Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện mycoplasma pneumoniae gây viêm đường hô hấp cấp ở trẻ em dưới 15 tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MYCOPLASMA PNEUMONIAE GÂY VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP Ở TRẺ EM DƯỚI 15 TUỔI NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC VŨ THÚY PHƯỢNG Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHAN LÊ THANH HƯƠNG HÀ NỘI, 2007 i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành Luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: - Đảng uỷ, Ban giám hiệu Phịng đào tạo sau đại học tồn thể thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Bách khoa Hà Nội dành cho thuận lợi, giúp đỡ khích lệ trình học tập nghiên cứu - Đảng uỷ, Ban giám đốc, cán bộ, công nhân viên khoa, phòng Viện Vệ sinh dịch tễ TW, đặc biệt Phịng Vi khuẩn hơ hấp nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đề tài - PGS TS Phan Lê Thu Hương, Phó trưởng khoa Vi khuẩn - Viện Vệ sinh dịch tễ TW tận tình hướng dẫn góp ý kiến quý báu cho tơi hồn thành Luận văn - Tơi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè thân hữu sát cánh cổ vũ giúp đỡ có hiệu cho tơi hồn thành Luận văn - Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người có cơng dưỡng dục, sinh thành; anh em ruột thịt chia sẻ, giúp đỡ, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành Luận văn này! Vũ Thúy Phượng ii LỜI CAM ĐOAN Đây cơng trình nghiên cứu tơi tham gia thực Những kết Luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin đảm bảo tính khách quan trung thực số liệu thu thập kết xử lý số liệu nghiên cứu Vũ Thúy Phượng iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ M PNEUMONIAE 1.1.1 Định danh phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Sinh học tế bào 1.1.4 Vai trị gây bệnh 1.1.4.1 Biểu mơ quan hơ hấp 1.1.4.2 Bệnh cảnh lâm sàng 1.1.5 Đặc điểm dịch tễ học 1.1.5.1 Tỷ lệ lưu hành đặc điểm theo mùa bệnh 1.1.5.2 Lứa tuổi 1.1.5.3 Giới tính 1.1.5.4 Chủng tộc 1.1.5.5 Nghề nghiệp 1.1.5.6 Trong điều kiện đặc biệt 1.1.5.7 Sự phân bố theo địa lý 1.1.5.8 Sự phân bố theo thời gian 1.1.6 Chức năng, cấu trúc protein P1 1.2 CHẨN ĐOÁN 1.2.1 Phương pháp nuôi cấy 1.2.2 Phương pháp phát kháng nguyên 1.2.3 Phương pháp huyết học 1.2.4 Phương pháp DNA dò 1.2.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU TRANG i ii iii v vi vii 3 11 11 14 16 16 19 22 23 23 23 27 27 29 31 33 35 35 37 38 45 45 iv 2.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Vật liệu 2.2.1.1 Môi trường nuôi cấy phân lập 2.2.1.2 Thiết bị 2.2.1.3 Hóa chất 2.2.1.4 Mồi cho phản ứng PCR 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.2.1 Nuôi cấy phân lập 2.2.2.2 Huyết học 2.2.2.3 Tách chiết DNA 2.2.2.4 PCR 2.2.2.5 Điện di sản phẩm PCR CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Tỷ lệ bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp chẩn đoán phương pháp 3.1.2 Bệnh cảnh lâm sàng kết PCR và/hoặc nuôi cấy dương tính 3.1.3 Phân bố theo tuổi giới tính 3.1.4 Điều trị kháng sinh khơng đặc hiệu 3.1.5 Sự tương quan kết PCR và/hoặc nuôi cấy 3.1.6 Sự tương quan kết PCR dương tính và/hoặc huyết học dương tính (IgM) 3.1.7 Định loại phân tử dựa gen mã hóa protein P1 3.1.8 Tính đặc hiệu kỹ thuật PCR tổ 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Bệnh cảnh lâm sàng 3.2.2 Kháng sinh điều trị trước nhập viện 3.2.3 Phương pháp nuôi cấy 3.2.4 Phương pháp huyết học 3.2.5 Phương pháp PCR 3.3 KẾT LUẬN 3.4 ĐỀ NGHỊ 3.5 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 45 45 46 47 47 48 48 48 50 51 52 54 