Đề tài Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát thêm một phương pháp có khả năng định danh các vi khuẩn gây bệnh thường gặp.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ÁP DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP Nguyễn Thị Ngọc Thu*, Nguyễn Trọng Hiệp*, Bùi Tùng Hiệp** TÓM TẮT Mở đầu: Việc định danh nhanh chóng vi khuẩn điều cốt yếu việc điều trị bệnh nhân, đặc biệt nhiễm trùng nặng Trong phương pháp sử dụng phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng để chẩn đốn bệnh nhiễm khuẩn, ni cấy vi khuẩn phương pháp thường sử dụng Tuy nhiên, ni cấy đòi hỏi thời gian từ 18-24 cho vi khuẩn mọc phải thêm nhiều thời gian cho thử nghiệm tính chất sinh-hóa để để định danh Mục tiêu: Khảo sát thêm phương pháp có khả định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp Phương pháp: Mười vi khuẩn gây bệnh thường gặp, bao gồm vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus subtilis ATCC 6633, Corynebacterium diphtheriae ATCC 51696) khuếch đại vùng nối nội gen mã hóa cho RNA ribosom tiểu đơn vị nhỏ lớn, với mồi P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) P2 (5’GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’) Kết quả: Mỗi loài vi khuẩn khảo sát cho mẫu riêng biệt Các mẫu gồm nhiều vạch DNA khuếch đại tạo ra, có tính khác biệt rõ ràng loài Kết luận: Các số liệu cho thấy tính hữu dụng phương pháp này, sử dụng, mang tính hiệu qủa chun biệt cao, giúp phân biệt loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp Từ khóa: Vi khuẩn gây bệnh thường gặp, họ Enterobacteriaceae, vùng nối nội gen mã hóa cho RNA ribosom (rRNA) tiểu đơn vị nhỏ lớn, PCR, Staphylococcus aureus kháng methicillin ABSTRACT APPLYING THE MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION OF COMMON PATHOGENIC BACTERIA Nguyen Thi Ngoc Thu, Nguyen Trong Hiep, Bui Tung Hiep * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 252 - 257 Background: Rapid identification of bacteria is crucial in patient therapeutics, especially in severe infections Among the various methods currently used in clinical laboratories for detection of bacterial infections, culture is the most frequent one However, culture method requires at least 18-24 h of incubation, additional time is needed to perform biochemical tests to identify the bacteria Objectives: To develop an alternative method for identification of common pathogenic bacteria Method: Eleven common pathogenic bacteria, including six Gram-negative bacteria (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, and Pseudomonas aeruginosa), and five Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) were amplified in the intergenic 16S-23S spacer regions **Bệnh viện cấp cứu Trưng Vương, TP HCM *Khoa Dược- ĐH Y Dược TP HCM, TP HCM Tác giả liên hệ: TS Nguyễn Trọng Hiệp ĐT: 0907429991 Email: ntronghiep@yahoo.com 252 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học of bacterial rRNA genes by using the PCR with primers P1(5’-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3’) and P2 (5’-GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’) Results: Each studied species gave a specific ribotyping pattern The pattern of DNA multiple bands is produced which is very discriminatory Conclusion: These data demonstrated the utility of this method can very efficiently and specifically differentiate between the common pathogenic bacteria Keywords: Common pathogenic bacteria, Enterobacteriaceae, the intergenic 16S-23S spacer regions of bacterial rRNA genes, PCR, methicillin-resistant Staphylococcus aureus ribosom (rRNA) cho tiểu đơn vị nhỏ lớn (16S ĐẶT VẤN ĐỀ 23S rRNA), gọi chung phương pháp định Việc định danh xác vi khuẩn gây týp ribosom (ribotyping) Số lượng kích bệnh mẫu bệnh phẩm yêu cầu quan thước vùng DNA khuếch đại mang tính trọng, thiết yếu phòng xét nghiệm vi đặc trưng cho lồi giúp định danh vi sinh lâm sàng Một số vi khuẩn mọc chậm khuẩn gây bệnh(3,6,7,8,9,10) Chưa có nhiều nghiên hoặc/ u cầu ni cấy khó khăn cứu định danh vi khuẩn gây bệnh kỹ phương pháp nuôi cấy cổ điển thường qui gặp thuật Việt nam Đề tài nhằm khảo sát nhiều khó khăn hay nhiều thời gian nhiều thêm phương pháp áp dụng kỹ thuật sinh tuần, nhầm lẫn Nhiều nghiên cứu cho học phân tử, có khả định danh vi thấy phương pháp định danh cổ điển dựa khuẩn gây bệnh thường gặp hình thể học phản ứng sinh hóa VẬTLIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU kit thương mại thông dụng, phổ biến giới API hệ thống định Chủng vi khuẩn danh tự động VITEK (automated 11 chủng đại diện cung cấp phòng identification system) đắt tiền dành cho vi thí nghiệm Vi sinh – Ký sinh gồm vi khuẩn khuẩn gây bệnh có tỉ lệ không định Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, danh nhầm lẫn(1) Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Các phương pháp sinh học phân tử với ưu Pseudomonas aeruginosa) chủng vi khuẩn cho kết qủa định danh nhanh chóng (khoảng Gram dương (Staphylococcus aureus ATCC 25923, ngày so với trung bình ngày phương Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus ATCC pháp cổ điển), xác vi khuẩn gây bệnh 43300, Streptococcus faecalis ATCC 51299, Bacillus cần thiết bệnh nhiễm nặng subtilis ATCC 6633, Corynebacterium diphtheriae (nhiễm trùng huyết, viêm màng não v…v…), để ATCC 51696) từ có kết qủa kháng sinh đồ phù hợp, phác Định danh vi khuẩn đồ điều trị kháng sinh hiệu qủa góp phần Trước hết, chủng vi khuẩn đại diện chiến lược sử dụng kháng sinh tốt bệnh Gram âm Gram dương, định danh viện Tất ảnh hưởng đến việc làm giảm kit API 20E (BioMerieux®) thời gian chi phí điều trị, tỉ lệ tử vong phương pháp thường qui kiểm sốt việc gia tăng tính đề kháng kháng sinh(2,4) Kỹ thuật sinh học phân tử Trong vòng 10 năm qua, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng rộng rãi xác định tính đa hình hoặc/và để định danh vi khuẩn tới loài, dựa việc khuếch đại vùng bảo thủ vùng nối nội gen mã hóa cho RNA Chuyên Đề Dược Khoa Sau tất chủng đại diện thực kỹ thuật PCR khuếch đại vùng nối nội gen mã hóa cho RNA ribosom tiểu đơn vị nhỏ lớn (16S 23S rRNA) với mồi P1 (5’-TTG TAC ACA CCG CCC 253 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 GTC A-3’) P2 (5’- GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’), thiết kế bổ sung với đoạn có trình tự bảo thủ gần đầu 3’ vùng 16S đầu 5’ vùng 23S gen mã hóa cho RNA ribosom Chiết DNA vi khuẩn Hoạt hóa vi khuẩn mơi trường Trypticase soy broth, sau thực chiết DNA gen vi khuẩn kit Wisard® SV genomic DNA purification system (A2361Promega) theo qui trình nhà cung cấp Thực phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi P1 P2, phản ứng thực máy luân nhiệt (ATC401 model; Apollo-CLP) Thông số chạy PCR gồm biến tính ban đầu phút 940C; 30 chu kỳ (1 phút 940C, phút 500C, phút 30 giây 720C); phút 720C) với GoTaq® Flexi DNA polymerase (M8295- Promega) Sản phẩm khuếch đại điện di điện trường 100V gel agarose 2.5 % có chứa ethidium bromide Sản phẩm phát tia UV 254 nm, chụp hình hệ thống chụp gel (UV Transilluminator- Wealtec), phân tích phần mềm Cross checker 2.91 khuếch đại ảnh hưởng nhiều thông số thành phẩn MgCl2 enzyme Taq polymerase phản ứng, cụ thể nghiên cứu MgCl2 (1.5mM) enzyme Taq polymerase (2.5U) cho kết qủa tốt Kỹ thuật định týp ribosom giúp định danh cách nhanh chóng vi khuẩn gây bệnh thường gặp Gram âm Gram dương số lượng kích thước vùng DNA khuếch đại mang tính đặc trưng cho lồi(3,6,7,8,9,10) Kết qủa cho thấy, với vi khuẩn Gram âm: Shigella flexneri quan sát có ba sản phẩm khuếch đại vị trí 1100, 800 700 bp Salmonella typhi cho ba băng kích thước 1200, 900 700 bp Proteus mirabilis cho bốn băng với kích thước 1100, 900, 850 750 bp Riêng Pseudomonas aeruginosa có băng vị trí 850 bp (Hình 1) K pneumoniae cho ba băng vị trí kích thước 850, 700, 550 bp Với E coli, nhận thấy vi khuẩn cho bốn băng với kích thước 1200, 850, 800 700 bp (Hình 2) A B C D M KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN Những chủng đại diện vi khuẩn Gram âm (E coli, K pneumoniae, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) chủng lâm sàng ESBL E coli, Klebsiella pneumoniae định danh kit API 20E (BioMerieux®), tất cho kết qủa định danh với tỉ lệ % Id từ 73.2 đến 99.9% Những chủng đại diện vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Corynebacterium diphtheriae) cho kết qủa định danh phù hợp phương pháp thường qui Với kỹ thuật PCR định týp ribosom, nhận thấy băng DNA 254 1.5 kb kb 700 bp Hình Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR vi khuẩn Shigella flexneri; Salmonella typhi; Proteus mirabilis; Pseudomonas aeruginosa A: Shigella flexneri B: Salmonella typhi C: Proteus mirabilis D: Pseudomonas aeruginosa M: Marker 100 bp Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 MF EM 1.2 kb kb 500 bp Hình Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR vi khuẩn K pneumoniae E coli E: Klebsiella pneumoniae F: E coli M: Marker 100 bp M G H I J K M2 kb 500 bp Hình Kết qủa điện di sản phẩm khuếch đại PCR vi khuẩn Gram dương G: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus H: Staphylococcus aureus I: Corynebacterium diphtheriae J: Streptococcus faecalis K: Bacillus subtilis M: Marker 100 bp M2: Marker kb Trên vi khuẩn đại diện Gram dương cho kết qủa tương tự, băng DNA khuếch đại thu có khác biệt, giúp Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học nhận diện tới loài nhờ vào số lượng kích thước băng khác như: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus cho ba băng kích thước 800, 750, 550 bp Vi khuẩn Corynebacterium diphtheriae cho ba băng kích thước 750, 700, 550 bp Streptococcus faecalis cho bốn băng kích thước 730, 700, 600, 550 bp Bacillus subtilis có ba băng vị trí 730, 700, 550 bp (Hình 3) Ở Việt Nam, để định danh vi khuẩn gây bệnh, phần lớn bệnh viện áp dụng phương pháp cổ điển gồm nuôi cấy vi khuẩn kết hợp với thử nghiệm đặc tính sinh hóa Với bệnh viện lớn có điều kiện dùng kit nhóm API (20E, 20NE ), kit sử dụng thông dụng nước phát triển Theo nghiên cứu năm 1981, Kenneth E Aldridge cộng sự(5), so sánh khả định danh kit với phương pháp thông thường phản ứng sinh hóa nghiên cứu 505 vi khuẩn thuộc Họ Enterobacteriaceae gồm 202 chủng lâm sàng 303 chủng lưu trữ từ trước Nghiên cứu cho thấy kit API 20E