CÁC kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử TRONG CHẨN đoán VI KHUẨN LAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN LAO VÀ BỆNH PHỔI CHUYÊN ĐỀ CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ` Họ tên: Nguyễn Ngọc Trường Thi Lớp: NT khóa 40 Chuyên ngành: Lao Bệnh phổi Hà Nội – 2018 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT (+) (-) AFB DNA dNTP RNA EMB Gene Xpert, Dương tính Âm tính Acid fast bacilli (Trực khuẩn kháng cồn toan) Deoxyribonucleic acid Deoxynucleotide triphosphate Ribonucleic acid Ethambutol Gene Xpert MTB/RIF (Xét nghiệm chẩn đoán Mycobacteria Xpert MTB INH HIV tuberculosis đột biến kháng RMP) Isoniazid Human Immunodeficiency Virus LPA MTB MGIT (Virút gây suy giảm miễn dịch người) Line Probe Assay (thí nghiệm lai với đoạn dò) Mycobacterium Tuberculosis Mycobacterial Growth Indicator Tube PCR RMP, RIF VKL WHO Se Sp PPV NPV (Nuôi cấy vi khuẩn lao ống thị) Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) Rifampicin Vi khuẩn lao World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) Sensitive (Độ nhạy) Specific (Độ đặc hiệu) Positive Predictive Value (Giá trị dự đốn dương tính) Negative Predictive Value (Giá trị dự đốn âm tính) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PCR (Polymerase chain reaction) 1.1 Đại cương 1.2 Nguyên lý PCR 1.3 Giá trị PRC chẩn đoán vi khuẩn lao Gene Xpert MTB/RIF 2.1 Đại cương 2.2 Nguyên lý 2.3 Giá trị Xpert MTB chẩn đoán vi khuẩn lao 2.4 Tập hợp chứng khoa học 2.5 Các khuyến cáo 10 Line probe assay 11 3.1 Đại cương 11 3.2 Nguyên lý 11 3.3 Các băng tín hiệu màng lai nhận định kết .13 3.4 Giá trị xét nghiệm Line probe assay 13 3.5 Bằng chứng khoa học .14 3.6 Khuyến cáo 15 TB LAMP 16 4.1 Đại cương 16 4.2 Nguyên lý phản ứng LAMP 17 4.3 Phát sản phẩm phản ứng TB-LAMP: 19 4.4 Bằng chứng khoa học .20 4.5 Khuyến cáo .22 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị chẩn đoán PCR bệnh phẩm khác DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng PCR Hình 2.1 Nguyên lý phát đột biến kháng RIF gene rpoB trình gắn đầu dò phát quang với DNA đích Hình 3.1 Nguyên lý phản ứng lai DNA hiển thị kết tín hiệu 12 Hình 3.2 Hiển thị kết tín hiệu .13 Hình 4.1 Gene đích cặp mồi phản ứng LAMP 17 Hình 4.2 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu phản ứng LAMP 18 Hình 4.3 Giai đoạn lặp lại chu kỳ phản ứng LAMP 19 Hình 4.4 Nguyên lý phát quang phản ứng LAMP 20 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao gánh nặng giới Việt Nam Để đẩy lùi tiến tới toán bệnh lao, điều quan trọng phát nhiều số người mắc lao cộng đồng điều trị khỏi để giảm dần nguồn lây nhiễm Chẩn đoán lao thách thức triệu chứng lâm sàng chẩn đốn hình ảnh thường khơng điển hình, kỹ thuật chẩn đốn lao truyền thống có hạn chế định Kỹ thuật soi đờm trực tiếp tìm AFB có khả chẩn đốn nhanh vi khuẩn lao nhiên tỉ lệ dương tính đạt khoảng 50%, khơng xác định tính kháng thuốc vi khuẩn lao, ngồi kết phụ thuộc vào chất lượng lấy đờm khả đọc kết [1], [2] Kỹ thuật nuôi cấy tiêu chuẩn vàng chẩn đoán lao thời gian cho kết lâu khơng đáp ứng u cầu chẩn đốn điều trị sớm [3], [4] Trong hồn cảnh đó, với phát triển cơng nghệ sinh học phân tử nói chung, kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng chẩn đốn lao có nhiều hứa hẹn phương diện lý thuyết phát vật chất di truyền vài vi khuẩn điều kiện phòng xét nghiệm, điều đặc biệt có ý nghĩa với thể lao soi đờm trực tiếp âm tính, lao người nhiễm HIV, lao trẻ em, lao phổi phát sớm lao kháng thuốc Nội dung chuyên đề trình bày nguyên lý giá trị chẩn đoán