54 54 55 56 57 58 60 62 63 65 66 67 68 69 72 76 77 77 78 82 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP bp CAP CF C pneumoniae DNA dNTP EIA G+C HS IFA IgG IgM kDa M pneumoniae PA PCR PPLO rDNA RFLP rRNA RT-PCR TE Tm TRI Adenosin Triphosphat Base pair Community Acquired Pneumonia Complement Fixation Chlamydia pneumoniae Acid Deoxyribonucleic Dideoxyribonucleozid Triphosphat Enzyme Immuno Assay Guanine + Cytosine Horse Serum Immuno Fluorescence Assay Immunoglubulin G Immunoglubulin M Kilo Dalton Mycoplasma pneumoniae Partical Agglutination Polymerase Chain Reaction Pleuropneumonia like organisms Ribosomal Acid Deoxyribonucleic Restriction Fragment Length Polymorphism Ribosomal Acid Ribonucleic Revert Transcription - Polymerase Chain Reaction Tris Etylen diamine tetra acetic acid Melting Temperature Tetrazolium Reduction Inhibition vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số 1.1 1.2 1.3 Tên bảng Mycoplasmas phân lập từ người Các thống kê dịch tễ M pneumoniae Kỹ thuật khuếch đại axít nucleic dựa đoạn gen đặc hiệu M pneumoniae 2.1 Thành phần phản ứng PCR 2.2 Chương trình cho phản ứng PCR 3.1 Tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi dựa kết dương tính PCR, ni cấy xét nghiệm huyết học 3.2 Bệnh cảnh lâm sàng viêm phổi nhiễm M pneumoniae 3.3 Viêm phổi M pneumoniae (xác định PCR và/hoặc nuôi cấy) phân bố theo tuổi giới tính 3.4 Tỷ lệ bệnh nhân điều trị kháng sinh trước nhập viện 3.5 Mối tương quan kết PCR và/hoặc nuôi cấy 3.6 Mối tương quan hiệu giá IgM kết PCR 3.7 Định loại phân tử gen mã hóa protein P1 M pneumoniae gây viêm phổi trẻ em 3.8 Các mồi đặc hiệu cho loài Mycoplasma 3.9 Các mồi đặc hiệu cho M pneumoniae (protein P1) 3.10 Các chủng thử nghiệm với mồi đặc hiệu cho loài Mycoplasma 3.11 Mối tương quan hai cặp mồi đặc hiệu dùng để tiến hành phản ứng PCR Trang 28 41 51 52 54 55 56 57 59 61 62 64 64 64 65 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 Tên hình Sơ đồ phân loại M pneumoniae dựa so sánh trình tự 16 rRNA Nhóm khuẩn lạc M pneumoniae hình cầu sinh trưởng mơi trường thạch SP4 Sơ đồ phân chia tế bào nhân đơi cấu trúc đầu bám dính M pneumoniae Các mũi tên cấu trúc đầu bám dính M pneumoniae kinh hiển vi điện tử Tỷ lệ viêm phổi nhiễm M pneumoniae theo độ tuổi xét nghiệm khác Cấu trúc quan bám dính M pneumoniae Tổ chức cấu trúc operon P1 Các giai đoạn kỹ thuật PCR Sơ đồ khuếch đại sản phẩm PCR Trang 10 12 22 30 30 39 40 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học ĐẶT VẤN ĐỀ Mycoplasma pneumoniae (M pneumoniae) nguyên nhân gây viêm phổi khơng điển hình cộng đồng, bệnh lây lan qua khơng khí mơi trường giao tiếp gần gũi Dịch bệnh bùng phát thường xuất cách định kỳ, bệnh cảnh lâm sàng thay đổi từ không triệu chứng sang viêm phổi [1] Viêm phổi M pneumoniae thường gặp lứa tuổi, không phân biệt giới tính Bệnh gặp hầu hết nơi giới, xảy quanh năm, chủ yếu vào cuối mùa hè chớm thu Triệu chứng lâm sàng viêm phổi M pneumoniae thường sốt 380C ho khan Tuy nhiên, vào triệu chứng lâm sàng chưa thể kết luận xác nguyên nhân gây viêm phổi vi khuẩn M pneumoniae gây viêm phổi cách bám dính lên tế bào biểu mơ quan hô hấp Nếu không phát hiện, chẩn đốn điều trị kịp thời, bệnh tiến triển nặng biến chứng, chí dẫn tới tử vong Trên giới, tỷ lệ mắc viêm phổi M pneumoniae chiếm khoảng từ 10 – 30% tổng số trẻ viêm đường hô hấp cấp Ở Việt Nam, trẻ tuổi thường trải qua – lần viêm đường hơ hấp cấp, 20 – 30% dẫn đến viêm phổi Tuy nhiên, nước ta chưa có thống kê đầy đủ tỷ lệ mắc viêm phổi M pneumoniae trẻ em Trước đây, phương pháp thường sử dụng