xác nhanh thử nghiệm đặc tính sinh hóa cổ điển Tuy nhiên, kit diện hạn chế với sai sót định danh tỉ lệ xác định danh yếu lồi vi khuẩn khó ni cấy khơng ni cấy Thực vậy, với việc sử dụng kit API 20E, trường hợp Shigella sonnei định danh Citrobacter freundii trường hợp Serratia marcescens định danh Serratia liquefaciens, phần lớn sai sót liên quan chủng tồn trữ có số lượng có ý nghĩa chủng lâm sàng phân lập bị nhầm lẫn Mặt khác, theo nghiên cứu gần Awong-Taylor J cộng sự(1), để định danh vi khuẩn Gram dương không lên men glucose cách sử dụng kit API 20NE, có 54% lồi nhận diện tới giống để định danh đến lồi 7% chủng Bên cạnh đó, có tới 39% chủng thử nghiệm khơng định danh Với hệ 255 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 thống định danh tự động VITEK 2, tỉ lệ tương ứng 53%, 1%, 46% Trong nghiên cứu chúng tôi, với số lồi thử nghiệm với 11 lồi thử nghiệm kỹ thuật sinh học phân tử, tất nhận định đến lồi Với kỹ thuật định type ribosom, thấy thuận lợi phương pháp độ xác cao nhanh chóng (chỉ từ 5-7 thao tác thay từ 1-2 ngày phương pháp cổ điển) Nghiên cứu Fu Jun-fen năm 2002(3) thực 27 loài vi khuẩn gồm vi khuẩn Gram dương thường gây nhiễm trùng máu Listeria monocytgenes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus durans vi khuẩn Gram âm thường gây nhiễm trùng máu Salmonella typhi, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa , tất cho thấy khác biệt số lượng, kích thước băng khuếch đại, giúp nhận định nhanh chóng lồi (Bảng 1) Một nghiên cứu khác Mehwish Jamil cộng năm 2007(7), thực vi khuẩn Gram âm, gồm năm loài vi khuẩn gây bệnh thuộc Họ Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella enterica serovar typhi (Salmonella typhi), Proteus vulgaris, Klebsiella aerogenes Cirtobacter freundii) vi khuẩn Gram âm khác thường xuyên gây bệnh Pseudomonas aeruginosa Tất định danh cách nhanh chóng dễ dàng kích thước số lượng băng khuếch đại có số khác biệt so với nghiên cứu chúng tôi, điều tác giả sử dụng cặp mồi khác (Bảng 1) Bảng So sánh kết qủa nghiên cứu với tác giả khác Vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli Salmonella typhi Gram âm Gram dương Pseudomonas aeruginosa Klebsiella aerogenes Klebsiella pneumoniae Proteus vulgaris Proteus mirabilis Citrobacter freundii Shigella flexneri Staphylococcus aureus Meticillin-resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidids Streptococcus β-hemdyticus Streptococcus faecalis Enterococcus durans Bacillus subtilis Corynebacterium diphtheriae Listeria monocytogenes Kích thước sản phẩm khuếch đại (bp) Fu Jun-fen cộng Mehwish Jamil cộng Nghiên cứu băng (không nêu kích 1200, 850, 800, 700 1200, 850, 800, 700 thước) 1200, 900, 700 băng (khơng nêu kích 3000, 1200, 900, 850, 700 thước) 3150, 700 Không thực 3100, 900 320 Không thực Không thực 2500, 800 1200, 600 850 3000, 870, 700, 520 Không thực 900, 800, 750, 700 Không thực 3000, 850, 700, 580 Không thực Không thực 850 Không thực 850, 700, 550 Không thực 1100, 900, 850, 750 Không thực 1100, 800, 700 800, 750, 550 Không thực “ 800, 750, 550 1200, 600 băng (khơng nêu kích thước) Khơng thực 3100, 900 băng (khơng nêu kích thước) Khơng thực 1500 “ Không thực “ Không thực “ 730, 700, 600, 550 Không thực “ 730, 700, 550 “ “ 750, 700, 550 Không thực Để kết luận, trước hết thuận lợi phương pháp nhanh phương pháp nuôi cấy thử nghiệm đặc tính sinh hóa sử dụng kit định danh nhiều 256 đưa kết 5-7 thay 