kỹ thuật góp phần giúp thầy thuốc chẩn đốn xác hiệu bệnh lao PCR (Polymerase chain reaction) 1.1 Đại cương PCR Kary Mullis phát minh, ơng đoạt giải Nobel Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp bệnh phẩm nhờ khả nhận biết chép để khuyếch đại mặt số lượng đoạn trình tự đích (target region) đặc hiệu genome vi khuẩn [5] 1.2 Nguyên lý PCR PCR thử nghiệm nhân đoạn DNA ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Thành phần dung dịch phản ứng (PCR mix) bao gồm: (1) enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase), (2) DNA đích chứa đoạn trình tự đích cần nhân lên phản ứng, (3) đoạn mồi (primer) oligonucleotide có trình tự bổ sung đặc hiệu với đoạn trình tự đích (4) loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP) gồm Adenin, Thymine, Guanine Cytosine (dATP, dTTP, dGTP dCTP) Một chu kì nhiệt gồm giai đoạn: biến tính, bắt cặp kéo dài với mức nhiệt khác (hình 1) Ở giai đoạn biến tính, nhiệt độ đưa lên 94oC khiến liên kết hydro mạch đơi DNA trở lên lỏng lẻo DNA bị biến tính thành mạch đơn Tiếp đến giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ hạ xuống 55-65oC nhiệt độ thích hợp để đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào đoạn DNA đích Cuối nhiệt độ đưa lên 72 oC nhiệt độ phù hợp cho hoạt động enzym Taq polymerase để nối dNTP vào đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA đích để tổng hợp đoạn DNA [5] Hình 1.1 Phản ứng PCR Ứng dụng PCR chẩn đoán vi khuẩn lao thường dựa việc phát đoạn gen IS6110 [6] IS6110 trình tự gắn (insert sequence) đặc hiệu genome vi khuẩn thuộc nhóm Mycobacter tuberculosis bao gồm M tuberculosis, M africanum, M bovis, M cannetti, M caprae, M microti, and M pinnipedi Kỹ thuật PCR cải tiến thêm sử dụng đa mồi (multiplex PCR) phát gene đích IS6110, IS1081 23S rDNA PCR tổ (nested PCR) để tăng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng 1.3 Giá trị PRC chẩn đốn vi khuẩn lao Trong điều kiện phòng xét nghiệm cần lượng nhỏ vi khuẩn (1-3 vi khuẩn/1mm3 bệnh phẩm) cho kết dương tính PCR khơng cho biết vi khuẩn sống hay chết Tỷ lệ dương tính giả cao lây nhiễm quy trình xử lý phân tích bệnh phẩm Âm tính giả có mặt nhiều chất ức chế DNA polymerase bệnh phẩm vi khuẩn khơng có đoạn IS6110 Chủng vi khuẩn lao Việt Nam có tỉ lệ khuyết gen đích IS6110 khoảng 3-5% [7] Noordhoek (1994) tổng hợp kết từ phòng xét nghiệm khác nhau, nhận xét PCR chẩn đốn lao phổi có tỉ lệ dương tính giả cao từ 43-77%, nguy lây nhiễm chéo cao [8] Nguyễn Thu Hà (2006) nghiên cứu nhóm bệnh nhân lao phổi AFB âm tính, nhận thấy PCR đờm có Se 57,1%, Sp 93,33%, PPV 85,7%, NPV 75,7% Kỹ thuật PCR phát đoạn gene IS6110 để chẩn đốn lao ngồi phổi đánh giá nhiều nghiên cứu giới Nhìn chung xét nghiệm có độ nhạy dao động từ 31 – 100%, độ đặc hiệu tương đối cao [6] Kết giải thích tỷ lệ ngoại nhiễm cao sử dụng kit PCR khác nghiên cứu Chính vậy, kỹ thuật PCR không WHO khuyến cáo sử dụng chẩn đoán Mycobacter tuberculosis Bảng 1.1 Giá trị chẩn đoán PCR bệnh phẩm khác [6] Tác giả Bệnh phẩm Độ nhạy (Se%) Độ đặc hiệu (Sp%) Nopvichai (2009) Hạch 67 100 Sharma (2010) Hạch 100 92 Cortez (2011) Hạch 63 87 Villegas (2000) Dịch màng phổi 61 90 Lima (2003) Dịch màng phổi 31 96 Chakravorty (2005) Dịch màng phổi 76 94 Liu (2007) Dịch màng phổi 43 95 Baba (2008) Dịch màng phổi 68 73 Rosso (2001) Dịch màng phổi 43 94 Quan (2006) Dịch não tủy 75 94 Rafi (2007) Dịch não tủy 98 100 Haldar (2010) Dịch não tủy 40 93 Gene Xpert MTB/RIF 2.1 Đại cương Hệ thống Gene Xpert giới thiệu từ năm 2004, Gene Xpert kỹ thuật mang tính đột phá, tích hợp