để phát viêm phổi M pneumoniae bao gồm nuôi cấy huyết học Phương pháp nuôi cấy phát xác M pneumoniae địi hỏi thời gian dài (từ – tuần); phương pháp huyết học đơn giản phương pháp nuôi cấy Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học khơng có giá trị thực tiễn cho cơng tác điều trị mà có giá trị cho cơng tác giám sát dịch tễ học Hiện nay, giới, kỹ thuật PCR sử dụng cách rộng rãi Phương pháp cho phép phát M pneumoniae nhanh chóng (1 ngày), có độ nhạy độ đặc hiệu cao, mang lại kết chẩn đốn xác, khắc phục nhược điểm hai phương pháp Cho đến nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu đầy đủ có hệ thống vấn đề này, đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát Mycoplasma pneumoniae gây viêm đường hô hấp cấp trẻ em 15 tuổi” với mục tiêu: Phát nhanh xác viêm phổi M pneumoniae; Đánh giá vai trò gây bệnh M pneumoniae viêm đường hô hấp cấp; Phân loại protein bám dính P1 M pneumoniae dựa phân tử Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học tăng hiệu giá PA nghiên cứu không tiến hành lấy mẫu máu kép mẫu máu kép (lần thứ hai) lấy sau mẫu máu đơn (lần thứ nhất) – tuần, đa số bệnh nhân khỏi bệnh viện nên không lấy mẫu lần Và lý phải lấy mẫu máu kép nên phương pháp chẩn đoán huyết học bị giới hạn thực tiễn Trong nghiên cứu chúng tôi, hiệu giá PA cao ≥ 1:5120 tìm thấy 17 trường hợp (36,1%) So sánh với báo cáo khác, hiệu giá PA bệnh nhân nghiên cứu tương đối cao Điều việc sử dụng kháng sinh không hiệu trước nhập viện số bệnh nhân khoảng thời gian nhiễm trùng dài (7,5 ± 4,1 ngày) Yamazaki cộng báo cáo hiệu giá PA tăng lần thấy 30/36 cặp huyết tổng số trẻ dương tính PCR, khơng có cặp huyết cho thấy tăng hiệu giá kháng thể PA lớn lần tổng số bệnh nhân âm tính PCR [9] Điều yêu cầu mẫu huyết kép sử dụng phương pháp PA phải hữu dụng mặt lâm sàng để chẩn đoán nhiễm M pneumoniae kháng thể PA tăng theo ngày đầu Một nghiên cứu dịch tễ học Hàn Quốc cho thấy hiệu giá kháng thể IgM với mẫu máu đơn 1:640, hiệu giá cao so với nghiên cứu khác không phụ thuộc vào độ tuổi bệnh nhân Họ khơng tiến hành mẫu máu kép [36] Chính lý trên, phương pháp huyết học không nên sử dụng độc lập mà hợp lý phải kết hợp huyết học (xác định IgG lẫn IgM) với phương pháp PCR chẩn đoán nhiễm trùng M pneumoniae 3.2.5 Phương pháp PCR Sử dụng phương pháp PCR nghiên cứu cho mục đích phát chẩn đoán M pneumoniae lần áp dụng Việt Nam Phương pháp PCR chuẩn thức tất phịng thí nghiệm thuộc 72 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Viện nghiên cứu bệnh nhiễm trùng Quốc gia Nhật Bản Do đó, chúng tơi coi phương pháp xét nghiệm có tiêu chuẩn độ nhạy (6 copys) độ đặc hiệu (100%) chuẩn thức áp dụng điều kiện Việt Nam Phương pháp PCR chí phát M pneumoniae mô trải qua thí nghiệm nghiên cứu mơ mơ bị nhiễm, áp dụng nuôi cấy bệnh phẩm có chất ức chế phát triển vi khuẩn (kháng sinh), đó, khắc phục trường hợp ni cấy âm tính Phương pháp yêu cầu mẫu bệnh phẩm, hồn thành ngày, cho kết dương tính sớm phương pháp huyết học ni cấy mà khơng địi hỏi sinh vật phải cịn sống Việc chẩn đốn nhanh xác góp phần điều trị hiệu quả, giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân PCR sử dụng phương pháp để phát M pneumoniae với mục đích giám sát mà không cần kết hợp với phương pháp khác số liệu lâm sàng hầu hết nghiên cứu sử dụng PCR không cho kết định lượng Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp PCR hai bước (PCR tổ hay PCR lồng), việc tái khuếch đại sản phẩm PCR thứ với mồi thứ hai nhằm nâng cao độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp Nghiên cứu thu 47/252 trường