CÁC kỹ THUẬT SINH học PHÂN tử xác ĐỊNH các đột BIẾN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ MINH PHƯỢNG NCS KHÓA 34 Học phần I: CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN Chuyên ngành: Hoá sinh Y học Mã số: 62.72.04.01 HÀ NỘI - 2016 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 PHƯƠNG PHÁP PCR 1.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 1.3 Ưu nhược điểm PCR 1.4 Ứng dụng phương pháp PCR phát đột biến gen 1.4.1 PCR đơn mồi (monoplex PCR) 1.4.2 Kỹ thuật multiplex PCR phát đột biến đoạn 1.4.3 Kĩ thuật Inversion- PCR phát đột biến đảo đoạn 10 1.4.4 Kỹ thuật ARMS (Amplification refractoy mutation system - hệ thống khuếch đại đột biến bền với nhiệt ) 10 1.4.5 Kỹ thuật PCR ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) .11 REAL-TIME PCR 13 2.1 Sự khác biệt real-time PCR PCR truyền thống 13 2.2 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR 14 PHƯƠNG PHÁP MLPA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 16 GIẢI TRÌNH TỰ GEN (DNA SEQUENCING) 18 4.1 Khái niệm 18 4.2 Các phương pháp giải trình tự gen 19 4.2.1 Phương pháp enzym giải trình tự DNA 19 4.2.2 Giải trình tự máy tự động 22 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh Phản ứng PCR Hình Các giai đoạn phản ứng RT-PCR với mồi oligo-dT .12 Hình Biểu đồ khuếch đại phản ứng real-time PCR 15 Hình Các giai đoạn kỹ thuật MLPA .16 Hình Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP 19 Hình Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) tổng hợp DNA bị ức chế (B) 20 Hình Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP .20 Hình Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin 22 MỞ ĐẦU Trong năm gần với phát triển kinh tế xã hội, nạn ô nhiễm môi trường nguy phơi nhiễm với tác nhân gây đột biến virus, khói thuốc, phóng xạ, ngày tăng dẫn đến gia tăng đột biến vơ hiệu hóa máy sửa chữa thơng tin di truyền tế bào Hậu tổn thương thông tin di truyền lưu giữ gen người bệnh có khả truyền lại cho hệ sau Việc phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA hai nhà bác học James D Watson Francis H.C Crick vào năm 1953 thức đánh dấu đời Sinh học phân tử Kể từ đó, nhiều phát thành tựu kỹ thuật giúp ngành sinh học phân tử ngày phát triển Trong năm cuối kỷ 20, công nghệ sinh học phát triển với tốc độ chóng mặt đạt nhiều thành tựu to lớn lý thuyết thực tiễn Trong lĩnh vực Y học, di truyền học kỹ thuật gen giúp người phát sở khoa học số bệnh nan y, chế tạo loại thuốc để điều trị bệnh Đặc biệt, năm gần đây, liệu pháp gen nghiên cứu đưa vào ứng dụng để điều trị số bệnh lý di truyền Phương pháp sinh học phân tử ứng dụng ngày rộng rãi có hiệu lĩnh vực sinh học Đó việc sử dụng kỹ thuật DNA kỹ thuật protein để xác định chuỗi gen hay chuỗi acid amin gen, lập đồ gen khu vực định gen lồi cần chẩn đốn Đối với người, có nhiều phương pháp sinh học phân tử giúp phát đột biến gen gây nên bệnh lý di truyền Trong phạm vi chuyên đề này, em xin đề cập đến nội dung sau: Trình bày kỹ thuật sinh học phân tử thông dụng sử dụng để xác định đột biến gen PHƯƠNG PHÁP PCR PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm nhân (tạo nhiều sao) đoạn DNA ống nghiệm mô máy sinh tổng hợp DNA tế bào sống Kỹ thuật sử dụng rộng rãi nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống Các áp dụng nhiều lãnh vực làm kết thật kỳ diệu, làm cho công trình nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng dễ dàng gấp nhiều lần so với trước Nếu trước thử nghiệm sinh học phân tử phải kéo dài hàng tuần, chí hàng tháng, thí nghiệm có mục đích vậy, với PCR thực vài ngày Nếu trước có mục đích thí nghiệm khơng thể thực được, ngày với PCR mục đích lại thực cách dễ dàng Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử làm bước tiến nhảy vọt lĩnh vực Vậy nói PCR thực làm đại cách mạng sinh học phân tử Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng Phương pháp Kary Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương pháp PCR thực hoàn toàn eppendoff thời gian ngắn ta thu nhận nhiều DNA Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, giải mã di truyền, tạo giống với đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hoá sinh vật mức độ phân tử,… 1.