công nghệ (tách gen, nhân gen nhận biết gen) phát triển khuôn khổ hợp tác tổ chức FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics), Cepheid Inc trường Đại học Y - Nha khoa New Jersey Kỹ thuật nhằm xác định đoạn acid nucleic đích từ bệnh phẩm lâm sàng chưa cần qua xử lý dựa nguyên lý kỹ thuật PCR Khả phát vi khuẩn gây bệnh khác có dựa hộp xét nghiệm (cartridge) đặc hiệu cho nguyên ví dụ: Staphylococcus aureus kháng methicllin (MRSA), Streptococcus agalactia, Mycobacteria tuberculosis [9] Xpert MTB/RIF (viết tắt Xpert MTB) xét nghiệm sinh học phân tử phát có mặt vi khuẩn lao đột biến kháng RMP cách sử dụng đoạn mồi đặc hiệu đầu dò (probes) có gắn thị huỳnh quang khác để đảm bảo độ đặc hiệu cao Cho đến Xpert phát triển qua phiên phần mềm nâng cấp, G1, G2, G3 G4 Mỗi phiên điều chỉnh giá trị ngưỡng chu kỳ nhân để làm tăng độ nhạy độ đặc hiệu Xpert MTB khả phát kháng RMP Từ năm 2013, toàn hệ thống sinh phẩm sử dụng cho chẩn đoán hệ G4 [10] 2.2 Nguyên lý Trong DNA vi khuẩn lao, gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β RNA polymerase Đột biến kháng RMP thường xảy đoạn gen rpoB, đặc biệt đoạn nằm trung tâm gen dài 81 bp giới hạn từ ba 507 đến 533 (vùng “nóng” – hot-spot region) Đột biến vị trí khác có mức độ kháng thuốc khác Đột biến vị trí ba thứ 516, 526, 531, cho kết đề kháng với RMP cao; đột biến ba 510, 515 512 kháng RMP mức độ thấp 45% chủng có đột biến codon 531 (S531) 35% chủng kháng thuốc có thay đổi codon 526 (H526) dẫn đến thay acid amin [9], [10], [11] Từ 90 - 97% chủng M tuberculosis kháng RMP xác định đột biến vùng gen ngắn 81 bp rpoB, - 10% đột biến kháng RMP khác xác định đoạn tận N vùng II gen rpoB, liên quan tới có chế kháng thuốc khác [11], [12], [13] Xét nghiệm thiết kế để nhân đoạn trình tự 192bp gen rpoB vi khuẩn lao phản ứng PCR Xét nghiệm sử dụng mẫu dò riêng biệt gắn thị huỳnh quanh, chứa trình tự cặp đôi với DNA chủng vi khuẩn lao hoang dại Các trình tự mẫu dò thiết kế đặc biệt để có khả phát đột biến cao đảm bảo chắn xác định vùng thường xuyên xảy đột biến chứa 81bp Xác định có vi khuẩn lao có mẫu dò bắt cặp Xác định có đột biến kháng RMP dựa có mẫu dò khơng bắt cặp [10], [12], [13], [14] Hình 2.1 Nguyên lý phát đột biến kháng RIF gene rpoB trình gắn đầu dò phát quang với DNA đích 2.3 Giá trị Xpert MTB chẩn đốn vi khuẩn lao Xpert MTB có khả chẩn đốn lao phát lao kháng RIF với nhiều ưu điểm: khép kín, tự động, dễ thao tác, trả kết sớm Chỉ thị phân tử nhắm vào gen rpoB bao trùm tất đột biến tìm thấy 85% chủng kháng RMP Khơng có phản ứng chéo với vi khuẩn 13 gyrB, phát kháng nhóm aminoglycosid dựa đột biến gene rrs, đột biến kháng thuốc kanamycin mức độ thấp gene eis [29] Hình 3.2 Hiển thị kết tín hiệu 3.3 Các băng tín hiệu màng lai Genotype MTBDRplus nhận định kết 3.4 Giá trị xét nghiệm Line probe assay Thế hệ LPA thứ nhất, INNOLiPA Rif TB (Innogenetics NV): Có thể nhận biết thiếu hụt xuất vùng đột biến liên quan đến tính kháng thuốc vi khuẩn lao, từ kết luận chủng kháng hay nhạy với RMP Tuy nhiên xuất âm tính giả có yếu tố ức chế q trình nhân bệnh phẩm, khơng có chứng nội [30] Thế hệ LPA thứ hai, GenoType MTBDRplus (Hain Lifesciene): Xác định tính kháng RMP qua đột biến quan trọng gen rpoB (mã hoá cho tiểu phần β RNA polymerase), kháng INH mức độ cao độ liên quan đột biến gen katG (mã hoá cho enzyme catalase - peroxidase), kháng 14 INH mức độ thấp liên quan đột biến gen inhA Hạn chế xét nghiệm GenoType MTBDRplus xác định đột biến kháng RMP INH biết, nhiên đột biến hay gặp chủng lao kháng thuốc Thời gian trả kết từ - ngày