hợp (18,6%) dương tính với M pneumoniae (bảng 3.1), cao so với nghiên cứu Thái Lan Kết PCR dương tính nghiên cứu Thái Lan thu 36/245 trường hợp (15%) [37] Trong bảng 3.4, kết PCR dương tính kết hợp với kết ni cấy âm tính lên tới 31/252 trường hợp giải thích nhược điểm 73 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học phương pháp ni cấy Ngược lại, kết PCR âm tính kết hợp ni cấy dương tính (5/252) có mặt số chất kìm hãm (chất ức chế) vài vấn đề kỹ thuật Reznikov cộng [38] ức chế PCR thường xảy nhiều với bệnh phẩm dịch hút tỵ hầu so với tăm bơng ngốy họng vậy, tăm bơng ngốy họng bệnh phẩm khun dùng chẩn đoán M pneumoniae Một lý tiến hành lấy mẫu, bảo quản bệnh phẩm thao tác tiến hành kỹ thuật PCR, việc pha loãng mẫu làm cho nồng độ DNA giảm mức phát phương pháp PCR Pha loãng bệnh phẩm khắc phục ức chế PCR lại hạn chế độ nhạy axít nucleic bị pha lỗng với chất ức chế Hiện có sinh phẩm thương mại dùng cho việc tách chiết DNA mà loại bỏ chất ức chế PCR Dorigo – Zetsma cộng [27] thực kiểm tra 18 bệnh nhân viêm phổi M pneumoniae, phát phương pháp PCR và/hoặc huyết học cho thấy, đờm bệnh phẩm có khả cho kết dương tính cao (62,5% so với 41% từ bệnh phẩm lấy mũi họng, 28% từ tăm bơng ngốy họng, 44% từ dịch thu sau rửa họng) Các phương pháp phát M pneumoniae dựa PCR bao gồm: RFLP, RT - PCR, Nested PCR, Single step PCR, Multiplex PCR… cặp mồi khác MPN, ADH… sử dụng đoạn gen đích như: r 16sRNA, gen điều hịa tổng hợp ATP, gen mã hóa protein P1… PCR phát DNA M pneumoniae coi chẩn đoán phịng thí nghiệm Có nhiều loại mồi dùng phương pháp PCR, chúng tơi sử dụng số cặp mồi có độ nhạy cao để phát DNA M pneumoniae Trong đó, việc sử dụng phương pháp PCR tổ làm tăng độ đặc hiệu, cịn gen đích gen mã hóa protein P1 cặp mồi đặc hiệu cho M pneumoniae làm tăng độ nhạy phương pháp PCR 74 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Kết nghiên cứu sử dụng mồi đặt riêng cho M pneumoniae (ADH) không cho kết dương tính với lồi Mycoplasma khác (khơng có bắt cặp chéo lồi Mycoplasma với nhau) Do đó, kỹ thuật PCR tổ kết hợp đoạn trình tự gen mục tiêu đoạn gen mã hóa protein P1 tối ưu để phát chẩn đoán viêm phổi cấp M pneumoniae Việc phân loại týp M pneumoniae gây bệnh hữu dụng cho mục đích nghiên cứu dịch tễ học điều trị kháng sinh cho bệnh nhân Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp PCR dựa vào độ dài đa hình đoạn trình tự lặp Rep MP2/3 Rep MP4; phân loại chủng M pneumoniae thành hai týp (I, II) Trong đó, có 28/47 (59,6%) thuộc týp I; 19/47 (40,4%) thuộc týp II, dựa kết PCR dương tính Tsuguo Sasaki cộng sử dụng phương pháp dựa phân tử PCR – RFLP để phân loại 250 chủng M pneumoniae phân lập suốt 20 năm Nhật Bản, kết thu nhóm I chủng M129; nhóm II chủng FH [56] Hiệu kỹ thuật PCR dựa việc so sánh kỹ thuật tách chiết DNA, khuếch đại, lựa chọn mồi sử dụng tiêu chuẩn khác Hầu hết kỹ thuật giống bản, chúng khác đoạn trình tự đích mồi Tuy nhiên, so sánh phương pháp PCR với phương pháp huyết học và/hoặc phương pháp ni cấy kết thu khác Do đó, trải nghiệm phạm vi lớn phương pháp bị giới hạn với M pneumoniae Có nhiều nghiên cứu từ cuối thập niên 1980 công nhận khả phát M pneumoniae phương pháp PCR kết hợp với phương pháp huyết học và/hoặc phương pháp nuôi cấy Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng qua q trình ni cấy kiểm tra phương pháp PCR 75 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Việc sử dụng kết hợp hai mục tiêu khác cực đại hóa khả phát vi sinh vật [54] Trong nghiên cứu, sử dụng kết hợp hai phương pháp nuôi cấy PCR để phát M pneumoniae, kết chẩn đoán 