pete ta - BỘ GIÂO DỤC VA DAO TAO sf că - a Me e
" 4 - TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HÒ CHÍ MINH a Ee
x XĐY ĐỰNG QUY 1 TRÌNH H DỰA TREN | a0
CÂC KĨ THUẬT SINH HỌC PHĐN TỬ i
NHẰM PHÂT HIỆN VA THEO DOI : |
Trang 2
BỘ GIÂO DỤC VĂ ĐĂO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HOC MO TP HO CHi MINH
BAO CAO TONG KET
ĐỈ TĂI KHOA HỌC VĂ CÔNG NGHỆ CAP TRƯỜNG
XĐY DỰNG QUY TRÌNH DỰA TRÍN
CÂC KĨ THUẬT SINH HOC PHAN TU
Trang 4MỤC LỤC
MỤC LLỤC . s °°e°°++S£2E+9E2E+AErErErtrtrtrkE111001111011100171301111001110E ii
DANH MUC HINH ANH cesssssssssssssssssssssssssesssssssnssssnssesnneeesnnnesnasssenssssins v
n9 :0 (00/3797 +Vii
DANH MỤC CHỮ VIET TẮTT -« s-s<-<° NH1 x151131102121911950000110 900 viii THONG TIN KET QUẢ NGHIÍN CỨU — x (02700 1 PHAN I TONG QUAN TAI LIEU
I BỆNH UNG TH C T CUNG -.-e ô-câ5ee<=esseereeterrerre 3
II Định nghĩa Ă chinh he 3 I2 Nguyín nhđn .- «sen thư 3
II HUMAN PAPILLOMA VIRUS _— ÔỎ 3 11.1 Phđn loại HPV ~ Ô 3-
H2 Humam papilloma virus ở động vật - co nhhrrrrdrerrrrre 5
I3 Sự tiến hóa của HPV - ccctntHrtrrrrrrrrirrirrieririd 5
M.4 Cấu trúc vỏ capsid HPV 5 TLS Cấu trúc bộ gen HPV -ccscrrrererHHưe 5 H.6 Chức năng câc gen của HPYV + cnĩnhhhHhHirrhHrrirrerrrriire 6 H.7 Chu trình sống của virus . cccccteeierrerrrrrrreirirrrre 8
II7.1 Tấn công — x4m nhiĩm vao bidu M6 oes essessseesseeesteesneesneeeeeennneen 8
11.7.2 Virus hoạt động trong tí băo chủ ‹ - che 9
H.7.3 Sự sinh sản virus trong tí băo chủ «em 9
IL7.4 Diễn tiến hình thănh khối u âc tính . -+ccsecstererrerrrre 9 II TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CỎ TỬ CUNG . -° 13
TIL Tình hình trín thế giới -:-5-55+vcterterrerttrrrrrrtrtrrrirrriririie 13
086i 0n Văi 1 14
Trang 5IV 1 Chẩn đoân lđm săng . .¿ + 52ttrĩtthrrtettitrrrrrrrrrrrriirie 15
IV.2 Câc phương phâp chđn đoân ở phòng thì nghiệm . 15
IV.2 1 Xĩt nghiệm tế băo học -cccscttrrerrrrirrririirrrrrrrie 15 IV.2.2 Xĩt nghiệm tim HPV DNA ăo 17
IV.2 3 HPV DNA Hybrid Capture (H2 test) . ‹ - sen ae 7
V PHUONG PHAP PCR VA UNG DUNG TRONG |
CHẮN ĐOÂN BỆNH UNG THƯ CỎ TỬ CƯNG . -c-ssescseseerereee 17 V.1 Nguyín tắc phương phâp PCR . - " 17 V.2 Câc thănh phần trong phản ứng PCR 5:-55ccccserterrreriirrrrrree 18
V.3 Phương phap Reverse transcriptase — PCR .csecsesseserseeseetsterteteeneesenees 20
V.4 Phương phâp Real tìme PCR ¬ 20
V.4.1 Nguyín tc ìì cniienrirrririiriirerrirrrrrirrrrrdrrirrrrrrriniiirriiml 20
V.4.2 Câc thuật ngữ trong phương phâp Realtime PCR . 21
V.4.3 Câc loại mẫu dò (probe) trong phương phâp Realtime-PCR 21 V.5 Kỹ thuật Realtime PCR va RT- PCR trong chđn đoân ung thư 26
PHẢN II VẬT LIỆU VĂ PHƯƠNG PHÂP
I VẬT LIỆU - THIẾT BỊ -ss-seesesersesresrrteree s1 tsstssee 27
LL Vật liệu — hoâ chất cscccctihertrretrirrtrriiirrrriiiiirrerrriee 27
` Vat H@u Sinh HOC 27
1.1.2 Hod chat tach chiĩt RNA vccccccccsssessessessestecesesensenesssneatssssecsseseenseneess 27 11.3 Hoâ chất trong một phản ứng PCR -ccccccccsexieriee 27
1.1.4 Hoâ chất dùng cho điện di trín thạch agarose vă thang DNA 28
I2 Dụng cụ - Thiết bị e¿ "¬ 28
II PHƯƠNG PHÂP sossnvsssscnssennnnnossecsesensnnanasesecs 29
II.1 Phương phâp thiết kế mồi -555222tretrtrrttrrrrttrrrtrirrrrrriee 29 II1.1 Câc phần mềm sử dụng . :-55¿©cscsxerrrerrrrtrirerirrrrrrrie 29 11.1.2 Phương phâp tiến hănh -ccxrrserrrrrriietrrtrrierrrriee 30 I2 Phương phâp tâch chiết RNA -cccccsertrrtrrterrrrrtrrrrririe 30 IL2.1 Nguyín tắc eeceerrrerrerrrrree _ tr 30
Trang 6
11.2.2 e0 ốc ng ảẶỪš⁄:: 3]
I.3 Phương phâp Real time RT-PCR - ccỉhheHhrrrmrrrrre 32 II3.I Nguyín tắc " 32 11.3.2 Câch tiến hănh phản ứng Real time RT - PCR - 32
PHAN III: KET QUA VA THAO LUAN | | I THIET KE HE HE PRIMER - PROBE CHO GEN E6 VĂ E7 33
Ll Thiĩt kĩ hĩ mĩi-mau do trĩn gen E6, E7 cho HPV type l6 - 33
[2 Đânh giâ hệ mỗi-mẫu dò trín gen E6, E7 cho HPV type lồ_ 33
I3 Thiết kế hệ mỗi-mẫu dò trín gen E6, E7 cho HPV type I8 35
I4 Đânh giâ hệ mỗi-mẫu dò trín gen E6, E7 cho HPV type l8 36
II KET QUA THIET KE CHUONG TRÌNH REALTIME RT PCR 37
II.1 Xđy dựng quy trình Realtime RT-PCR -cccceetrrrrrrrer 38 IL1.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của hệ mỗi-mẫu dò của gen E6, E7 HPV type 16, fype l8 -eeerrerrrrrrrrrrrrrre 38 II.1.2 Kết quả tâch chiết RNA -ccccsrrerrrrrtrrtrrritrrrrrrirrrrrrie 39 IL1.3 Khảo sât độ nhạy của hệ mỗồi-mẫu dò -c-ccccecsereertereerrrree 42 ' ILI.4 Khảo sât nhiệt độ lai của hệ mỗồi-mẫu dò -ccsctserserrree 44 IIL2 Kết quả ứng dụng quy trình trín mẫu bệnh phẩm . - 47 PHẢN IV KẾT LUẬN & ĐỈ NGHỊ
I KẾT LUẬN e eeeeeseeesersersttrsttrrrtieerrrriierireirriie 50
II ĐỈ NGHỊ eeeeessrsesrrserseertrrrerrierirrriirree 50
PHAN V: SAN PHAM KHOA HOC VA DAO TAO .-eseeseeseseeee 51 TĂI LIỆU THAM KHẢO -csc©cssseerxstetrteetrerreriirrriiriirriirn 52
71000000077 11 g11Ầ ` 55
Trang 7
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang Hình 1 : Sự hình thănh ung thir CỔ (Ữ' CHH că cee<Ăseeeesesrsrsrsesesesrrrerereee ty 0n 109998568198 3
Hình 2: Virus HPV tppe l6 e es-eeeereeeetreertrtreriierriirtrrirrriiiirirrirriiiririirie 4
Hình 3: Cầu trúc bộ gen HPV tppe l6 - -«eeeeeereereereetrerrrr Seeee.Ổ
Hình 4: Chức năng câc gen của HPỨ eeeeeeeseseseseesesetrtrtrsrsrinsrsrerrrse 7 Hình 5: Quâ trình xđm nhiễm văo tế băo chủ vă gđy bệnh của HPV -.-.«-«« 10
Hình 6: Quâ trình tiến triển hình thănh khỗi u do protein E6 vă E7 . «««eeee= Il
Hinh 7: Ban dĩ biĩu diĩn phan bố tỷ lệ bị ung thư CTC trín thế giới .«-«eeses 14 Hình 8: Cỗ tử cung có thương 7 PEEEEEE 11 16 Hinh 9: Phuong phap xĩt nghiệm tẾ băo CỔ fÍ' CHHẸ -.-c<c<esesesesssssseereestsesrrrrrrn 16 Hình 10: Sơ đồ tóm tắt phương phâp Readltime PCR ` ăo 21 Hình 11: Nguyín tắc hoạt động của Molecular DeqCOHH .«eee««eeeeeeeeeseeeeeeeeseetttrttrereree 22 Hình 12: Nguyín tắc hoạt động của SyBr GT€€H ««eseeeseiesirrerrresrrrrrrse ven 23 Hình 13: Nguyín tắc hoạt động của Hybridisation prole «.-««eeeeeeeeereeersererrterrrre 24
Hình 14: Nguyín tắc hoạt động của TaqimaH prÓ€ ‹.e«eeeceeeceseeneeeerseeeirtersrrrtrrerrere 25
""“ ẽ.ẽ na Ó, 28
Hình 16: Chương trình luđn nhiệt của phđn ting Rea time RT PCR «s<5=« 32
Hình 17: Kết quả đânh giâ mỗi vă mẫu dò trín gen HPV type I6 bằng Annhiyb 34 Hình 18: Kết quả đânh giâ mỗi vă mau do trĩn gen HPV type 18 bằng Annhyb 37
Hình 19: Chu trình luđn nhiệt của phản ứng ĐĨ «e-eeeeeeseeseersrrtrrtrrrrnrrrree 37 Hình 20: Chu trình luđn nhiệt của phản ứng Real time PC «« «=seeeeeeeeesee 38
Hình 21: Kết quả khảo sât độ đặc higu ctta chic mdi va MAU AD sss 38
Hinh 22: Kĩt qua kiĩm tra quy trinh tach chiĩt RNA
Trang 8Hình 24: Kẵ quả Real - thue PCR trín mẫu bệnh phẩm C
sau khi xử lý với DINAS€ Ï .ececeseseeeeessseeineieniiiei1010010001101000100 Hình 25a Kết quả khảo sât độ nhạy của mỗi vă mẫu dò
trín gen E6 vă E7 của HP lố «.eeeeeesesseesesseseteeserersesiriierersnee
Hình 25b Kết quả khảo sât độ nhạy của môi vă mẫu dò | trín gen E6 vă E7 của HPV l8 .- «-«esseseesersersersere sesssesecenenensaseeoes -
Hình 26: Kết quả khảo sât nhiệt độ lai của hệ môi vă mẫu dò
trín gen E6 HPV (ype ÏTỐ «-<eessesseseesessesissesersessee 99198818310100181010100104001080058
Hình 27: Kết quả khảo sât nhiệt độ lai của hệ mồi va mau do
trín gen E7 HPV {ype ÏỐ «-««-<==eeseseeeeeesrstsesirsrsessesieiriii100111011101011