khiến GenoType MTBDRplus trở thành xét nghiệm chẩn đoán nhanh, hiệu quản lý MDR-TB [28], [29] GenoType MTBDRsl (ver.1 ver.2) chẩn đốn lao phổi siêu kháng thuốc thông qua phát đột biến liên quan đến kháng thuốc lao hàng hai fluoroquinolone, aminoglyocoside GenoType CM/AS chẩn đốn định danh lồi Mycobacteria Tuberculosis complex 30 loài Mycobacterium khác [29] 3.5 Bằng chứng khoa học Lacoma (2008) nghiên cứu kỹ thuật GenoType đánh giá khả phát kháng RMP INH 62 chủng lâm sàng so sánh với hệ thống Bactec 460TB, độ nhạy phát RMP Se 98,3% (61/62), độ nhạy phát INH Se79% (49/62), 27 chủng có mức độ kháng INH thấp độ nhạy Se 62,9% (17/27), 21 chủng độ kháng INH cao độ nhạy Se 85,71% (18/21) Độ nhạy phát kháng RMP 98% (50/51), kháng INH 96,2% (49/51) [31] Hillemann cộng (2007) nhận thấy tỉ lệ phát kháng RIF từ chủng nuôi cấy môi trường lỏng/đặc từ bệnh phẩm đờm nhuộm soi dương tính 98,7% 96,8% Tỉ lệ kháng INH từ chủng nuôi cấy môi trường lỏng/đặc từ bệnh phẩm đờm nhuộm soi dương tính 92% 90% [32] Barnard cộng (2008) nghiên cứu 536 bệnh phẩm đờm nhuộm soi dương tính với độ nhạy phát kháng RIF 98,9% phát kháng INH 94,2% so sánh với phương pháp ni cấy [33] Một phân tích gộp tập trung tất nghiên cứu đưa độ nhạy chung kháng RMP 96% (95-97%), độ đặc hiệu chung 98% (97- 15 99%), kháng INH độ nhạy chung 91% (88-94%) độ đặc hiệu chung 99% (98-99%), kháng đa thuốc độ nhạy chung 91% (86-94%), độ đặc hiệu chung 99% (99-100%) [34] Nguyễn Thu Hà (2013) nghiên cứu kỹ thuật Genotype MTBDRplus thấy độ nhạy, đặc hiệu chẩn đoán kháng RMP Se 91,8%; Sp 100%, kháng INH Se 88,5%; Sp 93,8%, đa kháng thuốc Se 76,8%; Sp 100% [35] Nguyễn Mạnh Thế (2017) đánh giá giá trị Genotype MTBDRplus 165 bệnh nhân có kết ni cấy mơi trường lỏng dương tính, nhận thấy độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm chẩn đoán lao phổi kháng RMP so với kháng sinh đồ môi trường lỏng 86,36% 98,60%; chẩn đoán lao phổi kháng INH 76,92% 92,03%, đột biến katG chiếm chủ yếu (91,84%); chẩn đoán lao phổi đa kháng 80% 97,93% [36] WHO (2008) phân tích gộp nghiên cứu có giá trị đánh giá giá trị Genotype MTBDRplus so với kháng sinh đồ truyền thống bệnh phẩm đờm AFB (+) mẫu nuôi cấy M Tuberculosis (+) Kết cho thấy LPA có độ nhạy ≥ 97% độ đặc hiệu ≥ 99% phát kháng RMP phát lao đa kháng có độ nhạy ≥ 90% độ đặc hiệu ≥ 99% [28] 3.6 Khuyến cáo  Genotype MTBDRplus[28]: WHO (2008) khuyến cáo Genotype MTBDRplus nên sử dụng phù hợp theo hồn cảnh quốc gia có gánh nặng lao đa kháng Genotype MTBDRplus xét nghiệm để chẩn đoán lao phổi đa kháng bệnh phẩm đờm AFB (+) mẫu nuôi cấy M tuberculosis complex (+) từ bệnh phẩm đờm phổi, thay cho xét nghiệm kháng sinh đồ Xét nghiệm không khuyến cáo sử dụng trực tiếp bệnh phẩm AFB (-) 16 Trong trường hợp, Genotype MTBDRplus cho kết kháng thuốc không xác định, cần phải làm xét nghiệm kháng sinh đồ  Genotype MTBDRsl [37]: Genotype MTBDRsl WHO (2016) khuyến cáo xét nghiệm cho bệnh nhân có lao kháng RMP đa kháng để phát kháng thuốc nhóm fluoroquinolone thuốc tiêm hàng hai, thay cho kháng sinh đồ Các đột biến kháng thuốc tiêm hàng hai phát Genotype MTBDRsl có tương quan chặt với kết kháng sinh đồ Trong với nhóm fluoroquinolone, đột biến kháng ofloxacin/levofloxacin có tương quan với kết kháng sinh đồ tốt so với đột biến kháng moxifloxacin Vì vậy, cần làm xét nghiệm kháng sinh đồ đối vói moxifloxacin điều trị lao kháng RMP đa kháng TB LAMP 4.1 Đại cương Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplifcation ) nghiên cứu phát triển công ty Eiken Chemical Co Ltd Đây phương pháp nhân gene