52/252 bệnh nhân viêm phổi M pneumoniae, chiếm tỷ lệ 20,6% Tỷ lệ tương đối cao so với nghiên cứu Thái Lan Nhật Bản Nghiên cứu tỷ lệ lưu hành đặc điểm lâm sàng Thái Lan cho kết chẩn đoán phương pháp PA với mẫu máu kép 36/245 (15%) bệnh nhân; 24/245 (10%) hiệu giá kháng thể ≥ lần giai đoạn nhiễm trùng giai đoạn hồi phục; 20/245 (5%) PCR dương tính; tỷ lệ lưu hành – 40% [37] Dịch tễ học M pneumoniae quan sát khoảng thời gian từ – năm Ở Đan Mạch, dịch bệnh xuất đặn theo chu kỳ 4,5 năm/lần khoảng thời gian từ năm 1958 – 1974 Ở Hoa Kỳ, dịch tễ học diễn khoảng thời gian năm Settle, vào năm 1966, 1967 năm 1974 Ở Nhật Bản, bệnh dịch xuất lên tới đỉnh điểm kéo dài năm suốt năm 1980 – 1992 Ở Hàn Quốc, dịch tễ học diễn khoảng thời gian – năm [36] Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu, số thống kê thức dịch tễ học M pneumoniae 3.3 KẾT LUẬN Đối với bệnh nhân nhập viện viêm đường hô hấp cấp, dựa vào bệnh cảnh lâm sàng để chẩn đoán đưa hướng điều trị làm bệnh tiến triển nặng gây biến chứng bệnh nhân bị viêm phổi nhiễm M pneumoniae Với tỷ lệ mắc M pneumoniae chiếm 10 – 30% tổng số trẻ viêm đường hô hấp cấp, việc chẩn đốn nhanh xác ngun gây bệnh 76 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học để có hướng điều trị kịp thời, hợp lý điều cần thiết Vì vậy, sử dụng kỹ thuật PCR biện pháp tối ưu chẩn đoán M pneumoniae 3.4 ĐỀ NGHỊ • Tiếp tục triển khai nghiên cứu sâu rộng • Phân biệt hai giai đoạn sơ nhiễm tái nhiễm viêm phổi M pneumoniae • Đánh giá tỷ lệ người mang bệnh không triệu chứng với tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi M pneumoniae • Tiến hành nghiên cứu phát triển kỹ thuật sinh học phân tử dựa phương pháp PCR 3.5 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát loài M pneumoniae mang gen kháng kháng sinh nhóm Macrolides 77 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học PHỤ LỤC Một số hình ảnh minh họa kết phương pháp PCR: Hình 1: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi MPN (1F, 1R) Hình 2: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi MPN 78 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 3: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ADH Hình 4: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ADH(3F, 3R) 79 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 5: Kết điện di sản phẩm định loại phân tử PCR Hình 6: Kết điện di sản phẩm định loại phân tử PCR 80 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 7: Kết điện di sản phẩm định loại phân tử PCR 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480 ＋320 ＋80 ー ＋40 ＋320 Spl Hình 8: Ảnh chụp kết phương pháp huyết học 81 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hịa (2000), Vi sinh vật y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen, nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật Phạm Văn Ty (2004), Miễn dịch học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội Tiếng Anh Ali, N J., M Sillis, B E Andrews, P F Jenkins, and B D Harrison (1986), The clinical spectrum and diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection, Q J Med, 58:241-251 Aubert, G., B Pozzetto, J Hafid, and O G Gaudin (1992), Immunoblotting patterns with Mycoplasma pneumoniae of serum specimens from infected and non-infected subjects, J Med Microbiol, 36:341–346 Balish, M F., and D C Krause (2002), Cytadherence and the cytoskeleton, p 491–518.,In S Razin and R Herrman (ed.), Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, N.Y Baseman, J B., M Banai, and I Kahane (1982), Sialic acid residues mediate