36- 48 Hơn nữa, phương pháp cổ điển cho tỉ lệ sai sót cao định danh vi khuẩn Mặt khác, kỹ thuật định týp Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ribosom định danh vi khuẩn khơng nuôi cấy vi khuẩn không lên men đường glucose Kỹ thuật có ưu so với kỹ thuật PCR đơn khuếch đại trình tự gen 16S rRNA áp dụng cho định danh, nhờ vào sử dụng cặp mồi Thật vậy, với kỹ thuật PCR dựa trình tự gen 16S rRNA, phải sử dụng cặp mồi đặc hiệu riêng cho lồi dùng mồi chung cho nhiều lồi phải kết hợp với việc giải so sánh trình tự sản phẩm PCR Do đó, chúng tơi thấy phương pháp định týp ribosom thực để định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp, góp phần vào việc điều trị bệnh nhiễm trùng Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Awong-Taylor J, Craven KS, Griffiths L, Bass C, Muscarella M (2008) Comparison of biochemical and molecular methods for the identification of bacterial isolates associated with failed loggerhead sea turtle eggs J Appl Microbiol, 104(5): 1244-1251 Bosshard PP, Abels S, Zbinden R, Bottger EC, Altwegg M (2003) Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic Gram-positive rods in the clinical laboratory (an 18- Chuyên Đề Dược Khoa 10 Nghiên cứu Y học month evaluation) Journal of Clinical Microbiology, 41(9): 413440 Fu Jun-fen, Yu He-yong, Shang Shi-qiang, Hong Wen-lan, Lu Miao-quan, Li Jian-ping (2002) A molecular biological study on identification of common septicemia bacteria using 16S23S rRNA gene spacer regions Journal of Zhejiang University (SCIENCE), 3(2): 237-242 Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D (1994) PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid J Clin Microbiol, 32: 335–351 Kenneth E Aldridge, Rondy L Hodges (1981) Correlation studies of Entero-Set 20, API 20E and conventional Media systems for Enterobacteriaceae identification Journal of Clinical Microbiology, 13(1): 120-125 Koeck JL, Chakour M, Teyssou R (2001) Apport de la biologie moléculaire au diagnostic bactériologique Rev Fr Lab, 335: 37-41 Mehwish Jamil, Saira Bashir, Mashkoor Mohsin, Ayesha Tariq, Aasia Bashir, Asma Haque, Yasra Sarwar, Aamir Ali, Abdul Haque (2007) Differentiation of common Gram negative pathogens by PCR-Ribotyping Pak J Med Sci, 23(2): 233-237 Mendoza M et al (1998) Identification of Staphylococcus species by 16S-23S rDNA intergenic spacer PCR analysis Int J Syst Bacteriol, 48(3): 1049-1055 Riffard S, Lopresti F, Normand P et al (1998) Species identification of Legionella via intergenic 16S-23S ribosomal spacer PCR analysis Int J Sys Bacteriol, 48(3): 723-730 Sogaard P, Gahrn-Hansen B, Hui-Ping Z, Frederiksen W (1986) An investigation of three commercial methods for rapide identification of non-enteric gram-negative rods Acta Pathol Microbiol Immunol Scand Sect, 94: 357-363 257 ... 550 bp (Hình 3) Ở Vi t Nam, để định danh vi khuẩn gây bệnh, phần lớn bệnh vi n áp dụng phương pháp cổ điển gồm nuôi cấy vi khuẩn kết hợp với thử nghiệm đặc tính sinh hóa Với bệnh vi n lớn có điều... loài giúp định danh vi sinh lâm sàng Một số vi khuẩn mọc chậm khuẩn gây bệnh( 3,6,7,8,9,10) Chưa có nhiều nghiên hoặc/ yêu cầu ni cấy khó khăn cứu định danh vi khuẩn gây bệnh kỹ phương pháp nuôi... với vi c giải so sánh trình tự sản phẩm PCR Do đó, chúng tơi thấy phương pháp định týp ribosom thực để định danh vi khuẩn gây bệnh thường gặp, góp phần vào vi c điều trị bệnh nhiễm trùng Vi t