003 2016 1990 2012 1983 2009 2013 2016 2011 2007 2004 1994 2012 2008 1992 2006 2012 2002 2006 2014 1995 1997 1989 2011 1988 2008 1987 2006 1988 1984 2002 2015 Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam H83 H84 H85 H86 H87 H88 H89 H90 H91 H92 H93 H94 H95 H96 H97 H98 H99 H100 12016522 7006527 16035874 18018925 14001614 6004039 18032004 6004165 17023769 16036494 7000225 15004563 7005904 1920023361 8075085 7006007 15000854 15010203 TRẦN GIA B TRẦN H TRẦN HUY H TRẦN LÂM V TRẦN TUẤN K TRỊNH CAO L TRỊNH MINH T TRỊNH VĂN D VÕ ĐỨC T BÙI TUẤN A LÊ GIA L LÒ VĂN T NGUYỄN BẠCH N NGUYỄN BÍCH Ư NGUYỄN KIÊN Q NGUYỄN TIẾN D PHẠM ĐỨC T TRẦN ĐỨC L 2010 1975 2012 2016 2005 1963 2010 1995 2014 2001 2007 2005 1956 1996 2002 1986 2009 2014 Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam A2 Hình ảnh minh họa mẫu bệnh nhân phát đột biến kỹ thuật giải trình tự gen Sanger - Đột biến sai nghĩa Hình Kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H60 Hình ảnh giải trình tự bệnh nhân H60 cho thấy bệnh nhân có đột biến nucleotide T thành nucleotide C exon 11 gen F8 làm làm thay đổi axit amin Tryptophan (W) thành Arginine (R) vị trí axit amin 532 72 - Đột biến dịch khung đọc (Đột biến chèn nucleotide, đột biến lặp nucleotide, đột biến nucleotide, đột biến đoạn nhỏ) Hình Hình ảnh kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H51 Sau giải trình tự gen Sanger, phát đột biến lặp nucleotide A vị trí c.4825 exon 14, dẫn đến protein yếu tố VIII bị lệch khung dịch mã, gặp phải stop codon sau ba mã hóa dừng trình tổng hợp yếu tố VIII Đột biến tạo nên protein VIII khơng hồn chỉnh gây nên mức độ bệnh hemophilia A mức độ nặng Hình Hình ảnh kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H28 73 Hình Hình ảnh kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H85 Kết giải trình tự gen Sanger cho thấy bệnh nhân H85 mang đột biến bao gồm nucletide C vị trí c.583 đoạn nhỏ gồm nucleotide ACTA vị trí c.585-588 exon gây bệnh hemophilia mức độ nặng Người mang đột biến chưa công bố sở liệu - Đột biến vị trí cắt nối Hình Hình ảnh kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H35 Bệnh nhân H35 sau giải trình tự gen F8, phát đột biến intron 14, đột biến làm thay đổi nucleotide A thành nucleotide G Mặc dù đột biến nằm vùng intron, nhiên gần vị trí cắt nối exon intron nên gây nên tình trạng bệnh hemophilia A mức độ trung bình 74 - Đột biến vơ nghĩa Hình Hình ảnh kết giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H38 Kết giải trình gen F8 kỹ thuật Sanger mẫu bệnh nhân H38 cho thấy bệnh nhân mang đột biến c.6403C>T, p.Arg2135* exon 22 Đây đột biến vô nghĩa thay nucleotide C thành T làm thay đổi ba mã hóa từ CGA thánh TGA (stop codon) dẫn đến dừng tổng hợp yếu tố VIII, gây tình trạng bệnh hemophilia A mức độ nặng 75 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A Tác giả luận văn: Ngơ Thu Hằng Khóa: 2019ACNSH Người hướng dẫn: TS Lê Quang Hịa TS Dương Quốc Chính Từ khóa (Keyword): F8, Hemophilia A, FVIII Nội dung tóm tắt: a) Lý chọn đề tài Bệnh Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X, dẫn đến giảm nồng độ hoạt tính yếu tố VIII máu Người mẹ mang gen bệnh có khả truyền bệnh cho 50% trai họ lần sinh Các dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A trải rộng bao gồm: đột biến đảo đoạn intron 22, đảo đoạn intron 1, đột biến điểm, đột biến đoạn, đột biến lặp đoạn…Việc phát xác dạng đột biến gây bệnh Hemophilia A có ý nghĩa việc lựa chọn phương pháp điều trị việc chẩn đốn trước sinh để ngăn ngừa giảm tình trạng sinh mắc bệnh, hạn chế tỉ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng Để phát dạng đột biến gen cần phải sử dụng kỹ thuật khác cho dạng đột biến cụ thể Đối với đột biến đảo đoạn, phương pháp sử dụng PCR Để phát đột biến điểm, phương pháp coi chìa khóa vàng sử dụng giải trình tự gen Sanger Bên cạnh đó, phương pháp MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn Vì lí nhu cầu thực tế trên, thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử để phát đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A” b) Mục đích nghiên cứu luận văn, đối tượng, phạm vi nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu nhằm: (1) Phát triển phương pháp xét nghiệm sinh học phân tử bao gồm: PCR, giải trình tự gen Sanger 76 MLPA để phát đột biến gây bệnh Hemophilia (2) Đánh giá mối tương quan kiểu đột biến thể bệnh Nghiên cứu thực 100 mẫu máu ngoại vi bệnh nhân hemophilia A, với xét nghiệm ban đầu phát đột biến đảo đoạn intron 22, âm tính, thực xét nghiệm phát đột biến đảo đoạn intron Nếu mẫu bệnh nhân tiếp tục cho kết âm tính, thực giải trình tự gen Sanger để phát đột biến điểm đột biến đoạn nhỏ Nếu không phát đột biến, sử dụng kỹ thuật MLPA để phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn c) Tóm tắt đọng nội dung đóng góp tác giả Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật bao gồm: quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 phương pháp RT-PCR, thực xây dựng quy trình 35 mẫu bệnh nhân người mang gen; xây dựng quy trình giải trình tự gen F8 kỹ thuật Sanger Ứng dụng quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22, đột biến đảo đoạn intron kỹ thuật Multiplex-PCR, quy trình phát đột biến điểm giải trình tự gen Sanger, quy trình phát đột biến đoạn lặp đoạn lớn kỹ thuật MLPA để phát đột biến 100 mẫu bệnh nhân nghiên cứu nhằm đưa mối tương quan đột biến mức độ bệnh đặc điểm đột biến gen F8 Trong 100 bệnh nhân nghiên cứu, có 82 bệnh nhân mức độ nặng gồm 48.78% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22, 4.88% bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 1, đột biến điểm chiếm 34,15%, đột biến đoạn chiếm 10,98%, đột biến lặp đoạn lớn chiếm 1.22% Trong 11 bệnh nhân mức độ trung bình, 90.91% bệnh nhân măng đột biến điểm, 9.09% bệnh nhân mang đột biến đoạn nhỏ Còn lại 100% bệnh nhân mức độ nhẹ mang đột biến điểm Nghiên cứu phát 16 đột biến chưa công bố sở liệu EAHAD (Châu Âu) CHAMPS (CDC, Mỹ), đột biến điểm xuất chủ yếu exon 14, phát 14/100 bệnh nhân có xuất kháng thể ức chế yếu tố VIII - d) Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật Long distance PCR 77 - Kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật Multiplex PCR Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger Kỹ thuật MLPA e) Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu bước đầu rút số kết luận sau:  Xây dựng tối ưu kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Trong đó, - Tối ưu quy trình kỹ thuật: + Quy trình phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật RT_PCR + Quy trình khuếch đại 26 exon gen F8 nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger + Quy trình tinh sản phẩm PCR nhằm mục đích giải trình tự gen Sanger  Đánh giá mối tương quan dạng đột biến gen F8 với mức độ bệnh hemophilia A đặc điểm đột biến gen F8 Trong đó, - Các dạng đột biến phát bao gồm: Trong nhóm bệnh nhân mức độ nặng, đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm 48.78%, đôt biến đảo đoạn intron chiếm 4.88%, đột biến điểm chiếm 34,15%, đột biến đoạn chiếm 10,98%, đột biến lặp đoạn lớn chiếm 1.22% Trong nhóm bệnh nhân mức độ trung bình, đột biến điểm chiếm 90.91%, đột biến đoạn nhỏ chiếm 9.09% Trong nhóm bệnh nhân mức độ nhẹ, 100% bệnh nhân mang đột biến điểm - Có 16 đột biến chưa cơng bố sở liệu EAHAD CHAMPS(CDC), đột biến điểm xảy chủ yếu exon 14 - Trong 100 bệnh nhân nghiên cứu, có 14 bệnh nhân xuất kháng thể kháng yếu tố VIII, chiếm 17.07% bệnh nhân mức độ nặng; đó, 78 bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22 xuất chất ức chế chiếm 50% bệnh nhân xuất chất ức chế - Đưa phác đồ định phát đột biến gen F8 với hiệu chẩn đoán 100% 79 ... CTAGCCTCAAATTACTATAATG CTCAAGCTCCAGTCTAAAGT 347 11 CCCTTGCAACAACAACATGA TGTCCCCTTATAACCTGAAGAAA 362 12 TGCTAGCTCCTACCTGACAACA CAAAGTGATGTCCAGATAATGAATG 298 13 CATGACAATCACAATCCAAAATA TTTGCCCACTAGCTCACATG... GGGAAAAAATGTATCGTCAACAGAGA TTGCCTCAGATACATACAGTGACTGG 777 14d TCCAAGCAGCAGAAACCTATT AGGAGAAAGGGGCCATTACT 595 14e GGATGACACCTCAACCCAGT AGCAACAGAAAGCTCTGCA 667 14f TCCCTACGGAAACTAGCAATG CCAGATGATGACACCAACAA 718... AGATGAAGTGGTTAACTATGC CTGACTATAATGTATTCCCAC 349 16 CAGCATCCATCTTCTGTACCA CCTACGTGCAATAAGAAGCTTT 468 17 AGGTTGGACTGGCATAAAAA CAAATGAGACTTGATCCAGGG 396 18 TGGTGGAGTGGAGAGAAAGAA AAGCAGACAAGCTCCATGCT