Mycoplasma pneumoniae attachment to human and sheep erythrocytes, Infect Immun, 38:389–391 10 Baseman, J B., J Morrison-Plummer, D Drouillard, B PuleoScheppke, V V Tryon, and S C Holt (1987), Identification of a 32kilodalton protein of Mycoplasma pneumoniae associated with hemadsorption, Isr J Med Sci 11 Baseman, J B., S P Reddy, and S F Dallo (1996), Interplay between Mycoplasma surface proteins, airway cells, and the protean manifestations of mycoplasma-mediated human infections, Am J Respir Crit Care Med, 154:S137–S144 12 Baseman, J B., and J G Tully (1997), Mycoplasmas: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety, Emerg Infect Dis 3:21–32 82 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học 13 Bebear, C., M Dupon, H Renaudin, and B de Barbeyrac (1993), Potential improvements in therapeutic options for mycoplasmal respiratory infections, Clin Infect Dis 17(Suppl 1):S202–S207 14 Becton, D L., H S Friedman, J Kurtzberg, S Chaffee, J M Falletta, and T R Kinney (1986), Severe Mycoplasma pneumonia in three sisters with sickle cell disease, Pediatr Hematol Oncol 3:259–265 15 Block, S., J Hedrick, M R Hammerschlag, G H Cassell, and J C Craft (1995), Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in pediatric community-acquired pneumonia: comparative efficacy and safety of clarithromycin vs erythromycin ethylsuccinate, Pediatr Infect Dis J 14:471-477 16 Chanock, R M., M K Cook, H H Fox, R H Parrott, and B J Huebner (1960), Serologic evidence of infection with Eaton agent in lower respiratory illness of childhood, N Engl J Med 262:648–654 17 Chanock, R M., L Dienes, M D Eaton, D G Edward, E A Freundt, L Hayflick, J F P Hers, K E Jensen, C Liu, B P Marmion, M A Mufson, P F Smith, N L Somerson, and D Taylor-Robinson (1963), Mycoplasma pneumoniae: proposed nomenclature for atypical pneumonia organism (Eaton agent), Science 140:662 18 Chanock, R M., L Hayflick, and M F Barile (1962), Growth on artificial medium of an agent associated with atypical pneumonia and its identification as a PPLO, Proc Natl Acad Sci USA 48:41–49 19 Chanock, R M., D M Rifkind, H M Kravetz, V Knight, and K M Johnson (1961), Respiratory disease in volunteers infected with Eaton agent: a preloiminary report, Proc Natl Acad Sci USA 47:887–890 20 Clyde, W A., Jr (1979), Mycoplasma pneumonaie infections of man, p 275–306 In J G Tully and R F Whitcomb (ed.), The mycoplasmas II Human and animal mycoplasmas, vol II Academic Press, New York, N.Y 21 Collier, A M (1983), Attachment by Mycoplasmas and its role in disease, Rev Infect Dis 5(Suppl 4):S685–S691 22 Dallo, S F., C J Su, J R Horton, and J B Baseman (1988), Identification of P1 gene domain containing epitope(s) mediating Mycoplasma pneumoniae cytoadherence, J Exp Med 167:718–723 23 Dandekar, T., B Snel, S Schmidt, W Lathe, M Suyama, M Huynen, and P Bork (2002), Comparative genome analysis of the Mollicutes, p 255–278 In S Razin and R Herrmann (ed.), Molecular biology and pathogenesis of mycoplasmas, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, N.Y 83 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học 24 de Barbeyrac, B., C Bernet-Poggi, F Febrer, H Renaudin, M Dupon, and C Bebear (1993), Detection of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium in clinical samples by polymerase chain reaction, Clin Infect Dis 17(Suppl 1):S83–S89 25 Denny, F W., W A Clyde, Jr., and W P Glezen (1971), Mycoplasma pneumoniae disease: clinical spectrum, pathophysiology, epidemiology, and control, J Infect Dis 123:74–92 26 Dienes, L., and