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch Kỹ thuật PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai primer khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích khác thao tác gel Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn DNA đủ để tạo primer bổ sung chuyên biệt Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau : Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation) Giai đoạn thực nhiệt độ cao nhiệt độ nóng chảy phân tử (94 – 950C) vòng 30 giây đến phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành mạch đơn Chính mạch đơn đóng vai trị mạch khn cho tổng hợp mạch bổ sung Bước 2: (bắt cặp, annealing) Trong bước nhiệt độ hạ thấp nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer, cho phép primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 55 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) Nhiệt độ tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt Dưới tác động DNA polymerase, nucleotide gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian giai đoạn tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại tính sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: Là số chuỗi mã hóa, n: Là số chu kỳ Như vậy, qua chu kỳ nhiệt, DNA đích nhân thành hai sao; chu kỳ lặp lặp lại liên tục 30 đến 40 lần từ DNA nhân thành 230 đến 240 sao, tức đến hàng tỷ Hình 1: Hình ảnh Phản ứng PCR 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR - DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy DNA thật tinh Nhiều kỹ thuật chẩn đoán PCR đạt kết tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Lượng DNA mẫu sử dụng có xu hướng giảm (1µg xuống cịn 100ng) với việc sử dụng DNA polymerase có hiệu cao - Enzyme Taqpolymerase chịu nhiệt tách chiết từ vi khuẩn sống suối nước nóng Thermus aquaticus Enzyme khơng bị phá vỡ nhiệt độ biến tính Hàm lượng enzym ảnh hưởng lớn đến hiệu PCR Khi hàm lượng enzym q ít, khơng đủ tạo sản phẩm PCR cần thiết Ngược lại, nhiều enzym, tạo sản phẩm PCR không đặc hiệu Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho phản ứng tích 25 μl 0,5 U - Primer nhiệt độ lai Mồi đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid Để thực nhân đoạn DNA phản ứng PCR, cần có cặp mồi thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khn Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi mồi ngược Mồi xi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự mạch đơn DNA khơng mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp đầu 3’ mạch antisense Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense) bắt cặp cặp với mạch sense đầu 3’ (thanh,kt gen) Nồng độ mồi phản ứng 0,1-0,5 μM Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo số nguyên tắc sau: - Độ dài đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu Các đoạn mồi không nên chứa Nu giống xếp liên tiếp - Tỷ lệ G/C lý tưởng đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi không thấp - Hai đoạn mồi khơng có trình tự Nu bổ sung lẫn - Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa lúc cho enzyme tổng hợp DNA vào, không nên thấp nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi - Nhiệt độ nóng chảy mồi khơng nên cách xa, chênh lệch nhiệt độ lớn primer có Tm cao bắt cặp khơng đặc hiệu, cịn primer có Tm thấp lai với DNA - Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn 3kb