Hình 28: Kết quả khảo sât nhiệt độ lai của hệ mỗi vă mẫu dò
trín gen E6 HPV type Ïổ «seeeseesseeseresetsessee H0000131100100100010000010000104
Hình 29: Kết quả khảo sât nhiệt độ lai của hệ mỗi vă mẫu dò
trín gen E7 HP (p€ TỔ o-«=°<ss se sShseEsteirsesissssiseriseeiei01010101510 Hình 30a Kết quả xâc định kiểu gen |
bang PCR reverse dot blot trín mđu bệnh phẩm SỐ Ì «ce«eeeeesesenenseeeeesre Hình 30a Kết quả xâc định kiểm gen
- bằng PCR reverse dot blot trín mđu bệnh phẩm số Õ .- —
Trang 9
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1 : Một số type HPV ở động vậi «-«eeeceeesseeeeerieirrrrririiiiiiiirste 5
Bang 2: Tỷ lệ nhiễm HPV ở những độ tuổi khúc nhau L9 980 00094 00 60015088000006009099998 13
Bảng 3: Trình tự của hệ mỗi vă mẫu dò trín gen E6 của HPV type l6 33
Bảng 4: Trình tự của hệ môi vă mẫu dò trín gen E7 của HPV type lố ««- 33
Bang 5: Trinh tw của hệ mồi vă mẫu dò trín gen E6 của HPV type Tồ -« 36
Bảng 6: Trình tự của hệ môi vă mẫu dò trín gen E7 của HPV type lồ 36
Bang 7: Kết quả chay Real - time PCR trĩn 5 mẫu dương tÍHÌ -«-«eeesesesssses 39 Bang 8: Kết quả xử lý mẫu C với ensyme DÌNase Ï - T01 01905896009 9 9805005560 41
Bảng 9 Kết quả khảo sât bằng câc phương phâp tế băo học
vă sinh học phđn tử trín 10 mẫu bệnh phẩm điín Ninh sree 47 Bảng10: Kết quả khảo sât bằng câc phương phâp
sinh học phđn tử trín 28 mđu bệnh pHẨHH ««ceeeeeneeenreesrerrreiiiisesrsrere 46
Trang 10
+71r+cree+?+e%e%+%+%Â â â *s - e+ ⁄ỐỔ ẴẲỒ OU ẴẲÔỒ Hh—UCU HH Hh Hh HUH + - ¢ APC BLAST cDNA CIN CMV Ct CTC DDBJ DEPC DMSO DNA dNTPs EDTA EMBL EPI FDA FRET HBV HC2 HCV HPV HR HSIL Htert IARC LCR
DANH MUC CHU VIET TAT
Antigen —presenting cell
Basic Local Alignment Search Tool base pair | complementary DNA cervical intraepithelia neoplasia Cytomegalovirus Cycle Ti hreshold Cổ tử cung DNA Data Bank of Japan Diethylpyrocarbonate dimethylsulfoxide deoxyribonucleic acid deoxynucleotide triphosphates early ethylenediaminetetraacetic acid European Molecular Biology Labolatories -episome
The US Food and Drug Adminitration Fluorescent Resonance Energy Transfer Hepatitis B virus Hybrid capture 2 Hepatitis C virus Human papilloma virus high risk
high squamous intraepithelial lession Human Telomerase Reverse Transcriptase International Agency for research on cancer
late
Long control region
Trang 11- Ị- - ee ẴẲƠ ẴẲỞƠ ẴẲẴ ẴẲẨ€ ©Ẳ©ƠỒ âễ* HH FH FT FTF HF FH - Â LR LSIL MHC MRNA MTB NASBA NCBI Nu ORF Low risk
Low squamous intraepithelial lession Major histocompatility complex |
Messenger ribonucleic acid Mycobacterium tuberculosis
The nucleic acid sequence base amplification National Center for Biotechnology Information Nucleotide |
Open reading frame Pap’smear Papanicolaou smear PCR RDB RNA RT RT-PCR TAE TE URR WHO
Polymerase chain reaction Reverse dot blot
ribonucleic acid
reverse transciptase
Reverse transcription Polymerase chain reaction Tris acetate EDTA
Tris EDTA
Upper regulatory region World Health Organization
Trang 12
BỘ GIÂO DỤC VĂ ĐĂO TẠO CỘNG HOĂ XÊ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
THONG TIN KET QUA NGHIEN CUU
1 Thong tin chung:
- Tín đề tăi: XĐY DỰNG QUY TRÌNH DỰA TRÍN CÂC KĨ THUẬT SINH HỌC PHAN TU NHAM PHAT HIEN VA THEO DOI SU BIEU HIEN mRNA CUA CAC
GENE E6 & E7 HUMAN PAPILLOMA VIRUS - Mê số:
- Chủ nhiệm: ThS.Trương Kim Phượng
- Đơn vị của chủ nhiệm đề tăi: Khoa Công nghệ Sinh học Trường ĐH Mở TP.HCM - Thời gian thực hiện: 12 thâng
2 Mục tiíu:
Xđy dựng quy trình trín câc kĩ thuật sinh học phđn tử nhằm tiín liệu sự biĩu hiĩn MRNA của câc gene E6 & E7 phục vụ cho mục đích chđn đoân phât hiện vă theo dõi tiễn trình gắn chỉn vă biểu hiện của hai oncogene năy ở câc bệnh nhđn nhiễm HPV vă diễn tiến ung thư cổ tử cung
3 Tính mới vă sâng tạo:
Đề tăi lă những bước đầu tạo cơ sở cho việc xđy dựng bộ kít với mục đích tiín lượng vă theo dõi sự tiến triển ung thư cổ tử cung dựa trín sự biểu hiện của câc mRNA của câc
gene E6, E7
4 Kết quả nghiín cứu:
Bước đầu chúng tôi đê thănh công trong việc xđy dựng quy trình phât hiện vă định lượng sự biểu hiện của mRNA E6, E7 có trong mẫu bệnh phẩm (đê có kết quả dương tính với Pap’smear) bằng ky thuat Realtime RT PCR Hĩ mỗi-mẫu dò đặc hiệu cho gen E6 vă E7
của hai chủng HPV type 16, 18 cho san phẩm khuếch đại lă 81 bp đối với gen E6 - HPV
type 16; 91 bp đối với gen E7 type 16; 150 bp đối với gen E6 type 18 vă 105 bp đối với gen E7 type 18 Quy trình được thử nghiệm trín hai lô bệnh phẩm được xâc định có nhiĩm HPV type 16 hoac type 18 Kết quả ghi nhận được có sự gan chĩn oncogene E6, E7 của HPV type 16, 18 trín bộ gen người Bín cạnh đó, số lượng bản sao mRNA E6 vă E7 của hai type 16, 18 dao động trong khoảng từ 102-— 107, cho thấy khả năng bệnh nhđn đang bị ung thư hoặc tế băo đang bị tốn thương ở mức độ cao lă rất lớn
Trang 13Tai quy trình phât hiện vă định lượng sự biểu hiện của mRNA E6, E7 có trong mẫu bệnh
hđm của HPV type 16 va 18
Trang 14INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1 General information:
Project title: ESTABLISHMENT ASSAY BASED ON MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN ORDER TO QUANTITATIVE DETECTION mRNA E6/E7 ONCOGENE HUMAN PAPILLOMA VIRUS
Code number: |
Coordinator: TRUONG KIM PHUONG
Implementing institution: Department Biology Technology- Open University, Ho Chi Minh City
Duration: from to
2 Objective(s):
We aimed to establishment the assay based on molecular biology techniques in order to foresee the expression of \mRNA E6 & E7 oncogene for diagnostic, detection and monitoring the process of inserting and expressing E6 & E7 oncogene for HPV- infected patients and and progression of cervical cancer
3 Creativeness and innovativeness:
The present study is the initial research base of developing cervical cancer test kit - 4, Research results:
We achieved inital success for developing the assay based on Real time —PCR techniques on in order to quantitative dectection of expressing mRNA E6, E7 from Pap smear positive samples Single amplicons are 81bp from E6 gene of HPV type 16, 91 bp from E7 gene of HPV type 16; 150 bp from E6 gene of HPV type 18 and 105 bp from E6 gene of HPV type 18 The assay was tested on two lot of Pap smear positive sample The result was recorded the insertion of E6, E7 oncogene HPV type 16, 18 into the human genome In other hand, mRNA E6 & E7 oncogene copy number fluctuated between 102 and 107 which showed the high possibility of cervical cancer in these patients or cells were badly injured |
5 Products:
Two quantitative dectective protocols for expressing mRNA E6, E7 from Pap smear positive samples
6 Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
In the present study, two Realtime — PCR protocols have to tested on a large quantity of clinical sample, we possible to use the assay for the purpose of early detection the risk of cervical cancer
Trang 15
The Realtime PCR protocols may be assigned to companies such as Viet A commercial, | manufactoring and services company that supply the laboratory of hospitals, health centers with molecular kits for diagnosing dangerous diseases such as cervical cancer
Trang 16
MO DAU