mới, tổng hợp đoạn DNA lớn mà khơng cần chu trình biến nhiệt Thành phần phản ứng gồm có mẫu, mồi, enzyme DNA polymerase, hỗn hợp phản ứng ủ 65oC [38] LAMP phản ứng nhân DNA đặc hiệu, xảy có điều kiện cần đủ cho phản ứng, chuỗi mồi, bao gồm mồi đơn F3, B3, mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám vào chuỗi đích khn, sản phẩm DNA vòng tạo phát Chỉ hay vài mồi không hoạt động, không bám đặc hiệu, sản phẩm DNA vòng khơng tạo Sản phẩm phản ứng quan sát mắt thường kết tủa phản ứng tạo muối pyrophotphate (Mg2P2O7) phát quang nhuộm thuốc nhuộm [39], [40] TB-LAMP sử dụng nguyên lý LAMP để phát đoạn gen đích IS6110 đặc hiệu cho Mycobacteria tuberculosis complex [41] 17 4.2 Nguyên lý phản ứng LAMP Trên gen đích có vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c đầu 3’ vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c đầu 5’ Những trình tự sở cho việc thiết kế cặp mồi đặc biệt: FIP, BIP, F3, B3 Trong mồi FIP (Forward Inner Primer) gồm phần: vùng F2 (ở đầu 3’) vùng bổ sung cho F2c nối với vùng F1c đầu 5’; mồi BIP (Backward Outer Primer) gồm phần: vùng B2 (ở đầu 3’) vùng bổ sung cho B2c nối với vùng B1c (ở đầu 5’); mồi F3 (Forward Outer Primer) chứa vùng F3, trình tự bổ sung cho vùng F3c; mồi B3 (Backward Outer Primer) chứa vùng B3, trình tự bổ sung cho vùng B3c [38] Hình 4.1 Gene đích cặp mồi phản ứng LAMP Nguyên lý phản ứng LAMP gồm giai đoạn: (1) Tạo vật liệu khởi đầu, (2) tái kéo dài chuỗi, cuối (3) lặp lại chu kỳ Tạo vật liệu khởi đầu: Một mồi LAMP bám vào trình tự DNA đích, sau tác dụng enzyme DNA polymerase có hoạt tính tách sợi kéo dài sợi theo chiều 3’-5’ Ví dụ mồi FIP bám vào vị trí F2c (Hình 1) Thơng qua tác dụng DNA polymerase, đoạn DNA bổ sung kéo dài từ đầu 3’ vùng F2 mồi FIP (hình 2).Đoạn mồi F3, nằm 18 ngồi FIP, gắn vào vùng F3c làm ngừng trình tổng hợp DNA giải phóng đoạn DNA bổ sung (hình 3).Một đoạn mạch kép tổng hợp từ mồi F3 đoạn DNA bổ sung (hình 4) Đoạn mạch bổ sung gắn FIP giải phóng từ vị trí mồi F3 hình thành cấu trúc vòng đầu 5’ vùng F1 F1c bắt cặp bổ sung (hình 5) Đoạn DNA đơn bước trở thành khuôn mẫu để tổng hợp DNA tử đầu 3’ mồi BIP (hình 6) Tương tự mồi BIP B3 bám vào tổng hợp sợi DNA theo nguyên tắc bổ sung (hình 7) Kết thu sản phẩm DNA đơn có giới hạn mồi FIP BIP (hình 8) Sợi DNA có đầu cuộn lại hình thành cấu trúc gốc vòng (stem-loop DNA) (do trình tự bắt cặp bổ sung F1- F1c B1-B1c) Cấu trúc cấu trúc khởi đầu cho trình tái phương pháp LAMP (chu kỳ lặp lại LAMP) [38] Hình 4.2 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu phản ứng LAMP Tái kéo dài chuỗi: mồi FIP gắn với vòng cấu trúc DNA gốc vòng vùng F2/F2c tổng hợp sợi DNA bổ sung, đồng thời cấu trúc vòng đầu 3’ (do trình tự FIP tạo thành) kéo dài hình thành cấu 19 trúc vòng vị trí kết thúc trình tự BIP Cấu trúc vòng trình tự BIP lại kéo dài hình thành nên cấu trúc sợi kép gấp khúc sợi đơn có cấu trúc vòng hai đầu Cả hai sản phẩm DNA mẫu cho chu kỳ tái Sản phẩm cuối hỗn hợp DNA gốc vòng với cấu trúc gấp khúc độ dài khác trình tự [38] Hình 4.3 Giai đoạn lặp lại chu kỳ phản ứng LAMP Lặp lại chu kỳ: Cứ vậy, mồi FIP BIP hai sợi khuôn thay phiên tổng hợp DNA bổ sung tạo gốc vòng cuối sợi Phản ứng tiếp tục tạo nên 10 9-1010 vòng khoảng 15 phút đến 4.3 Phát sản phẩm phản ứng TB-LAMP: Các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) tham gia q trình tổng hợp DNA giải phòng gốc phosphate Khi thêm thuốc nhuộm huỳnh quang FDR (fluorescent detection reagent) ví dụ SYBR green Calcein FDR kết hợp với ion manganese (Mn ++ ) không phát quang Ion 20 pyrophosphate