chiều dài lý tưởng nhỏhơn 1kb - Vị trí đầu 3’ primer quan trọng việc kiểm sốt tượng “mismatch” – bắt cặp khơng đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T đầu 3’, mà thay vào G C mối liên kết hydro G – C mạnh A – T bảo đảm cho bắt cặp đặc hiệu - Các thành phần khác a Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) Nồng độ dNTP thường sử dụng 20 – 200 μM Nồng độ cao dễ dẫn đến khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, cân thành phần dNTP ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự cân thành phần dNTP làm tăng lỗi chép DNA polymerase b Nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Mg2+ cần cho trình liên kết dNTP, xúc tác cho enzymeTaq polymerase, làm tăng Tm DNA mạch kép Mg2+là Co – factor củaTaq polymerase nên lượng Mg 2+quá thấp Taq polymerase khơng thể hoạt động bình thường giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999), hạn chế trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg 2+cao giúp ổn định dây đôi DNA ngăn ngừa biến tính hồn tồn (do mở dây đôi DNA) sản phẩm chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR đi; đồng thời, làm cho tượng bắt cặp giả xảy ổn định cho sản phẩm mong muốn với số lượng lớn mức độ chuyên biệt thấp c Dung dịch đệm Một nồng độ cao dung dịch đệm PCR sử dụng để tăng cường hiệu cho phản ứng PCR Sau dung dịch đệm PCR xem tốt đệm có mặt thị trường - 16,6 mM ammoniumsulfate - 67,7 mM TRIS – HCl, pH 8,89 - 10 mM beta – mercaptoethanol - 170 microgams/ml BSA - 1,5 – mM MgCl2 d Số lượng chu kỳ phản ứng PCR Trong thực tế số chu kỳ cho phản ứng PCR không nên vượt 40 Sở dĩ phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn : Giai đoạn đầu: Số lượng tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu - Giai đoạn sau: Hiệu khuếch đại giảm hẳn phân hủy cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất sản phẩm phụ ức chế phản ứng, vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với Số chu kỳ cho phản ứng PCR tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu Nếu số lượng mẫu ban đầu 10 cần 25 – 30 chu kỳ Nếu số lượng mẫu ban đầu 102– 103 sốchu kỳ phải 35 – 40 chu kỳ 1.3 Ưu nhược điểm PCR * Ưu điểm - Thời gian thực cực nhanh: Chỉ cần để khuếch đại trình tự DNA quan tâm, so với phương pháp tạo dòng kỹ thuật tái tổ hợp DNA phải tuần lâu 10 1.4.3 Kĩ thuật Inversion- PCR phát đột biến đảo đoạn Phương pháp Inversion- PCR (I-PCR) miêu tả Rosetti cộng năm 2005 Quy trình gồm bước: (1) Cắt DNA enzym BclI,(2) Nối T4 ligate,(3) Khuếch đại phản ứng Multiplex PCR Phương pháp IPCR có ưu điểm dễ tiến hành Enzym BclI tác dụng đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym có tính đặc hiệu cao Sản phẩm PCR khuếch đại dễ dàng thời gian khoảng 30 phút đoạn DNA có kích thước ngắn (487 559 bp) Như xét nghiệm phân tích gen tiến hành nhanh chóng, kết thu có độ tin cậy cao, dễ thực Ứng dụng phương pháp phát đột biến đảo đoạn Intron 22 gây bệnh hemophilia A 1.4.4 Kỹ thuật ARMS (Amplification refractoy mutation system - hệ thống khuếch đại đột biến bền với nhiệt ) Nguyên tắc ARMS dựa khác biệt nucleotid mồi đầu 3’ thiết kế cho alen khác Chính vậy, ARMS cịn có số tên gọi khác vào chất kỹ thuật như: PCR đặc hiệu alen (allele specific PCR- ASP), khuếch đại PCR alen đặc hiệu (PCR amplification of specific alleles- PASA) hay khuếch đại alen đặc hiệu (allele specific amplification - ASA) Trong kỹ thuật ARMS, hai quy trình PCR tiến hành với khuôn DNA, mồi giống song khác mồi đặc hiệu allen Như vậy, phản ứng, mồi khuếch đại alen mồi khuếch đại alen khác Các mồi đặc hiệu cho alen khác biệt trình tự nucleotid đầu 3’, tương ứng với vị trí mà có khác biệt trình tự nucleotid alen Như vậy, trường hợp để phát đột biến điểm, phản ứng ARMS-PCR sử dụng loại mồi đặc hiệu mồi đột biến (khuếch đại đoạn gen đột biến), mồi bình thường (khuếch đại đoạn gen bình thường) với mồi chung 11 ngược chiều với cặp mồi mồi khác điểm đột biến đầu 3’ mồi Các sản phẩm tạo thành phân tích điện di gel agarose Kỹ thuật sử dụng trường hợp có nhiều cấu trúc đa hình thái, dịng tế bào mầm, đột biến tế bào soma, xác định tình trạng mang gen, chẩn đốn trước sinh bệnh lý di truyền phát biểu bệnh sau trình điều trị ung thư [2] * Ứng dụng Đối với 52 bệnh nhân chẩn đoán xác định bệnh β-thalassemia, để phát đột biến kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR nhằm phát loại đột biến phổ biến đột biến Cd26 (A>G) gây thể bệnh HbE, nguyên nhân gây 95% bệnh β-thalassemia Việt Nam , nhóm nghiên cứu sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho đột biến kỹ thuật ARMS-PCR, để phát đột biến điểm gây bệnh β-thalassemia Việt Nam 1.4.5 Kỹ thuật PCR ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) Phương pháp RT-PCR sử dụng để tổng hợp mạch kép DNA bổ xung (cDNA) từ mạch đơn mRNA (hình 3) Do Taq polymerase khơng hoạt động RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR - Trước hết, mRNA chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Mồi sử dụng oligonucleotide (oligo-dT) để bắt cặp với polyA mRNA, hexanucleotide (gồm nucleotide có trình tự ngẫu nhiên) bắt cặp ngẫu nhiên với trình tự ngắn phân tử RNA Phần lại sợi cDNA sau tổng hợp với có mặt loại desoxyribonucleosid triphosphat - Sợi RNA phân tử lai RNA-DNA sau bị thuỷ phân mơi trường kiềm, cịn sợi DNA khơng bị thủy phân mơi trường kiềm - Đầu 3’ DNA tổng hợp tạo hình trâm cài tóc làm mồi cho tổng hợp sợi DNA đối xứng nhờ enzym Taq polymerase 12 - Trâm cài tóc lại bị loại nuclease S1 nhận diện nucleotid liên quan để tạo sợi DNA kép hồn chỉnh Hiện nay, người ta thường sử dụng enzym phiên mã ngược tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu chuột, hay từ Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung thư tủy gia cầm Hình Các giai đoạn phản ứng RT-PCR với mồi oligo-dT Ứng dụng phản ứng RT-PCR: RT-PCR kỹ thuật có độ nhạy cao, cần lượng RNA thấp phát nhờ phản ứng khuếch đại Đây phương pháp thường sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh lý di truyền, ung thư, Với phân tích bán định lượng, xác định mức độ biểu RNA tế bào mô đánh giá hoạt động gen tương ứng RT-PCR sử dụng tiến hành phản ứng Northern blot để xác định đột biến phân tử RNA Ngồi ra, phản ứng chép ngược cịn hữu ích q trình giải trình tự gen tế bào Eukaryotic Phương pháp thường sử dụng nghiên cứu gen virus có gen RNA, chẳng hạn HIV, virus viêm gan C, 13 REAL-TIME PCR Trong kỹ thuật PCR sau hồn tất khuyếch đại đoạn DNA đích, tiếp tục làm số bước thí nghiệm để đọc kết xác định có sản phẩm khuyếch đại mong muốn ống phản ứng hay không, giai đoạn gọi thí nghiệm sau PCR Đặc trưng phản ứng real-time PCR phát sản phẩm khuếch đại trình chạy PCR sản phẩm khuếch đại từ DNA đích nhân đủ số lượng để làm cho ống phản ứng phát huỳnh quang (khi nhận nguồn sáng kích thích) Dựa vào xuất huỳnh quang ống phản ứng sớm hay muộn (hay chu kỳ ngưỡng phản ứng nhỏ hay lớn), biết số lượng DNA đích ban đầu có ống phản ứng [4] 2.1 Sự khác biệt real-time PCR PCR truyền thống So với PCR truyền thống, real-time PCR có nhiều ưu điểm hơn: - Real-time PCR kiểm soát lượng huỳnh quang giải phóng phản ứng, từ biết lượng sản phẩm PCR thời điểm (chu kỳ) trình khuếch đại Trái ngược với PCR truyền thống, biết lượng sản phẩm khuếch đại thời điểm cuối phản ứng chạy điện di gel sau phản ứng PCR kết thúc Mặt khác, gel agarose có nhiều hạn chế độ phân giải thấp, Do vậy, kết định lượng thường khơng xác - Độ đặc hiệu real-time PCR cao nhiều PCR truyền thống sử dụng mẫu dò đặc hiệu để phát sản phẩm khuếch đại, PCR truyền thống phân biệt sản phẩm PCR dựa vào