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ung thư cổ tử cung lă căn bệnh nguy hiểm,
có thể gđy tử vong đứng hăng thứ hai đối với phụ nữ trín toăn thế giới Đđy lă dạng ung thư nếu được phât hiện sớm, kịp thời sẽ có thể được điều trị khỏi bệnh Ở Việt
Nam, tỷ lệ câc trường hợp mắc bệnh ung thư cổ tử cung lă lă 20.3 trín 100.000 phụ
nữ
Một trong những nguyín nhđn chính gđy ra bệnh ung thư cổ tử cung lă Human papilloma virus (HPV) Virus HPV được phđn thănh hai nhóm chính lă nhóm nguy cơ cao vă nhóm nguy cơ thấp Trong câc type nguy cơ cao, HPV type l6 vă l§ lă câc
type được đânh giâ lă nguy hiểm nhất, có sự liín quan chặt chẽ với câc diễn tiến bệnh
ung thư cổ tử cung ở câc bệnh nhđn khi bị nhiễm HPV
Trong những trường hợp tốn thương thông thường, virus HPV ở dạng vòng vă không gắn chỉn văo bộ gen tế băo chủ Ngược lại, ở những trường hợp khối u âc tính,
có sự gắn chỉn câc đoạn gen virus HPV văo bộ gene người Câc đoạn gen của HPV
luôn giữ lại vùng mê hóa vă điều hòa câc gen Eó, E7 Hai oncogene năy mê hóa cho hai protein liín kết với câc protein p53, pRb dẫn đến ảnh hưởng sự điều hòa chu trình phđn bao apoptosis
Vì vậy, việc theo dõi tiến trình gắn chỉn hai ‘oncogene E6 vă E7 văo bộ gen
người được xem lă một dạng công cụ hữu ích giúp tiín đoân khả năng tiễn triển ung
thư Điều năy có ý nghĩa hỗ trợ cho câc bâc sĩ trong việc chẩn đoân sớm, kịp thời đi vă can thiệp, có câc phương phâp trị liệu phù hợp giúp kĩo dăi đời sống, vă tăng khả năng phục hồi hoăn toăn đối với những bệnh nhđn bị bệnh ung thư cô tử cung Do đó, chúng tôi tiến hănh nghiín cứu để tăi: “Xđy dựng quy trình dựa trín câc kỹ thuật
sinh học phđn tử nhằm phât hiện vă theo dõi sự biểu hiện mRNA của câc gen E6 vă E7 Human papilloma virus”
1 Mục tiíu nghiín cứu:
Mục tiíu đề tăi nghiín cứu nhằm tập trung xđy dựng quy trình Realtime RT -
PCR dĩ theo đõi sự biểu hiện hai oncogene E6, E7 ở mức mRNA đối với câc bệnh
nhđn nhiễm HPV va diễn tiến bệnh ung thư cô tử cung
2 Phạm vi nghiín cứu:
- Thiết kế hệ mỗi vă mẫu dò cho hai oncogene E6, E7 của type HPV l6 vă
type 18
- Khảo sât độ đặc hiệu vă câc thông số của câc hệ mỗi vă mẫu dò trín mây
tính: chiều đăi, thănh phần nucleotide, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp - - Xđy dựng quy trình Realtime RT- PCR
Trang 17Đề tăi được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phđn tử ~ Trường Đại học
Trang 18PHAN I TONG QUAN TAI LIEU I BENH UNG THU CO TU CUNG
I1 Định nghĩa
Cổ tử cung lă vùng hẹp nằm bín dưới tử cung vă bín trín đm đạo Bao gồm cổ
ngoăi vă cỗ trong Bệnh ung thư cô tử cung (CTC) lă dạng bệnh hình thănh khối u âc tính tại cổ tử cung, xuất phât từ câc tế băo biểu mô lât tầng không hóa sừng (tế bao gai) ở vùng chuyển tiếp giữa biểu mô lât ở vùng cổ ngoăi vă biểu mô trụ tuyến ở cổ trong [23] Giai đoạn 3
i Sự hình thănh tế băo bất thường tiín triển ung thư cô tử cung
Hình 1 : Sự hình thănh ung thi cô tử cung [32]
Ghi chú: Giai đoạn 1 -Giai đoạn sớm ; Giai đoạn 2 -Giai đoạn giữa ; Giai đoạn 3 — Giai đoạn muỘn
I2 Nguyín nhđn
Đa số câc trường hợp bệnh ung thư cổ tử cung đều do Human papilloma virus (HPV) gđy ra Đâng chú ý lă thuốc lă, rượu lăm tăng tý lệ nhiễm HPV qua đường miệng Những nguyín nhđn khâc gđy ra bệnh ung thư năy chưa được xâc định rõ.[ 23, 24, 32,36, 37]
Il HUMAN PAPILLOMA VIRUS II.1 Phđn loại HPV [2, 20, 30]
Human papilloma virus thuộc họ Papillomaviridae, gồm những Virus không có vỏ bao, cấu trúc capsid đa diện HPV có bộ gene lă chuỗi DNA xoắn kĩp, tồn tại ở
Trang 19
Hinh 2: Virus HPV type 16 [3636]
Virus HPV được phđn loại dựa văo khả năng gđy ung thư, hiện nay có hơn 100 type HPV gồm những type không có triệu chứng bệnh ở người, những type gđy ra những căn bệnh ung thư HPV được xếp văo câc nhóm như sau:
- Nhóm type nguy cơ cao (high — risk typ€): gồm câc type 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 50, 53, 55, 56, 59, 64, 66, 68, 73, 82 Cac type nay có khả năng gđy ung thư
cao, thường liín quan đến loan san va ung thu CTC.[8, 10, 14, 30]
Nam 1976, Harald zur Hausen đê đưa ra giả thuyết virus HPV lă tâc nhđn chủ yếu gđy ra bệnh CTC Năm 1983 đến 1984, zur Hausen vă câc cộng sự đê tìm thấy HPV type 16 vă 18 trong câc bệnh nhđn ung thư cô tử cung.[24]
: Nhóm type nguy cơ cao có thế dẫn đến sự loạn sản, hình thănh khối u ở cỗ tử
cung (cervical intraepithelia neoplasia- CIN); khối u ở đm hộ (vulva intraepithelia
neoplasia- VIN) [24]
- Nhóm type nguy cơ thấp (low — risk type): gồm câc type 6, 11, 26, 42, 44, 54,
70, 73, it có khả năng gđy ung thư, chỉ gđy ra câc mụn cóc vùng sinh dục, hoặc câc bat thường tế băo CTC, hoặc có thể không biểu hiện triệu chứng bệnh trong kết quả lđm
săng [14, 24]
- Type nguy co trung gian (intermediate — risk): gồm câc type 51, 52 thường lă
câc type ôn hòa hoặc gđy ra câc dạng tế băo bất thường, ít xảy ra ung thư [14, 24] Trong câc type nguy cơ cao, HPV type 16 va HPV type 18 1a hai type co liĩn
quan cao nhất đến câc bệnh ung thư (khoảng 70% trường hợp mắc bệnh) [14]
Trang 20II2 Human papilloma virus ở động vật
Nhiều type HPV thích ứng cao đối với cơ thể câc loăi động vật như thỏ, chuột, vă bò [30] - Bảng I : Một số type HPV ở động vật
Type HPV Vat chu Bĩnh Cottonail rabbit papilloma virus (CRPV) "Thỏ Tạo bướu, mụn cóc
Bovine papillomavirus (BPV) type 1 Bo Tạo xơ cứng da, hình thănh
khối u
I3 Sự tiến hóa của HPV: [3030]
Sự tiến hóa của papilloma virus chậm hơn so với câc loại virus khâc Nguyín
nhđn có thể lă do bộ gen của chúng lă DNA mạch đôi được sao chĩp chính xâc bằng
bộ mây sao chĩp thông tin di truyền của tế băo chủ Điều năy cho thấy chúng có sự tương tâc lđu đăi trong nhiều năm với tế băo chủ Type HPV 16 có khả năng lan truyền nhiều vùng trín thế giới dựa văo sự xđm nhiễm lđu dăi văo những người di cư
I4 Cấu trúc vô capsid HPV
Virus HPV lă nhóm virus không có măng bao, có vỏ capsid đa diện với kích thước 60nm, bao gồm khoảng 72 capsomer hình ngôi sao được cầu tạo bởi protein L1 Giống với những nhóm virus không có măng bao khâc, vỏ capsid của HPV ở
dạng hình khối đa diện, gồm 20 mặt cắt đối xứng [30]
Vỏ capsid có một loại protein khâc chiếm tỷ lệ ít lă protein L2 Hiện nay cơ chế gắn L2 văo cđu trúc virus hoăn chỉnh (virion) chưa được rõ, tuy nhiín protein L2 có vai trò quan trọng như giúp đóng gói bộ gen văo vỏ capside vă giúp virus tấn công, xđm nhiễm văo tế băo chủ mới Protein L2 lă protein đích mở ra hướng nghiín cứu sản xuất vacxin HPV.[30]
H5 Cấu trúc bộ gene HPVY [14, 20, 30]
Bộ gen HPV thường ở dạng vòng mạch đôi, kích thước khoảng 8000 cặp base, được phđn ra thănh 3 vùng gen:
s* Vùng gen sớm (E): 6 gene E1 đến E7; mê hóa protein * Vùng gen muộn (L): gene L1 vă L2; mê hóa protein
Vung diĩu hoa (upper regulatory region - URR) va (Long control region - LCR):
không có nhiệm vụ mê hóa thông tin di truyền, lă những vị trí để câc chất kích hoạt
Trang 21hoặc ức chế gắn văo điều hòa sự phiín mê, đóng vai trò cho virus HPV type 41 xac
định đúng tế băo chủ
Vùng tín hiệu 2 Vùng kiểm soât LCR Poly A Tin higu TATA
Ving tin hiĩu 1 Poly A
Hình 3: Cấu trúc bộ gen HPV type 16 [30]
IL6 Chức năng câc gen của HPV [14, 24, 30]
4 Gen E1:
Mê hóa cho protein gắn văo vị trí khởi đầu sao chĩp DNA bộ gen virus trong vùng kiểm soât LCR (long control region) Protein El đóng vai trò lă ATPase vă có