tạo sản phẩm phụ phản ứng LAMP, chúng kết hợp loại manganese từ calcein, kết nhận dạng gen đích phát quang Ống phản ứng quan sát đèn UV thơng thường kính hiển vi huỳnh quang [42] Hình 4.4 Ngun lý phát quang phản ứng LAMP 4.4 Bằng chứng khoa học K N’guessan so sánh giá trị soi AFB, TB-LAMP, Xpert MTB chẩn đoán lao phổi 469 bệnh nhân sử dụng nuôi cấy tiêu chuẩn vàng Kết cho thấy thấy độ nhạy độ đặc hiệu soi AFB 86% (95% CI : 81–91) 96% (95% CI : 94–98); TB-LAMP 92% (95% CI: 0.88–0.96) 94% (95% CI: 91–97); Xpert MTB 96% (95% CI : 0.93–0.99) 90% (95% CI: 87–93) Tính tổng, có 157 (33,5%) bệnh nhân có kết ni cấy dương tính, kết nhuộm soi AFB, TB-LAMP, Xpert MTB 147 (31.3%), 162 (34.5%), 183 (39%) Nghiên cứu cho thấy sử dụng kỹ thuật TB-LAMP làm tăng số trường hợp chẩn đốn lao lên 3,2% so với kỹ thuật nhuộm soi AFB [42] 21 Mbarouk Seif Khalief (2014) nghiên cứu 550 bệnh nhân nghi lao lấy đờm đủ tiêu chuẩn, nhận xét kỹ thuật TB-LAMP có độ nhạy độ đặc hiệu 67.4% 97.5%; Xpert MTB có độ nhạy độ đặc hiệu 80% 90.3%; soi AFB huỳnh quang có độ nhạy độ đặc hiệu 61.4% and 96.3% Tuy nhiên, độ nhạy độ đặc hiệu soi AFB huỳnh quang lần liên tiếp 71.43% and 95.47% Kết cho thấy TB-LAMP có độ nhạy cao soi AFB huỳnh quang lần xét nghiệm khơng cho thấy lợi ích chẩn đoán lao phổi so với phương pháp soi AFB huỳnh quang [42] Trần Thị Thanh Hoa (2014) nghiên cứu 498 mẫu đờm bệnh nhân có triệu chứng nghi lao so sánh giá trị TB-LAMP, Xpert MTB, soi đờm trực tiếp lần, sử dụng nuôi cấy tiêu chuẩn vàng Kết cho thấy độ nhạy TB-LAMP bệnh phẩm nuôi cấy dương, soi trực tiếp dương 80% (51,9 – 95,7), bệnh phẩm nuôi cấy dương, soi trực tiếp âm 15,8% (33,8 – 39,6), độ nhạy chung 44.1% (27,2 – 62,1%) độ đặc hiệu chung 95.0% (94.2–97.9%) Xpert MTB có độ nhạy độ đặc hiệu tốt so với TB-LAMP Tuy nhiên, TB-LAMP có độ nhạy tương đương với soi đờm trực tiếp lần, lớn lần soi trực tiếp riêng rẽ [42] WHO (2016) đánh giá hiệu chẩn đoán lao TB-LAMP so với soi đờm trực tiếp người lớn nghi lao Phân tích gộp bao gồm nghiên cứu (1810 bệnh nhân) sử dụng nuôi cấy tiêu chuẩn vàng Kết nghiên cứu cho thấy độ nhạy độ đặc hiệu TB-LAMP 78% (71% - 83%) 98% (96% - 99%), độ nhạy độ đặc hiệu soi đờm trực tiếp 63% (56% - 69) 100% (97% -100%) Trong quần thể bệnh nhân nhiễm HIV nghi lao, phân tích gộp gồm nghiên cứu (271 bệnh nhân) không cho thấy lợi ích việc sử dụng TB-LAMP (độ nhạy 64%, độ đặc hiệu 99%) so với soi đờm trực tiếp (độ nhạy 62%, độ đặc hiệu 99%) nghiên cứu (1349 bệnh nhân) đánh giá giá 22 trị TB-LAMP quần thể bệnh nhân nghi lao soi đờm trực tiếp âm tính cho thấy xét nghiệm có độ nhạy thấp 42%, độ đặc hiệu 98% Các nghiên cứu có mức độ chứng thấp mẫu nhỏ, xét nghiệm thực labo vi sinh tiêu chuẩn kết dao động nghiên cứu [42] 4.5 Khuyến cáo Dựa chứng khoa học, WHO (2016) đưa khuyến cáo [42]: - TB-LAMP xét nghiệm thay cho soi đờm trực tiếp chẩn đoán lao phổi người lớn có dấu hiệu nghi lao (mức độ chứng thấp) - TB-LAMP sử dụng sau xét nghiệm soi đờm trực tiếp người lớn có dấu hiệu nghi lao, đặc biệt cần xét nghiệm thêm bệnh nhân soi đờm trực tiếp âm tính (mức độ chứng thấp) - TB-LAMP không thay cho kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán lao kháng RMP, đặc biệt vùng có gánh nặng lao đa kháng - Khơng rõ lợi ích TB-LAMP so với soi đờm trực tiếp bệnh nhân nghi lao mắc HIV - Khuyến cáo áp dụng bệnh phẩm đờm, trẻ em sử dụng bệnh phẩm dịch hút dày khó khăn việc lấy đờm TÀI LIỆU THAM KHẢO World Health Organization (2018) Tuberculosis, , Chương trình chống lao quốc gia (2017) Báo cáo tổng kết 2016 phương hướng hoạt