kích thước băng sản phẩm PCR gel Trong phản ứng PCR, có nhiều trường hợp sản phẩm PCR khơng đặc hiệu có kích thước kích thước sản phẩm PCR mong muốn, nhầm lẫn 14 - Ở real-time PCR, khơng cần tiến hành thí nghiệm sau kết thúc phản ứng PCR chạy điện di gel, nhuộm gel,… giúp tiết kiệm thời gian hóa chất - Thời gian cho phản ứng real-time PCR 1-2h, PCR truyền thống phải từ 3-5h - Đặc biệt, real-time PCR hệ thống kín, có nguy tạp nhiễm 2.2 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR Trong phản ứng real-time PCR, kết khuếch đại DNA đích hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng thông qua biểu đồ khuếch đại phản ứng Biểu đồ có trục tung (Y) biểu cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích, trục hồnh (X) chu kỳ nhiệt (Hình 4) Trong chu kỳ đầu phản ứng, cường độ huỳnh quang thấp không thay đổi, hiển thị đường thẳng nằm ngang, giai đoạn gọi “giai đoạn ủ” Sở dĩ giai đoạn này, mặt dù DNA đích nhân thành số lượng chưa đủ để giúp phát ánh sáng huỳnh quang đủ cường độ để máy ghi nhận Khi số lượng DNA đích đạt đến ngưỡng định cường độ huỳnh quang phát tăng lên máy ghi nhận được, lúc đường biểu diễn khuếch đại bắt đầu lên Từ thời điểm trở đi, cường độ huỳnh quang tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt số lượng DNA tăng gấp đôi sau chu kỳ Giai đoạn gọi “giai đoạn lũy thừa” Cường độ huỳnh quang phản ứng tăng nhanh đến mức độ tăng chậm dần đạt đến bình nguyên Điều phản ứng cạn dần dNTP enzym Taq polymerase hoạt động khơng cịn hiệu quả, số lượng DNA đích khơng cịn tăng theo cấp số Giai đoạn gọi “giai đoạn bình nguyên” (hình 4) 15 Hình Biểu đồ khuếch đại phản ứng real-time PCR Phân tích đường biểu diễn khuếch đại phản ứng real-time PCR, cần lưu ý đến thông số quan trọng, chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Ct chu kỳ nhiệt mà thời điểm này, thiết bị real-time PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ phản ứng PCR bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Để xác định cường độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time PCR ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất phản ứng số chu kỳ đầu, gọi chu kỳ lấy trung bình cộng cường độ làm cường độ huỳnh quang Đường cắt ngang qua cường độ huỳnh quang gọi đường nền, hay baseline Như vậy, chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diễn khuếch đại (hình 4) Khi tiến hành phản ứng real-time PCR, số phản ứng có Ct sớm, nhiên có phản ứng Ct xuất muộn Đó Ct phụ thuộc vào số lượng DNA đích ban đầu có phản ứng Ct thấp số 16 DNA đích có mẫu thử ban đầu lớn ngược lại Dựa vào đặc điểm này, xác định số lượng DNA đích có mẫu thử ban đầu, điểm khác biệt so với PCR truyền thống Ở phương pháp truyền thống, đọc kết sau kết thúc phản ứng khuếch đại định lượng DNA đích sau hồn tất phản ứng Mà PCR, số lượng cuối khơng phản ánh xác số lượng DNA đích ban đầu có mẫu thử đa số trường hợp, số lượng DNA cuối ống phản ứng số lượng cực đại sau phản ứng PCR đạt giai đoạn bình nguyên) PHƯƠNG PHÁP MLPA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN Trong năm gần đây, MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) phương pháp ưu tiên chọn lựa chẩn đoán đột biến đoạn, lặp đoạn gen F8 Ngồi ra, MLPA cịn giúp chẩn đốn dị hợp tử với độ xác cao, cho kết nhanh chóng * Chuẩn bị prob Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế probe gắn đặc hiệu với đoạn DNA đích đóng vai trị quan trọng Thơng thường, probe chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác (hình 5): Hình Các giai đoạn kỹ thuật MLPA (Nguồn: Schouten, 2002) 17 - Phân tử oligonucleotid ngắn gồm đoạn: + Đoạn có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích lai với DNA đích tiến hành phản ứng lai Đoạn có khoảng 21-30 nucleotid nằm đầu 3’ probe + Đoạn nằm đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid đoạn giống cho tất probe Đây vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại probe tiến hành phản ứng PCR - Phân tử oligonucleotid dài gồm đoạn: + Đoạn 1’ chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích đầu tận 5’, + Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid đầu 3’, trình tự nucleotid giống cho tất probe Đây vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe, + Đoạn 3’ gọi đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm hai đoạn 1’ 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid khơng đặc hiệu với DNA đích nên khơng gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khác probe, probe khác có chiều dài khác Do đó, sản phẩm khuếch đại probe phân tách điện di * Các bước tiến hành phản ứng MLPA - Mẫu DNA hòa với μl TE biến tính 98°C 5’ - Cho hỗn hợp chứa đoạn oligonucleotid probe vào - Hỗn hợp ủ 60°C vòng 16 (qua đêm) Hai đoạn lai phân tử oligonucleotid gắn với DNA đích đặc hiệu vị trí sát - Cho enzym ligase vào ủ 54°C 15 phút, enzym lipase xúc tác, nối hai đoạn oligonucleotid probe lại với (hình 1.10) Phản ứng nối chấm dứt tăng nhiệt độ lên 98°C phút phản ứng PCR để khuếch đại probe 18 - Hai đầu 5’ 3’ probe có trình tự nucleotid hồn tồn giống nhau, vị trí gắn mồi tiến hành phản ứng PCR Do vậy, cần dùng cặp mồi khuếch đại tồn probe khác có hỗn hợp - Sau phản ứng PCR, probe khuếch đại thành nhiều Các probe khác có kích thước khác độ dài đoạn đệm chúng khác Do vậy, chúng phân tách phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuếch đại probe tỷ lệ thuận với số copy đoạn DNA đích đặc hiệu với probe * Ứng dụng phản ứng MPLA Để chẩn đốn đột biến đoạn lặp đoạn gen, người ta thiết kế probe gắn đặc hiệu với 26 exon gen Trong phản ứng PCR, khuyếch đại đồng thời probe đặc hiệu cho 26 exon gen mà sử dụng cặp mồi Như cần tiến hành phản ứng PCR, khảo sát đột biến exon gen F8 Dựa vào tính chất định lượng để phát dạng đột biến phương pháp MLPA Do đó, phương pháp lựa chọn để phát trường hợp phụ nữ mang gen có đột biến lặp đoạn hay đoạn gen F8 GIẢI TRÌNH TỰ GEN (DNA SEQUENCING) 4.1 Khái niệm DNA sở khoa học gen Phân tử DNA chuỗi xoắn kép hai mạch đơn cấu tạo từ loại nucleotid khác nhờ base chúng: A (adenine), C (cytosine), G(guanine), T(Thyamin) Các Nu nối liên trình tự xác định Giải trình tự gen nghĩa xác định thứ tự xếp loại nucleotid phân tử DNA 19 Ý nghĩa Giúp xác định vị trí gen NST, cho phép kết luận chất gen Có ý nghĩa việc tìm hiểu chức cấu trúc gen dòng gen Hiện nay, người ta thường sử dụng hai phương pháp giải trình tự phương pháp dideoxynucleotid giải trình tự máy tự động 4.2 Các phương pháp giải trình tự gen 4.2.1 Phương pháp enzym giải trình tự DNA Phương pháp F Sanger, Smith Coulson phát năm 1977 Nguyên lý phương pháp sau: Dideoxynucleotid (ddNTP) phân tử nhân tạo, cấu trúc tương tự phân tử deoxynucleotid (dNTP), nhiên carbon số đường deoxyribose khơng phải nhóm hydroxyl (– OH) mà – H (hình 9) Hình Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP Trong trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, dNTP tự gắn vào chuỗi tổng hợp liên kết phosphodieste 5’ phosphat với nhóm 3’ hydroxyl nucleotid cuối chuỗi (hình 10.A) Tuy nhiên, ddNTP gắn vào đầu 3’ chuỗi tổng hợp tổng hợp DNA dừng lại khơng hình thành liên kết phosphodieste với nucleotid (hình 6) 20 Hình Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) tổng hợp DNA bị ức chế (B) Hình Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 21 Các bước thực hiện: (a) Đoạn DNA cần giải trình tự đưa vào vector tách dòng (thường plasmid), vector mang đoạn DNA biến nạp vào tế bào E.coli để chọn lọc nhân dịng Sau tiến hành tách chiết DNA plasmid (b) Sử dụng đoạn mồi bổ sung với trình tự vector