hoạt tính helicase thảo xoắn mạch đôi DNA, chuẩn bị cho sự sao chĩp DNA bộ gen virus bằng câc nhđn tố sao chĩp của tế băo chủ [14, 20, 30]
s* Gen E2:
Mê hóa cho 1 loại protein đóng vai trò điều hòa sự phiín mê RNA của virus
Protein E2 gắn văo câc promoter trong ving LCR, uc chế sự phiín mê vùng gen sớm
[14]
Đồng thời protein E2 giúp cho protein El gắn dễ dăng văo vùng khởi đầu sao
chĩp Protein E2 sử dụng protein Bromodomain -4 để chỉn bộ gen virus văo bộ gen
tế băo chủ [14, 20, 30]
Trong những trường hợp bộ mây di truyền bị thay đổi như DNA virus chỉn văo bộ gen người, gen E2 bị bất hoạt dẫn đến biểu hiện hai oncogene E6, E7, kết quả lă
Trang 22‘Bat tir tĩ bao Kich hoat promoter Hiinh 4: Chitc nang câc gen của HPV [22] s%Gen E3: Gen năy có ở văi loăi papillomavirus; Gen năy chưa được biết rỡ chức năng vă protein mê hóa.[30] s Gen E4;
Gen năy được biểu hiện ở mức rất thấp ở giai đoạn sớm; gen năy biểu hiện chủ
yíu ở giai đoạn muộn khi virus được “đóng gói hoăn chỉnh” thănh virion Protein E4 - có nhiệm vụ quan trọng trọng giai đoạn trưởng thănh -sinh sản của virus; gđy ra sự phâ vỡ mạng lưới vi ống trong tế băo chất trong câc tế băo gai của con người — tương ứng với giai đoạn giải phóng virus ra khỏi tế băo bị nhiễm [14, 30]
“* Gen E5:
Nằm trong khung doc mĩ (open reading frame -ORF), nhung dĩi khi gen nay bi mat di trong câc tế băo ung thư cổ tử cung, do có thể nó không có vai trò trong quâ
trình biến đổi tế băo bị nhiễm virus thănh tế băo âc tính Gen E5 biểu hiện tương tâc
với những protein vận chuyển măng như thụ quan của nhđn tố sinh sản biíu bì, nhđn tố § — dẫn xuất của tiíu cầu, nhđn tố kích thích sự phât triển khối tế băo Có công trình nghiín cứu nhận thấy ở virus HPV type 16 có protein E5 có khả năng yếu trong quâ trình tạo khối u Protein E5 HPV type 16 vă HPV type 2 có vai trò điều hòa lăm giảm sự biểu hiện phức phức hợp protein MHC lớp I của tế băo chủ nhằm ngăn
cản tế băo T tiíu diệt tế băo bị nhiễm virus [14, 30]
% Gen E6 vă E7 [9, 14, 24 ,30]
Câc khung đọc mở của gen E6 vă E7 có câc vai trò mê hóa cho những
oncoprotein điều khiển sự sao chĩp của virus vă dẫn đến tế băo bất thường, bắt tử vă
âc tính
Protein E6 gồm khoảng 151 acid amin; đóng vai trò gắn kết vă giân tiếp lăm
Trang 23dẫn đến bệnh ung thư cô tử cung Sự biểu hiện gen E6 lă đặc điểm để xâc định kiểu
hình câc bệnh ung thư liín quan đến HPV
Protein E7 có chức năng lăm bất hoạt họ protein pRb
Hai protein E6 vă E7 gắn văo p53 vă pRb lăm cho quâ trình “tế băo chết — apoptosis” không xảy ra vă thúc đđy chu trình tế băo diễn ra để sao chĩp DNA virus
Protein E7 còn có khả năng lăm bắt tử những tế băo chủ bị nhiễm virus bằng hoạt
tính xúc tâc telomerase của tế băo chủ ~ Protein E6 vă E7 cần cho sự sống của câc dòng tế bảo ung thư Hela trong những khối u âc tính do HPV gđy ra
s% Câc gen LI vă L2: [14, 30]
Mê hóa cho những protein cau tao capsid; hai gen nay y được phiín mê trong
giai đoạn muộn: giai đoạn lắp râp
Gen L1 mê hóa cho protein LI hình thănh câc capsomer 5 cạnh được liín kết với nhau bằng cầu nối disulñde để hình thănh capside Trình tự amino acid của
protein L1 có độ bảo tồn cao trong những loăi virus HPV, do đó có xu hướng sử dụng
câc khâng thể khâng HPV virus ở bò nhằm phât hiện câc protein capside của HPV trong mô người
Protein L2 ở trạng thâi oxi hóa trong cấu trúc virus hoăn chỉnh, bao gồm hai gốc bảo tồn cystein hình thănh cầu nối disulfide Gen L2 có trình tự đa dạng hơn gen
L1; khâng thể khâng protein L2 được sử dụng lăm nguồn khâng nguyín đặc hiệu để
dinh type HPV
II.7 Chu trinh song cia virus
11.7.1 Tấn công— xđm nhiễm văo biểu mô [24, 30]
Virus HPV xđm nhiễm văo câc tế băo biểu mô qua vết trầy xước, tôn thương trín da, niím mạc Virus không có khả năng gắn bâm văo tế băo sống, chúng xđm nhiễm văo bín trong tế băo thông qua những chỗ vi tổn thương trín bề mặt tế băo Quâ trình xđm nhiễm xảy ra chậm, khoảng 12-24 giờ để khởi đầu sự phiín mê Do đó
câc khâng thể có vai trò trung hòa virus khi virus van còn ở dạng hoăn chỉnh (virion)
trín bề mặt măng tế bảo
Sự tương tâc giữa protein LI vă đường sulfat trín bề mặt tế băo chủ giúp cho virus dễ dăng tấn công tế băo chủ Sau đó virus tương tâc với thụ quan chuyín biệt (alpha-6-beta-integrin) vă câc endosome gắn trín măng tế băo chủ Protein L2 phâ vỡ
măng tế băo tại câc endosome, cho phĩp bộ gen được giải phóng vă vận chuyển cùng
với L2 văo trong nhđn tế băo chủ | 1.7.2 Virus hoạt động trong tế băo chủ [20]
Sau khi văo bín trong tế băo gai, virus biểu hiện protein E1 vă E2 nhằm thực
hiện quâ trình sao chĩp DNA vă bảo tồn thông tin di truyền ở dang episome mach
Trang 24vòng Hai gen năy được sao chĩp khoảng 50-100 bản sao trong một tế băo Khi gen
E2 bị ức chế hoạc không hoạt động, câc oncogene E6 vă E7 được biểu hiện, dịch mê
thănh protein E6 vă E7 lăm bất hoạt câc protein ức chế khối u p53 vă pRb Đó chính lă nguyín nhđn hình thănh khối u âc tính, câc tế băo gai trong lớp đây biểu mô có thĩ - mang virus tồn tại qua nhiều năm -
11.7.3 Sự sinh sản virus trong tế băo chủ [20, 24, 30]
Sự biểu hiện câc gen muộn L1 va L2 dẫn đến sự biệt hóa câc tế băo gai ở lớp
ngoăi cùng của biểu mô, niím mạc Sự biểu hiện L1 vă L2 tăng lín tỷ lệ thuận với sự gia tăng số lượng bản sao bộ gen virus Trong khoảng 21 ngăy, HPV dẫn đến những
sự biệt hóa khâc nhau của tế băo biểu mô, chúng có khoảng 10.000 bộ gen virus/1 tế bảo
Chính sự biểu hiện câc gen muộn lă nguyín nhđn lăm cho câc tế băo gai có nhiễm virus ở lớp biểu mô không hóa sừng trânh sự tiíu diĩt bởi câc tế băo thuộc hệ
miễn dịch Đến giai đoạn sinh sản, virus mới được tạo ra bín trong tế băo chủ Câc
virus HPV có cơ chế giải phóng virion văo trong môi trường giống với câc virus không có măng bao Chúng sử dụng chu trình tan để giết tế băo chủ, giải phóng câc
virus mới được lắp râp hoăn chỉnh Đôi khi chu trình tan dẫn đến phản ứng viím, tạo
tín hiệu cho câc thănh phần trong hệ miễn dịch tấn công virus Tuy nhiín, HPV co khả
năng tạo sự bóc vảy tế băo, không gđy ra phản ứng viím
IL7.4 Diễn tiến hình thănh khối u âc tính
Trong suốt thập niín qua, câc nhă khoa học vẫn tiếp tục nghiín cứu xâc định
câc cơ chế chuyín biến từ nhiễm HPV sang ung thư CTC Tuy vậy, câc nghiín cứu từ
trước tới nay đê mô tả khâ rõ quâ trình xđm nhiễm vă gđy bệnh ung thư CTC của HPV type nguy cơ cao
Việc nhiễm câc type HPV nguy cơ cao không phải lă nguyín nhđn duy nhất
gđy ung thư CTC Quâ trình hình thănh ung thư xảy ra chỉ khi có hiện tượng chỉn gen
của câc type HPV nguy cơ cao vao trong bộ gen người, dẫn đến rối loạn câc chức
năng tế băo Nhiều nghiín cứu thống kí cho thấy hơn 90% câc trường hợp ung thư
CTC đều có sự hiện điện của HPV nguy cơ cao.[9, 37]
Trước khi chuyín biến thănh ung thư, từ giai đoạn nhiễm HPV type nguy cơ cao tế băo còn phải trải qua câc giai đoạn tổn thương về phât triển mô học trong tế băo biểu mô CTC (CIN - dị sản) Theo tổ chức Y tế thế giới, tuỳ mức độ nặng nhẹ chia mức CN thănh ba loại: CIN I -dị sản nhẹ, CIN II - dị sản trung bình vă CIN HI- di
sản có thương tổn nặng nhất, ung thư tại chỗ Hầu hết câc nghiín cứu đều cho rằng,
hiện tượng chỉn gen của HPV chỉ xảy ra ở trường hợp bị CIN II, II vă ung thư CTC,