G Edsall (1937), Observations on the L-organisms of Klieneberger, Proc Soc Exp Biol Med 36:740–744 27 Dorigo-Zetsma, J W., R P Verkooyen, H P van Helden, H van der Nat, and J M van den Bosch (2001), Molecular detection of Mycoplasma pneumoniae in adults with community-acquired pneumonia requiring hospitalization, J Clin Microbiol 39:1184–1186 28 Eaton, M D., G Meikejohn, and W Van Herick (1944), Studies on the etiology of primary atypical pneumonia: a filterable agent transmissible to cotton rats, hamsters, and chick embryos, J Exp Med 79:649–667 29 Ferwerda, A., H A Moll, and R de Groot (2001), Respiratory tract infections by Mycoplasma pneumoniae in children: a review of diagnostic and therapeutic measures, Eur J Pediatr 160:483–491 30 Hardy, R D., H S Jafri, K Olsen, J Hatfield, J Iglehart, B B Rogers, P Patel, G Cassell, G H McCracken, and O Ramilo (2002), Mycoplasma pneumoniae induces chronic respiratory infection, airway hyperreactivity, and pulmonary inflammation: a murine model of infectionassociated chronic reactive airway disease, Infect Immun 70:649–654 31 Himmelreich, R., H Hilbert, H Plagens, E Pirkl, B C Li, and R Herrmann (1996), Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae, Nucleic Acids Res 24:4420–4449 32 Hjordis M Foy (1991), Manual of clinical microbiology, Vol II, Cheapter 21, PP 434 – 465 33 Honda, J., T Yano, M Kusaba, J Yonemitsu, H Kitajima, M Masuoka, K Hamada, and K Oizumi (2000), Clinical use of capillary 34 Hu, P C., A M Collier, and J B Baseman (1977), Surface parasitism by Mycoplasma pneumoniae of respiratory epithelium, J Exp Med 145:1328 – 1343 35 Ieven, M., D Ursi, H Van Bever, W Quint, H G Niesters, and H Goossens (1996), Detection of Mycoplasma pneumoniae by two polymerase chain reactions and role of M pneumoniae in acute respiratory tract infections in pediatric patients, J Infect Dis 173:1445–1452 84 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học 36 Jinho Yu, Young Yoo*, Do Kyun Kim, Hee Kang, Young Yull Koh (2005), “Distributions of Antibody Titers to Mycoplasma pneumoniae in Korean Children in 2000-2003”, Department of Pediatrics, Dongguk University International 37 Jitladda Deerojanawong MD(2006), “Prevalence and Clinical Features of Mycoplasma Pneumoniae in Thai Children”, Vol 89, No 10 38 Ken B Waites1 and Deborah F Talkington (2004), Mycoplasma pneumoniae and Its Role as a Human Pathogen, Vol 17, No.4, pp 697-728 39 Klieneberger, E (1935), The natural occurrence of pleuropneumonia-like organisms in apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria, J Pathol Bacteriol 40:93–105 40 Krause, D C (1998), Mycoplasma pneumoniae cytadherence: organization and assembly of the attachment organelle, Trends Microbiol 6:15–18 41 Krause, D C (1996), Mycoplasma pneumoniae cytadherence: unravelling the tie that binds, Mol Microbiol 20:247–253 42 Krause, D C., D K Leith, and J B Baseman (1983), Reacquisition of specific proteins confers virulence in Mycoplasma pneumoniae, Infect, Immun 39:830–836 43 Krause, D C., D K Leith, R M Wilson, and J B Baseman (1982), Identification of Mycoplasma pneumoniae proteins associated with hemadsorption and virulence, Infect, Immun, 35:809–817 44 Liu, C., M D Eaton, and J T Heyl (1957), Studies on atypical pneumonia II Observations concerning the development and immunological characteristics of antibody in patients, J Exp Med 109:545 45 Loda, F A., W A Clyde, Jr., W P Glezen, R J Senior, C I Sheaffer, and F W Denny, Jr (1968), Studies on the role of viruses, bacteria, and