gắn vào đầu 3’ vector gần vị trí chèn DNA (c) Phản ứng tiến hành ống nghiệm, ống cung cấp thêm DNA polymerase, loại dNTP tự ( bốn loại dNTP đánh dấu phóng xạ) bốn dideoxynucleic (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Nồng độ ddNTP điều chỉnh thận trọng, thường dùng lượng nhỏ, khoảng 1% Trong trình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase gắn dNTP vào để kéo dài chuỗi Do hàm lượng thấp nên có dideoxynucleotid gắn vào chuỗi lúc phản ứng tổng hợp chuỗi bị dừng lại Như ống phản ứng chứa mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau, đầu 3’ đoạn DNA chứa ddNTP tương ứng cho vào ống (d) Tiến hành điện di ống phản ứng hàng gel polyacrylamid để phân tách đoạn DNA (e) Do dNTP có đánh dấu phóng xạ nên dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, mạch đơn gel điện di tạo vạch sáng phim X quang (f) Tổng hợp kết ống, thu mạch đơn có kích thước nucleotid Đoạn DNA ngắn di chuyển xa Trên ví dụ hình 15, đoạn ngắn xuất ống chứa ddATP, nucleotid tổng hợp chuỗi bổ sung Adenin Đoạn DNA ngắn thứ xuất ống chứa ddCTP, nucleotid thứ mạch DNA bổ sung 22 cytosin, Phân tích tương tự, biết trình tự đoạn mạch đơn tổng hợp xác định trình tự mạch DNA khn 4.2.2 Giải trình tự máy tự động Máy giải trình tự gen tự động hồn toàn thiết kế nguyên tắc sử dụng ddNTP F Sanger cộng phát minh Với máy hệ sau này, người ta dùng màu huỳnh quang khác để đánh dấu loại ddNTP Nhờ phản ứng giải trình tự thực ống nghiệm cần điện di hàng mà hàng khác trước đây, hệ thống điện di thường điện di mao quản Mỗi có vạch điện di qua, phân tử ddNTP cuối đầu 3’ đoạn DNA phát màu huỳnh quang tương ứng, máy ghi nhận màu sắc chuyển máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện nucleotid nào, từ biết trình tự DNA đích Hình Hình ảnh giải trình tự gen dystrophin Do ứng dụng to lớn kỳ diệu lĩnh vực, PCR thật làm đại cách mạng sinh học phân tử thời 23 điểm Với kỹ thuật công nghệ ngày tiến bộ, thuốc thử ngày rẻ tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày hạ đặc biệt việc sử dụng hệ thống nội chống ngoại nhiễm, thử nghiệm PCR khơng cịn thử nghiệm q cao cấp thực phịng thí nghiệm đại Có thể nói PCR hồn tồn triển khai phịng thí nghiệm trung bình nước phát triển TÀI LIỆU THAM KHẢO Radic CP, Rossetti LC, Larripa IB, De Brasi CD (2005) Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR Clin Chem, 51, 154158 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất y học: 28-119 Khất Hữu Thanh (2006), “Một số phương pháp sử dụng kỹ thuật gen”, Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 137-64 Phạm Hùng Vân (2009), “PCR dấu vân tay DNA”, PCR real-time PCA-Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất Y học Chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, tr 70-80 Khuất Hữu Thanh (2006), “ Nguyên lý kỹ thuật gen”, Kỹ thuật gen Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 102-53 Dương bá Trực, Nguyễn Thanh Liêm cộng sự: Áp dụng kỹ thuật ARMS-PCR chẩn đoán trước sau sinh bệnh beta-thalassemia bệnh viện nhi Trung Ương Domenech M, Tizzano EF, Baiget M (1995) Inversion of intron 22 in isolated cases of severe hemophilia A Thromb Haemost, 73(6-9) ... Trình bày kỹ thuật sinh học phân tử thông dụng sử dụng để xác định đột biến gen PHƯƠNG PHÁP PCR PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm nhân (tạo nhiều sao) đoạn DNA ống nghiệm mô máy sinh tổng... thuật protein để xác định chuỗi gen hay chuỗi acid amin gen, lập đồ gen khu vực định gen lồi cần chẩn đốn Đối với người, có nhiều phương pháp sinh học phân tử giúp phát đột biến gen gây nên bệnh... T(Thyamin) Các Nu nối liên trình tự xác định Giải trình tự gen nghĩa xác định thứ tự xếp loại nucleotid phân tử DNA 19 Ý nghĩa Giúp xác định vị trí gen NST, cho phép kết luận chất gen Có ý nghĩa