động 2017, 10 Bộ Y tế (2015) Hướng dẫn chẩn đốn, điều trị dự phòng bệnh lao Bộ Y tế (2013) Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh Y học Phạm Hùng Vân (2009) PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh P K Mehta, A Raj, N Singh et al (2012) Diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR FEMS Immunol Med Microbiol, 66 (1), 20-36 Y M Hale, G E Pfyffer, M Salfinger (2001) Laboratory diagnosis of mycobacterial infections: new tools and lessons learned Clin Infect Dis, 33 (6), 834-846 G T Noordhoek, A H Kolk, G Bjune et al (1994) Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison study among seven laboratories J Clin Microbiol, 32 (2), 277-284 World Health Organization (2011) Rapid implementation of the Xpert MTB/RIF diagnositic test, Switzerland, 10 World Health Organization (2014) Xpert MTB/RIF implementation manual, Switzerland, 11 S D Lawn and M P Nicol (2011) Xpert(R) MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance Future Microbiol, (9), 1067-1082 12 M L Wilson (2011) Recent advances in the laboratory detection of Mycobacterium tuberculosis complex and drug resistance Clin Infect Dis, 52 (11), 1350-1355 13 S D Lawn, P Mwaba, M Bates et al (2013) Advances in tuberculosis diagnostics: the Xpert MTB/RIF assay and future prospects for a pointof-care test Lancet Infect Dis, 13 (4), 349-361 14 World Health Organization (2011) Automated Real-time nucleic acid amplification techonology for rapid and similtaneous detection of Tuberculosis and Rifampicin Resistance: Xpert MTB/RIF System, Automated Real-time nucleic acid amplification techonology for rapid and similtaneous detection of Tuberculosis and Rifampicin Resistance: Xpert MTB/RIF System, 15 World Health Organization (2017) WHO Meeting Report of a Technical Expert Consultation: Non-inferiority analysis of Xpert MTB/RIF Ultra compared to Xpert MTB/RIF Switzerland, 16 N C Bahr, E Nuwagira, E E Evans et al (2018) Diagnostic accuracy of Xpert MTB/RIF Ultra for tuberculous meningitis in HIV-infected adults: a prospective cohort study Lancet Infect Dis, 18 (1), 68-75 17 C C Boehme, M P Nicol, P Nabeta et al (2011) Feasibility, diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study Lancet, 377 (9776), 1495-1505 18 R T Mavenyengwa, E Shaduka and I Maposa (2017) Evaluation of the Xpert(R) MTB/RIF assay and microscopy for the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in Namibia Infect Dis Poverty, (1), 13 19 G Carriquiry, L Otero, E Gonzalez-Lagos et al (2012) A diagnostic accuracy study of Xpert(R)MTB/RIF in HIV-positive patients with high clinical suspicion of pulmonary tuberculosis in Lima, Peru PLoS One, (9), e44626 20 K R Steingart, I Schiller, D J Horne et al (2014) Xpert(R) MTB/RIF assay for pulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults Cochrane Database Syst Rev, (1), Cd009593 21 Mai Thanh Tú (2013) Kết Xpert MTB/RIF dịch soi phế quản bệnh nhân nghi lao, Luận văn Thạc sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội 22 Hoàng Hà (2014) Xét nghiệm Xpert MTB/RIF bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Nguyên năm 2014, Đà Nẵng, 23 Lưu Bội Khanh (2014) Tình hình điều trị bệnh nhân lao phát chương trình sàng lọc chủ động cộng đồng tỉnh Cà Mau, Đà Nẵng, 24 Nguyễn Kim Cương (2017) Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng giá trị kỹ thuật gene Xpert MTB/RIF chẩn đoán lao phổi AFB (-) người nhiễm HIV, Luận văn Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội 25 World Health Organization (2013) WHO Policy