Trang 25Những nghiín cứu trước đđy câc nhđn tố môi trường vă lỗi sống, nhiều bạn
tình, giảm cđn, mang thai có ảnh hướng đến bệnh ung thư CTC Tuy nhiín, một số công trình nghiín cứu đê cho thấy có không mối liín hệ giữa câc nhđn tố níu trín với
CINII, II ở đối tượng phụ nữ có tiền sử bệnh bị nhiễm HPV [14, 30, 37] _"¬ (4) (3) Oo _ 478) (9)
Nhau Reviewed | bromunology
Hình 5: Quâ trình xđm nhiễm văo tế băo chủ vă gđy bệnh của HPV [38] Ghi chú: (1) Tế băo lât/hình vảy trưởng thănh; (2) Giai đoạn virus xđm nhiễm tế băo chủ; (3): HPV hoăn chỉnh (virion); (4) Giai doan tế băo bình thường, virus tấn công qua da, qua vết thương tốn, trđy xước; (3) Tĩ bao trinh diĩn khdng nguyĩn- APC; (6)
Lớp tế băo lât trưởng thănh; (7) Lớp tế băo lât; (8) Tế băo biểu mô lât tang khĩng hóa sừng; (9) Măng đây biểu mô; (10) Sự phđn chia tế băo biểu mô; (11) Tế băo
mđm; (12) Gen E1 vă E2 được biểu hiện; (13) Gen E6 vă E7 chỉn văo bộ gen người; (14) Gen E6 vă E7 được biểu hiện; (15) Su phat triển câc lớp tế băo biểu mô bị
nhiễm virus; (16) Câc tế băo ở măng đây hình thănh ung thư CTC giai đoạn xđm lan Biểu mô lât tang khong hóa sừng ở cổ tử cung có chức năng che chở, bảo vệ nín thường phât triển về bề mặt vă sẽ được bong ra ngoăi Virus HPV nguy cơ cao xđm nhiễm văo tế băo biểu mô CTC ở những lớp mang đây, câc tế băo năy có khả năng
Trang 26
sinh sản cao Bộ gen virus sẽ được nhđn bản thông qua hoạt động tăng sinh tế băo, dẫn
đến sự phât triển bất thường của 1 rồi nhiều lớp tÍ băo sau đó Câc tế băo năy sau đó được biệt hoâ vă di chuyển lín trín thay thĩ cho những tế băo giă, chết, đồng thời câc
virus cũng được phóng thích ra ngoăi [37] Protein E6 gắn văo p53 dẫn đến bất
hoạt protein p53, tế băo bất tử Protein E7 gắn văo pRb lăm cho
pRb bị bắt hoạt, tế băo không chết,
hình thănh khối u
Copyright © 2009 Paarson Education, inc
Hinh 6: Qua trinh tiến triển hình thănh khỗi u do protein E6 vă E7 [25]
Khi tế băo bất thường chiếm toăn bộ câc lớp của tế bảo biểu mô lât (dị sản
nặng ung thư tại chỗ), sẽ có khả năng phât triển lan rộng khỏi măng đây văo câc lớp sđu hơn biểu mô lât vă hình thănh ung thư cô tử cung giai đoạn xđm lẫn Tuy nhiín,
những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lât vốn không có tiếp xúc mạch mâu,
HPV hẳu như chỉ hiện diện tại chỗ vă không đi văo mâu, do đó không gđy ra tình
trạng viím, không hoạt hóa hệ miễn dịch, vă hằu như không gđy miễn nhiễm sau khi
đê nhiễm tự nhiín HPV Ngăy nay, có một số ít bằng chứng cho thấy dường như cũng
có vai trò miễn dịch trong nhiễm HPV mặc dù yếu ớt: những người có suy giảm miễn dịch sẽ đễ bị nhiễm HPV vă khi đê nhiễm thì tiến triển sẽ nhanh vă nặng nề; có gia
tăng nồng độ khâng thể với HPV sau khi bị nhiễm tự nhiín nhưng nồng độ khâng thĩ
không đủ để gđy đâp ứng miễn dich.[37]
Ở trạng thâi bình thường, bộ gen virus HPV tổn tại dưới dạng DNA plasmid,
độc lập với nhđn tế băo chủ, trong đó có hai oncogene gđy ung thư quan trọng nhất lă
Trang 27E6 vă E7 Trong giai đoạn tiềm đn, gen E6 vă E7 tồn tại trong bộ gen virus không ảnh
hưởng đến bộ gen tế băo chủ Gen E6 vă E7 bị ức chế bởi protein mê hóa bởi gen E2
[14, 30]
Ở câc lớp tế băo đây bín dưới, nằm ngay vùng chuyín tiếp (transformation 'zone) của tế băo biíu mô trụ tuyến, ngoăi hoạt động nhđn bản bình thường, câc virus HPV còn sản xuất ra câc thănh phần bổ sung (cofactor) giúp chúng tồn tại lđu đăi trong tế băo Việc tế băo bị nhiễm lđu dăi câc type nguy cơ cao sẽ lăm cấu trúc tĩ bao CTC bị rối loạn vă chu trình tế băo bị xâo trộn Đến một lúc năo đó, khi nhiễm sắc thể
người bị mất ôn định, một số vị trí dĩ gay trín nhiễm sắc thể sẽ trở nín lỏng lẻo vă
yếu ớt, dưới một điều kiện thuận lợi năo đó, bộ gen virus HPV nguy cơ cao sẽ chỉn văo câc vị trí trín, gắn kết hai gen E6 vă E7 văo bộ gene chủ Từ đó chúng được phiín mê thănh mRNA rồi thănh protein theo hoạt động tăng sinh của tế bảo Oncoprotein
E6 vă E7 không có trình diện trín bề mặt tế băo nín hệ thống miễn dịch không tan cong cac tĩ bao bi nhiĩm.[ 7, 14, 15, 30]
Khi gắn văo bộ gen chủ, hai oncogene E6 va E7 sĩ không chịu sự kiím soât của gen E2, hai oncogene năy biểu hiện mê hoâ cho hai protein lăm ức chế hai hệ thống tiíu diệt vă đăn ap khối u p53 vă pRb Việc bất hoạt hệ thống p53 sẽ dẫn dĩn
hiện tượng bắt tử hóa tế băo (do kích hoạt enzyme telomerase — có vai trò kĩo dăi đầu
telomere của nhiễm sắc thể) vă bất hoạt pRb sẽ lăm cho tế băo tăng sinh liín tục, gđy mất ổn định tế băo vă chuyín thănh ung thư CTC Khi câc tế băo ung thư bắt đầu xđm lắn văo mô liín kết, có chiều hướng lan rộng dọc theo măng đây sẽ được gọi lă ung thư xđm lấn (invasive cancer) Ung thu CTC nếu tiến triển nặng có thí di căn sang
bụng, phổi vă một số nơi khâc [14, 30]
Một số trường hợp nhiễm kĩo dăi bởi type nguy cơ cao, sẽ gđy ra câc tổn
thương về phât triển mô học của cô tử cung (dị sản xếp theo thứ tự nhẹ, vừa, nặng)
Hơn phđn nửa câc trường hợp dị sản nhẹ có khả năng tự thoâi lui; 10% câc trường hợp dị sản nặng hay vừa có khả năng tiến triển nặng hơn trong 2-4 năm; khoảng 50% dị sản nặng sẽ trở thănh ung thư tại chễ cổ tử cung, đặc biệt khả năng năy it gặp ở người
trẻ tuôi
Tổn thương dị sản hay ung thư cô tử cung có một thời: gian dăi phât triển tại biểu mô vă tại chỗ cổ tử cung Trung bình, có khỏang 10-20 năm cho sự tiến triển từ dị sản đến ung thư cổ tử cung Đđy chính lă đặc điểm thuận lợi cho việc tầm soât ung thư cổ tử cung, giúp phât hiện sớm vă điều trị những tốn thương dị sản cũng như ung thư giai đọan sớm
Việc phât hiện, tầm soât ung thư chủ yếu dựa văo câc giai đoạn tiến triển ung thư Với câc trị liệu thích hợp, tỷ lệ sống đối với trường hợp ung thư xđm lan CTC la 92%, 80 to 90% phụ nữ ở giai đoạn CIN I vă 50 to 65% giai đoạn CIN II kĩo đăi tuổi
Trang 28thọ hơn 5 năm sau ngăy phât hiện Chỉ có bệnh nhđn ở giai đoạn CIN III được kĩo dăi
tuổi thọ sau 5 năm vớ tỷ lệ thấp 25 to 35% [23]
II TÌNH HÌNH BỆNH UNG THƯ CÓ TỬ CUNG IH.1 Tình hình trín thế giới
Bệnh ung thư cô tử cung lă căn bệnh nguy hiểm thứ hai đối với phụ nữ trín thế giới Hăng năm có khoảng 400.000 ca bệnh mới/mỗi năm Hăng năm, bệnh ung thư CTC dẫn đến tử vong ít nhất 250 000 phụ nữ trín toăn thế giới, chủ yếu chiếm trín 80% ở câc nước nghỉo, đang phât triĩn [9, 14, 39]
Theo cac nghiín cứu của Cơ quan nghiín cứu ung thư quốc tế (IARC) Tỷ lệ
nhiễm HPV tăng gấp 20 lần trín toăn thế giới, chúng ảnh hưởng ở nhiều độ tuổi khâc
nhau Hiện nay, ở câc nước phât triển, HPV có khả năng xđm nhiễm vă được tìm thấy ở những phụ nữ có độ tuổi trẻ đưới 25 hoặc 30 tuổi vă tỷ lệ nhiễm HPV nhiều so với phụ nữ trung niín, giă Điều năy cho thấy cần có biện phâp thích hợp vă hiệu quả dĩ phòng chống, phât hiện sớm tình trạng nhiễm HPV vă diễn tiễn ung thư CTC ở phụ nữ [19] Bang 2: Tỷ lệ nhiễm HPV ở những độ tuỗi khâc nhau [24] Tuổi Tỷ lệ nhiễm HPV (%) Vùng sa mạc Sahara Chđu phi chiếm tỷ lệ nhiễm HPV vă dẫn đến bệnh ung thư CTC Ân độ có tỷ lệ nhiễm 20% [19]
Ở Hoa Kỳ, đđy lă quốc gia đứng hăng thứ 8 trong những nước có tỷ lệ cao về bệnh ung thư Năm 1998 có khoảng 12.800 ngăn phụ nữ được chđn đoân bị ung thư CTC vă khoảng 4.800 phụ nữ bị tử vong Năm 2008, ước tính có khoảng 1] 0000
trường hợp nhiễm bệnh mới được chan đoân vă có hơn 3870 trường hợp được dự bâo