M pneumoniae as causes of lower respiratory tract infections in children, J Pediatr 72:161-176 46 Luby, J P (1991), Pneumonia caused by Mycoplasma pneumoniae infection, Clin Chest Med 12:237-244 47 Marrie, T J (1993), Mycoplasma pneumoniae pneumonia requiring hospitalization hospitalization, with emphasis on infection in the elderly, Arch Intern Med 153:488–494 48 Nocard, E., and E R Roux (1898), Le microbe de la peripneumonie Ann, Inst Pasteur (Paris) 12:240–262 85 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học 49 Pollack, J D., M A Myers, T Dandekar, and R Herrmann (2002), Suspected utility of enzymes with multiple activities in the small genome Mycoplasma species: the replacement of the missing “household” nucleoside diphosphate kinase gene and activity by glycolytic kinases Omics 50 Razin, S (1994), DNA probes and PCR in diagnosis of mycoplasma infections, Mol Cell Probes 8:497–511 51 Rottem, S (2003), Interacton of mycoplasmas with host cells, Physiol Rev 83:417–432 52 Rudd, K E (2000), EcoGene: a genome sequence database for Escherichia coli K-12, Nucleic Acids Res 28:60–64 53 Shlomo Rottem (2006) "Interaction of Mycoplasmas With Host Cells”, Department of Membrane and Ultrastructure Research, The Hebrew University - Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel 54 Talkington, D F., W L Thacker, D W Keller, and J S Jensen (1998), Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in autopsy and open-lung biopsy tissues by nested PCR, J Clin Microbiol 36:1151–1153 55 Talkington, D F., K B Waites, S B Schwartz, and R E Besser (2001), Emerging from obscurity: understanding pulmonary and exrrapulmonary syndromes, pathogenesis, and epidemiology of human Mycoplasma pneumoniae infections, p 57-84 In W M Scheld, W A Craig, and J M Hughes (ed.), Emerging Infections American Society for Microbiology, Washington, D.C 56 Tsuguo Sasaki (1995), "Epidemiological Study of Mycoplasma pneumoniae Infections in Japan Based on PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism of the P1 Cytadhesin Gene", Department of Safety Research on Biologics 57 Tsutomu Yamazaki (2006), "Comparison of PCR for Sputum Samples Obtained by Induced Cough and Serological Tests for Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Infection in Children", Department of Pediatrics, Saitama Medical School, Saitama 58 Waites, K B., C M Bebear, J A Robertson, D F Talkington, and G E Kenny (ed.) (2001), Cumitech 34, Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections, American Society for Microbiology, Washington, D.C 59 Wilson, M H., and A M Collier (1976), Ultrastructural study of Mycoplasma pneumoniae in organ culture, J Bacteriol 125:332–339 60 Waites, K B., D F Talkington, and C M Bebear (2002), Mycoplasmas, p 201-224 In A L Truant (ed.), Manual of commercial methods in clinical microbiology, American Society for Microbiology, Washington, D.C 86 ... tài ? ?Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát Mycoplasma pneumoniae gây viêm đường hô hấp cấp trẻ em 15 tuổi? ?? với mục tiêu: Phát nhanh xác viêm phổi M pneumoniae; Đánh giá vai trò gây bệnh M pneumoniae. .. đường hô hấp cấp Ở Việt Nam, trẻ tuổi thường trải qua – lần viêm đường hơ hấp cấp, 20 – 30% dẫn đến viêm phổi Tuy nhiên, nước ta chưa có thống kê đầy đủ tỷ lệ mắc viêm phổi M pneumoniae trẻ em. .. trùng đường hô hấp M pneumoniae giống 15 Vũ Thúy Phượng - Luận văn thạc sỹ khoa học tác nhân gây bệnh đường hô hấp khác gây nên Chlamydia pneumoniae, vi rút đường hô hấp vi khuẩn phế cầu khuẩn M pneumoniae