Statement on Xpert MTB-RIF 2013 pre publication, Switzerland, 26 Bộ Y tế (2012) Hướng dẫn quy trình triển khai kỹ thuật Gene Xpert MTP/RIF 27 M Dash (2012) Rapid diagnosis of drug resistant tuberculosis: current perspectives and challenges 28 World Health Organization (2008) Molecular Line Probe Assays for Rapid Screening of patients at risk of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB): Policy Statement, Switzerland 29 Barnard M.; Parsons L.; Miotto P (2012) Molecular Detection of Drug-Resistant Tuberculosis by Line Probe Assay Laboratory Manual for Resource-Limited Settings 30 M Viveiros, C Leandro, L Rodrigues (2005) Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and Detection of Rifampin Resistance in 360 Smear-Positive Respiratory Specimens from an Area of High Incidence of Multidrug-Resistant Tuberculosis J Clin Microbiol, 43 (9), 4880-4884 31 A Lacoma, N Garcia-Sierra, C Prat (2008) GenoType MTBDRplus Assay for Molecular Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Strains and Clinical Samples J Clin Microbiol, 46 (11), 3660-3667 32 Hillemann D., Rusch-Gerdes S and Richter E (2007) Evaluation of the GenoType MTBDRplus assay for rifampin and isoniazid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis strains and clinical specimens J Clin Microbiol, 45(8), 2635-2640 33 Barnard M, Albert H and Coetzee G (2008) Rapid molecular screening for multidrug resistance tuberculosis in a high volume public health laboratory in South Africa Am J Respir Crit Care Med, 177, 787–792 34 Bai Yuanyuan, Wang Yueling, Shao Chunhong (2016) GenoType MTBDRplus Assay for Rapid Detection of Multidrug Resistance in Mycobacterium tuberculosis: A Meta-Analysis PLoS One, 11(3), 35 Nguyễn Thu Hà (2012) Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng, đột biến gen rpoB, katG inhA vi khuẩn lao phổi tái phát, Luận án Tiến sỹ Y học, Đại học Y Hà Nội 36 Nguyễn Mạnh Thế (2017) Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhân lao phổi giá trị kĩ thuật Genotype MTBDRplus chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc, Luận văn Bác sĩ nội trú, Đại học Y Hà Nội 37 World Health Organization (2016) The use of molecular line probe assays for the detection of resistance to second-line anti-tuberculosis drugs 38 T Notomi, H Okayama, H Masubuchi et al (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Res, 28 (12), E63 39 Y Mori, K Nagamine, N Tomita et al (2001) Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation Biochem Biophys Res Commun, 289 (1), 150-154 40 M Goto, E Honda, A Ogura et al (2009) Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue Biotechniques, 46 (3), 167-172 41 E Aryan, M Makvandi, A Farajzadeh et al (2010) A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complex Microbiol Res, 165 (3), 211-220 42 World Health Organization (2016) The use of loop-mediated isothermal amplifcation (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis, Switzerland, ... Trong hồn cảnh đó, với phát triển công nghệ sinh học phân tử nói chung, kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng chẩn đốn lao có nhiều hứa hẹn phương diện lý thuyết phát vật chất di truyền vài vi khuẩn. .. tính với vi khuẩn lao Xpert MTB, tỉ lệ ước tính 425/100.000 Trong người có kết dương tính với vi khuẩn lao xét nghiệm Xpert, 54% có kết “Số lượng vi khuẩn lao thấp”, 2,7% có vi khuẩn lao kháng... trị PRC chẩn đoán vi khuẩn lao Gene Xpert MTB/RIF 2.1 Đại cương 2.2 Nguyên lý 2.3 Giá trị Xpert MTB chẩn đoán vi khuẩn lao 2.4 Tập hợp chứng khoa học