sẽ bị tử vong do bệnh ung thu CTC Điều năy cho thấy tỷ lệ tử vong ở Hoa Kỳ lă khâ cao, đđy lă một quốc gia đê sử dụng phương phâp chđn đoân ung thư CTC chủ yếu
bằng Pap smear [23]
Ở những nước Chđu Đu, có khoảng 34.000 trường hợp mắc bệnh mới được
phât hiện hăng năm, có khoảng hơn 16.000 trường hợp bị tử vong do căn bệnh ung thư CTC văo năm 2004 [23]
Trang 29Ở Canada văo năm 2008, ước tính có khoảng 1300 phụ nữ được chđn đoân bị ung thư CTC vă đê có 380 trường hợp tử vong do căn bệnh năy [23]
Ở Úc, có khoảng 734 trường hợp bị ung thư CTC văo năm 2005 Đđy lă quốc
| gia có ty lệ mắc bệnh giảm do có đđy mạnh phương phâp kiểm tra, tầm soât ung thư
nín đê cứu sống 1200 phụ nữ ÚC mỗi năm [23]
| Glee © Gl tea (1 < atom,
Hinh 7: Ban đề biểu diễn tỷ lệ bị ung thư CTC trín thể giới [35] HI.2 Tình hình ở Việt Nam [21, 27]
Nhóm bâc sĩ bệnh viện Ung bướu TPHCM vă bệnh viện Từ Dũ cho biết, ghi
nhận toăn thế giới văo năm 2002 có 493.000 ca mắc UTCTC vă đê có 275.000 ca tử
vong Tại Việt Nam cũng trong năm năy, ước tính có 6.224 phụ nữ mắc mới vă hơn 3.300 ca tử vong do ung thu Theo GS Nguyễn Chan Hùng, Chủ tịch Hội Ung thư TPHCM, qua khảo sât ung thư quản thể tại TPHCM trong năm 2003 cho thấy có bệnh
ung thư CTC chiếm tý lệ 16,5/100.000 dđn Bâc sĩ Hùng cho biết, riíng tại BV Ủng bướu TPHCM mỗi năm có hơn 1.000 trường hợp UTCTC mới nhập viện vă điều trị, gần phđn nửa trong số năy đê văo giai đoạn cuối
Tại TPHCM có hơn 3 triệu phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ nhưng mỗi năm tại BV
Từ Dũ, Hùng Vương vă câc BV sản tư nhđn khâc chỉ lăm săng lọc cho khoảng
300.000 người Câc chuyín gia về ung thư cho biết, thực tế một số phụ nữ có thí đê bị UTCTC rồi nhưng không hay biết, vì trong giai đoạn đầu bệnh năy không có triệu chứng Đđy lă nguyín nhđn khiến số bệnh nhđn bị căn bệnh năy tăng cao
Trang 30Có khoảng 90% câc trường hợp UTCTC đều xảy ra trước tuổi 35- 40 Thời
gian trung bình để cho ung thư tiến triển thănh ung thư xđm lan kĩo dai khoảng 10 —
20 năm, vă chỉ có một tỷ lệ rất nhỏ UTCTC diễn tiến thănh ung thư xđm lấn, nếu
không phât hiện vă điều trị kịp thời
IV PHƯƠNG PHÂP CHẲN ĐOÂN UNG THƯ CÓ TỬ CUNG
IV.1 Chấn đoân lđm săng
Ở giai đoạn sớm của bệnh ung thư cô tử cung, thường không có dấu hiệu bệnh Ở văi trường hợp, những dạng tôn thương thông thường có sự xuất huyết đm đạo,
dịch đm đạo (khí hư) có thể lă dấu hiệu bệnh [23, 27]
Bệnh ung thư cỗ tử cung ở giai đoạn muộn thường có biểu hiện : giảm cđn,
chân ăn, mệt mỏi, đau xương chậu, đau lưng, đau chđn, sưng một chđn, gêy xương,
xuất huyết bất thường [23, 27]
IV.2 Câc phương phâp chđn đoân ở phòng thì nghiệm
IV.2 1 Xĩt nghiệm tế băo học
s* Pap?smear: [9, 19, 21, 26, 27, 28, 37]
Từ khi xuất hiện câch đđy rất lđu từ những năm 50 của thế kỷ trước, phương phâp Papanicolaou smear (phết tế băo CTC - Pap smear) được sử dụng rộng rêi trín
toăn thế giới Năm 1228, George Nicolas Papanicolaou — một bâc sĩ người Hi Lạp giới
thiệu những phât hiện mới của mình, về một phương phâp chẩn đoân ung thư mới:
phết tế băo đm đạo vă sau năy được cải tiến lă phết mỏng tế băo cô tử cung Đđy lă
một xĩt nghiệm tầm soât, nhằm phât hiện sự thay đổi bất thường tế băo ở lớp biểu mô
trong vùng chuyển tiếp của CTC bằng câch kiểm tra câc tế băo đê bị bong tróc trong
đm đạo hoặc CTC, để xâc định tình trạng của những thương tôn tiền ung thư, phục vụ
cho mục đích điều trị hoặc nghiín cứu
Phương phâp năy góp phần lăm giảm tỉ lệ ung thư CTC vă tỉ lệ tử vong giảm xuống 2/3 câc trường hợp Tuy nhiín, nhược điểm của Pap’ smear lă có thể có trường
hợp đm tính giả với tỉ lệ khâ cao do chỉ kiểm tra trín tế băo đơn, độ nhạy thấp (37 —
84%) Vì vậy, phải thực hiện xĩt nghiệm Papˆsmear nhiều lần để giảm bớt câc trường
hợp đm tính giả, khoảng thời gian giữa hai lần xĩt nghiệm căng ngắn căng tốt Thông kí của IARC cho thấy nếu giữa hai lần xĩt nghiệm câch nhau 1 năm, tỉ lệ giảm ung
thư CTC đạt đến 93.5
Trang 31Hình 8: Cô tử cung có (hương ton [39]: CTG bình thường Tĩ bao niĩm mạc bình thường
Hình 9: Phương phâp xĩt nghiệm tế băo cỗ tử cung [28]
s* ThinPrepTM Pap Test:
Đđy lă phương phâp cải tiến từ Pap°smear nhằm mục đích lăm giảm tỉ lệ mẫu
lấy không đạt yíu cầu, giảm bớt câc trường hợp đm tính giả do nguyín nhđn từ khđu
- lấy mẫu Câc mẫu tế băo CTC mới lấy sẽ được trộn văo một dung dịch, sau đó lọc hỗn
hợp năy dĩ loại bỏ câc tạp chất, chất nhầy, nắm, mảnh vụn vă nhiều thứ khâc lăm ảnh hưởng đến độ chính xâc của xĩt nghiệm [40]
s* Phương phâp soi CTC:
Đđy lă phương phâp được âp dụng để phât hiện ung thư CTC khi bệnh nhđn đê có kết quả phết tế băo CTC bị bất thường Phương phâp soi bằng mắt thường hoặc bằng mây soi có độ phóng địa từ 10-30 lần, giúp xâc định rõ vị trí vă mức độ lan toả
của tổn thương, đồng thời hướng dẫn cho bệnh nhđn sinh thiết CTC Đđy lă phương phâp có độ nhạy vă độ đặc hiệu không cao, nhưng chỉ phí cao, không giải quyết được bệnh một câch triệt dĩ [29]
«%* Phương phâp sinh thiĩt CTC:
Trang 32Sinh thiết lă phương tiện sau cùng của chđn đoân bệnh ung thư CTC vă cho kết
quả chính xâc hơn cả, giúp chẩn đoân về mặt giải phẫu bệnh Sinh thiết CTC được
thực hiện dưới hướng dẫn của mây soi.[ 23,29]
IV.2 2 Xĩt nghiĩm tim HPV DNA [5, 10, 26]
Từ những mẫu phết CTC hay đm đạo, xĩt nghiệm HPV DNA có thể phât hiện
DNA của câc type HPV nguy cơ cao Phương phâp năy lấy mẫu tế băo từ cổ tử cung hoặc đm đạo bằng que tăm bông nhỏ, sau đó được đưa đến phòng xĩt nghiệm
Phương phâp năy có độ nhạy cao hơn Pap”smear (97 — 100%), do đó, việc bỏ
sót trường hợp đm tính giả rất thấp Ngoăi ra, xĩt nghiệm HPV DNA không mang tính
chủ quan như câc xĩt nghiệm tầm soât tế băo Bín cạnh việc có thí phât hiện ra những
mẫu đê mắc bệnh, phương phâp năy còn có giâ trị trong việc nhận biết được những trường hợp viím nhiễm HPV có nguy cơ tiến triĩn sang ung thu CTC
“* HPV DNA PCR:
Phương phâp năy có thể phât hiện vă định danh câc type của HPV Ưu điểm
phương phâp năy có thể thực hiện vă cho kết quả chính xâc trong điều kiện mẫu bệnh
phẩm chỉ có một.số lượng nhỏ virus, dựa trín nguyín tắc cơ bản của phản ứng PCR
[10]
IV.2 3 HPV DNA Hybrid Capture (HC2 test): [10, 26]
Phương phâp năy do hêng Digene phât triển, được Cơ quan Lương thực vă Dược phẩm Liín Ban Mỹ (FDA) cho phĩp xĩt nghiệm lđm săng
Nguyín tắc dựa trín phương phâp lai sử dụng câc mẫu dò DNA tổng hợp để phât hiện câc bộ gen của câc type HPV nguy cơ cao Ưu điểm của phương phâp năy lă có độ nhạy cao hơn câc phương phâp phât hiện bằng mắt thường vă xĩt nghiệm tế băo học Nhược điểm lă đòi hỏi điều kiện phòng thí nghiệm phải tốt, thiết bị đặc biệt vă kỹ thuật viín phải được huấn luyện về trình độ vă thao tâc Phương phâp năy xâc định được bệnh nhđn nhiễm type HPV nhóm nguy cơ cao hay nguy cơ thấp, nhưng chỉ có thể phât hiện được 13 type HPV Đề thực hiện HPV DNA Hybrid Capture thi mẫu cần phải có một số lượng virus nhiều hơn phương phâp HPV DNA PCR Thông thường có
thể biết kết quả xĩt nghiệm sau 6 — 8 tiếng
V PHUONG PHAP PCR VA UNG DUNG TRONG CHAN ĐOÂN BỆNH
UNG THU CO TU CUNG
V.1 Nguyín tắc phương phap PCR [1, 2, 6, 10]
Phuong phâp PCR (Polymerase chain reaction) do Kary B Mulis cùng câc cộng sự phât minh văo năm 1985 Đđy lă phương phâp khuĩch dai in vitro cĩ chon lọc, cho phĩp khuếch dai đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự
Trang 33oligonucleotide đê biết trước Hai trình tự oligonucleotide năy được gọi lă mồi xuôi (forward primer) vă mỗi ngược (reverse primer) Mỗi có khả năng bắt cặp bổ sụng với một đầu của mạch khuôn vă DNA polymerase thực hiện nối dăi mạch tạo thănh
mạch mới
Phản ứng PCR lă phản ứng khuếch đại theo cấp số nhđn, một phản ứng lă một chuỗi gồm những chu kỳ lặp lại nhiều lần, mỗi chu kì thường gồm 3 bước:
e Bước I- Biến tính: phđn tử DNA mạch khuôn được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phđn tử, tường khoảng nhiệt độ từ 94 — 950C trong 30 giđy -l phút
e© Bước 2- Lai: Câc primer bắt cặp văo mạch khuôn, nhiệt độ tùy thuộc văo Tim của câc primer sử dụng, dao động từ 40 — 700C
e Bước 3- Kĩo dăi: Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA
polymerase, 720C lă nhiệt độ tối ưu cho Tag DNA polymerase hoạt động V.2 Câc thănh phần trong phản ứng PCR [1,2, 6, 10]
DNA bản mẫu:
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trín DNA thật tính sạch nhưng nhiều kỹ
thuật chđn đoân bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế băo hoặc câc mẫu DNA không được bảo quản tốt, bị phđn hủy từng phan: vết mâu lđu ngăy, hóa thạch, tóc
- Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa văo thường không quâ cao, thậm
chí chỉ cần một phđn tử DNA ban đầu cho một phản ứng Thông thường nông độ DNA tốt nhất sử dụng trong phản ứng PCR ở khoảng 105 bản sao/phản ứng
b Mĩi va nhiĩt dĩ lai:
Mỗi (primer) lă những đoạn oligonucleotide ngắn (17 — 30 Nu) có khả năng bắt
cặp bổ sung đặc hiệu với DNA bản mẫu
Môi lă chỉ tiíu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng, chuyín biệt vă có hiệu quả cao Việc chọn vă thiết kế môi lă giai đoạn quyết định của phương phâp PCR, vă phải tuđn thủ một số nguyín tắc:
- Khong có sự bắt cặp bổ sung giữa mỗi “xuôi” vă mỗi “ngược”, vă cũng không
có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa câc phần khâc nhau của một x
môi
-Tm của mỗi xuôi vă mỗi ngược không câch biệt quâ xa Thănh phđn nucleotide của câc mỗi cđn bằng trânh câc cặp GC lặp đi lặp lại nhiíu lđn
Trang 34- Câc mỗi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trín gene
_ Trinh ty nằm giữa hai mỗi xuôi vă mỗi ngược không quâ lớn, phản ứng PCR sẽ
ưu tiín trín những trình tự nhỏ hơn 1 kb
- Nông độ mỗi sử dụng trong phản ứng PCR phải được tính toân vă tối ưu qua
thực nghiệm Nếu nồng độ mỗi quâ cao sẽ dễ gđy khuếch đại “kí sinh”, còn nếu
nồng độ mỗi quâ thấp sẽ lăm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao
Thông thường nồng độ mồi sử dụng nằm trong giới hạn từ 0,1 — 1,0 HM
c dNTP:
Bĩn loai nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) thong duge str dụng ở nồng độ 20 — 200 uM/mỗi loại nuceotide Bến loại nuclecotide thường được sử dụng ở
nồng độ 200 — 250 uM Nông dĩ cao hon (>4 mM) sĩ lam giảm hiệu quả nhđn bản
của phản ứng PCR, còn sự mắt cđn băng trong thănh phần câc nucleotide lại lăm tăng
lỗi sao chĩp của DNA polymerase
d Dune dich dĩm cho phan ung PCR (PCR buffer):
Dung dịch đệm có tâc dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản
ứng PCR xảy ra Nồng độ vă pH của dung dịch đệm (KCI, MgCl2) tối ưu thường tùy
thuộc văo đặc tính của DNA polymerase sử dụng Một dung dịch đệm điển hình cho
phản ứng PCR bao gồm chứa 50 mM KCI, 10 mM Tris — HCI, pH 8,3 ở nhiệt độ
phong
e MgCl2:
Nồng độ Mg++ tối ưu phải được xâc định cho từng phản ứng qua nhiều thí
nghiệm Trong phản ứng PCR, MgCl2 đóng vai trò lă một cofactor cho DNA
polymerase hoạt động Ngoăi DNA polymerase, câc thănh phần khâc cũng có thể kết
với MgCl2 như primer, DNA bản mẫu, dNTPs, EDTA; câc thănh phần năy sẽ cạnh
tranh MgCl2 voi DNA polymerase Do đó nồng độ MgCl2 str dụng cần được tối ưu
cho từng hệ thống PCR cụ thể Nếu nồng độ quâ cao dễ gđy khuếch đại kí sinh, thông thường MgC12 được sử dụng ở nồng độ 0,5 mM - 5 mM
e Taq polymerase:
Enzyme được sử dụng lă DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt, được tâch
chiết từ vi khuẩn suối nước nong, Thermus aquaticus Enzyme Tag polymerase khong
bị phâ hủy ở nhiệt độ biến tính vă xúc tâc sự tổng hợp từ đầu đến cuối quâ trình phản
ứng Với một phản ứng PCR 25 ul — 50 pl thong thudng Taq polymerase duge sử
dụng với một liều lượng nằm trong giới hạn 0,5 — 2,5 đơn vị
{ Câc chất ting cwong:
Trang 35Trong phản ứng PCR ngoăi những thănh phần cơ bản, đôi khi người ta còn bồ sung thím chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn Câc chất thường được sử dụng lă betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), ‘glycerol Tuy nhiĩn
cần thận trọng khi sử dụng những chất năy bởi vì nếu sử dụng ở nồng độ không thích 'hợp thì những chất năy sẽ gđy ức chế phản ứng PCR
V.3 Phương phâp Reverse transcriptase - PCR [1, 6]
Nguyín lý hoạt động của RT - PCR cũng dựa trín nguyín tắc PCR bình
thường, chỉ khâc ở vật liệu cần khuếch đại ban dau Trong RT — PCR, vat ligu ban dau
la RNA, ching sẽ được phiín mê ngược thănh cDNA nho enzyme Reverse
transcriptase, sau dĩ cac CDNA nay tiếp tục được nhđn bản qua câc bước như trong
PCR
Thănh phần cơ bản của phan ing RT- PCR gồm có: RNA bản mẫu, primer nguoc, dNTPs, dung dịch đệm cho phan tng RT- PCR, enzyme reverse transcriptase
Câc điều kiện về nồng độ RNA ban đầu cũng tương tự như của DNA trong PCR
V.4 Phương phâp Real time PCR
V.4.1 Nguyín tắc [6, 31, 33, 34,41]
Phương phâp Realtime PCR lă kỹ thuật nhđn bản DNA đích trong ống nghiệm
thănh nhiều bản sao dựa văo chu kỳ nhiệt, cho phĩp định lượng chính xâc mức độ biểu hiện của gen thông qua kết quả khuếch đại DNA đích trong ống phản ứng được hiển thị ngay trín măn hình cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra (sau mỗi chu kỳ nhiệt
phản ứng), không cần thiết thực hiện bước điện di trín gel agarose như phương phâp
PCR cổ điển
Nguyín tắc chung của phương phâp Realtime PCR lă sử dụng câc chất nhuộm phat huynh quang (fluorescent dye), co sy kết hợp bước nhđn bản vă phât hiện sản
phẩm PCR mục tiíu nhằm theo dõi lượng sản phẩm PCR mục tiíu theo thời gian thật
(real time) của phản ứng Có thể sử dụng một chất hóa học phât huỳnh quang có khả năng gắn văo mọi phđn tử DNA mạch đôi hoặc sử dụng câc mẫu dò có đânh dấu chất phât huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiíu
Phương phâp Real time RT- PCR lă phương phâp nhằm khuếch đại DNA bản mẫu thănh câc bản sao, DNA bản mẫu được phiín mê ngược từ mRNA Phương phâp
năy nhằm định lượng số bản sao mRNA vă khảo sât sự biíu hiện câc gen thông qua
bước phiín mê thănh mRNA
Trang 36DNA Extractio PCR — 1 ‘iii DuuÖ pene Se — ——— ——— Real Từng —— =
Hinh 10: So dĩ tĩm tat phwong phap Real-time PCR [31]
V.4.2 Câc thuật ngữ trong phương phâp Realtime PCR [6, 7, 31, 33, 34] Amplification curve: cho biết tín hiệu huỳnh quang phât ra tại từng chu kỳ phản ứng PCR
Baseline :giâ trị tín hiệu huỳnh quang tại câc chu kỳ đầu của phản ứng PCR (được coi lă giâ trị nền-chưa co san pham PCR)
Reporter dye (danh dấu huỳnh quang) lă phan tir fluorescent duge su dung dĩ
xâc định lượng sản phẩm PCR tạo ra
Quencher lă phđn tử hấp phụ năng lượng từ reporter dye ở trạng thâi bị kích
thích :
Threshold :lă điểm bắt đầu phât hiện tín hiệu huỳnh quang, tại thời điểm năy
ta có thí phđn biệt sản phẩm PCR với tín hiệu nền
Ct (Threshold_cycle) - chu kỳ ngưỡng lă số chu kỳ mă tại đó sản phẩm
khuếch đại có thể được phât hiện bởi sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang
Trong câc chu kỳ đầu của phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang thay đổi lín xuống thực chất chỉ lă "nhiễu" Ct vă tín hiệu nền phải được đặt sao cho
mây Real time "bỏ qua” câc tín hiệu nhiễu năy
o_ Xâc định giâ tri Ct sao cho dung đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang
Melting curve: cho phĩp phđn tích độ đặc hiệu của phản ứng khuếch đại dựa chỉ số nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR
Trang 37V.4.3 Câc loại mẫu đò (probe) trong phương phâp Real time-PCR (31, 33, 34]
“* Molecular beacon:
Đđy lă loại probe có cầu trúc dạng vòng va cuống, trong đó cđu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiíu
Phần cấu trúc dạng cuống (stem) của phđn tử probe được hình thănh từ câc liín
kết hydro giữa câc base bắt cặp bỗ sung nằm ở hai đầu mút của probe Một chất hóa
học phât huỳnh quang (Reporter dye) được gắn văo một đầu của mẫu dò vă một chất
hóa học khâc (Quencher) có nhiệm vụ “dập tắt” được gắn ở đầu bín kia Quencher lă một chất mău không phât huỳnh quang có nhiệm vụ lăm tiíu giảm năng lượng mă nó
nhận được từ chất phât huỳnh quang dưới dạng nhiệt vă vì thế không cho ânh sâng huỳnh quang năo được phât ra
Trong dung dịch phản ứng, một beacon ở trạng thâi tự do sẽ có cầu trúc đạng vòng vă cuống Lúc đó, phần cấu trúc dạng cuống lăm cho hai đầu của mẫu dò ở gần với nhau trong không gian, lúc đó quencher sẽ phât huy tâc dụng vă ngăn cản sự phât huỳnh quang của chất phât huỳnh quang PCR Product-Specific Nucleotides Fluorescent Reporter Dye “Ri Quencher Dye
Hinh 11: Nguyĩn tic hoat dĩng cia Molecular beacon [34]
Khi probe bat cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiíu ở nhiệt độ
lai của phản ứng thì mẫu dò mất cấu trúc dạng vòng vă cuống trở thănh dạng thang
Điểu năy lăm gia tăng khoảng câch không gian giữa chất phât huỳnh quang vă quencher Chất phât huỳnh quang lúc đó sẽ phât ânh sâng mă câc thiết bị có thí tiếp
nhận vă phđn tích
Nếu beacon không bắt cặp bể sung hoăn toăn với trình tự DNA thì sự lai giữa beacon vă trình tự DNA sẽ không xảy ra dẫn đến không có sự phât ânh sâng huỳnh quang
Khó khăn lớn nhất khi sử dụng probe dạng beacon chính lă việc thiết kế probe
Trình tự nucleotide của cấu trúc dạng cuồng phải được thiết kế sao cho quencher vă chất phât huỳnh quang tiếp xúc nhau Nếu không thì một phần ânh sâng huỳnh quang
Trang 38sẽ được phóng thích một câch không đặc hiệu, lăm gia tăng mức độ tín hiệu nền (background signal) của phản ứng dẫn đến việc sai lệch trong đânh giâ kết quả định lượng Ngược lại, nếu câc liín kết trong cầu trúc dạng cuống của phđn tử quâ mạnh thì beacon sẽ khó bắt cặp với trình tự DNA mục tiíu vă tín hiệu huỳnh quang phât ra cũng không phản ânh đúng hăm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng, Vì vậy, cần đảm bảo tính phù hợp giữa một cấu trúc ổn định vă khả năng bắt cặp với trình tự DNA mục tiíu lă điều quan trọng khi thiết kế một beacon
s* Chất nhuộm gan với DNA mach đôi: SyBR Green gắn văo DNA mạch đôi vă phât sâng
Hình 12: Nguyín tắc hoạt động của SyBr Green [33]
Khi ở trạng thâi tự do, chất nhuộm không phât huỳnh quang nhưng sau khi đê gắn văo câc phđn tử DNA mạch đôi thì phât huỳnh quang vă cường độ huỳnh quang phât ra tỉ lệ thuận với hăm lượng DNA có trong phản ứng PCR Câc chất nhuộm phât
huỳnh quang thường được sử dụng lă SyBr Green I, Ethidium bromide
Trong phản ứng PCR, câc chất nhuộm sẽ gắn văo câc mạch đôi DNA mới được tổng hợp trong bước kĩo dăi mạch vă rời ra khi câc phđn tử DNA bị biến tính Tất cả DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả nặng bắt chất nhuộm vă
Trang 39
phât huỳnh quang do đó nếu có câc sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nín không chính xâc
Để phât hiện câc sản phẩm ký sinh trong phản ứng cần xđy dựng một đường
cong “nĩng chay” (melting curve) bằng câch đo giâ trị cường độ ânh sâng huỳnh
quang phât ra tại câc thời điểm nhiệt độ khâc nhau để có thể phât hiện sự hiện diện
của câc sản phẩm ký sinh vă tiến hănh câc biện phâp khắc phục Câc biện phâp khắc phục rất đa dạng: thiết kế primer đặc hiệu vă cho hiệu quả phản ứng tối ưu, khảo sât nồng độ câc thănh phần tham gia phản ứng như 72g polymerase, MgCl2, dNTP dĩ cho phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu
«% Mẫu dò lai (hybridization probe): [ 31, 33, 34, 41] |
Phương phâp năy có độ đặc hiệu rất cao do sử dụng cùng lúc hai mẫu đò bắt
cặp với trình tự DNA mục tiíu
Mĩt probe mang 6 dau 3’ chat cho “fluorescein” (donor fluorescein) phat anh
sang mau xanh va mẫu dò thứ hai mang ở dau 5’ chat nhan “fluorescein” (acceptor
fluorescein acceptor)
Probe thứ hai năy được chặn ở đầu 3’ sao cho Tag polymerase khong thể kĩo
dăi mạch từ đầu năy Anh sang huỳnh quang từ chất cho chuyển đến chất nhận thông qua hiĩu tmg FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer - sw chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) vă chất nhận sẽ phât ra ânh sâng huỳnh quang có mău dĩ (red fluorescent) Trong dung dich phan tng, khi hai chất cho vă chất nhận câch xa nhau thì tín hiệu nền lă tín hiệu huỳnh quang do chất cho phât ra Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phần đầu của probe năy tiếp xúc với phần cuối của probe kia Khi đó, hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phât ra một ânh sâng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ânh sâng
mă nó nhận được vă sẽ phât ra tỉ lệ thuận với hăm lượng sản phẩm PCR có trong phản
ứng Ưu điểm đâng chú ý của phương phâp năy lă sự thiết kế mẫu dò tương đối linh động, dễ dăng hơn so với việc thiết kế beacon
( bonerfuoophoe
(2 Acceptor fluorophore
Sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phan dau cua probe nay tiếp xúc với phđn cuối của
Trang 40Hình: Nguyín tắc "Hybridization probe"
Hình 13: Nguyín tắc hoạt động của Hybridication probe [33] s* Afẫu dò thủy giải (hydrolysis probe): | 31, 33, 34]
Probe sur dung trong phuong phâp năy còn có tín lă Tagman (Taqman probe), dựa văo đặc tinh exonuclease 3’ — 5S’ cla Taq polymerase Mau do Taqman duge gan một chất phât huỳnh quang ở đầu 5° vă một:chất “dap tat” (quencher) ở dau 3’ sao cho ânh sâng chất phât huỳnh quang bị hấp thụ bởi quencher | TaqMan probe § 3’ template DNA 5' j Tre nucleotides se &,, from TaqMan + template
Hình 14: Nguyín tắc hoạt động của Taqman probe [31, 33, 34]
Trong buoc bat cap va Keo dai mach cua mot chu Ky PUR, mau do nay sĩ bat
cặp với mạch bổ sung trín trình tự DNA mục tiíu Khi 7agman kĩo dăi mạch bĩ sung
tir ddu 3’ của primer đến tiếp xúc với mẫu dò, nó sẽ thể hiện hoạt tính exonuclease 3'- 5' va loại bỏ một sĩ nucleotide & dau cua probe, thay bang nhiing nucleotide mdi Khi đó, chất phât huỳnh quang sẽ tâch rời khỏi probe vă quencher mất tâc dụng
Tương tự như beacon, ânh sâng huỳnh quang phât ra sẽ tương ứng với hăm
lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng 7agman probe chỉ bắt cặp với mạch khuôn