XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN SMN1 và số LƯỢNG bản COPY GEN SMN2 BẰNG kỹ THUẬT MLPA TRÊN BỆNH NHÂN và các THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH THOÁI hóa cơ tủy

46 146 0
XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN SMN1 và số LƯỢNG bản COPY GEN SMN2 BẰNG kỹ THUẬT MLPA TRÊN BỆNH NHÂN và các THÀNH VIÊN GIA ĐÌNH BỆNH THOÁI hóa cơ tủy

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH NGÂN X¸C ĐịNH ĐộT BIếN GEN SMN1 Và Số LƯợNG BảN COPY GEN SMN2 BằNG Kỹ THUậT MLPA TRÊN BệNH NHÂN Và CáC THàNH VIÊN GIA ĐìNH BệNH THOáI HóA CƠ TủY Chuyên ngành : Xét nghiệm Y học Mã số : 8720601 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI - 2019 CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Giải thích BN Bệnh nhân NST Nhiễm sắc thê THCT Thối hóa tủy SMA Spinal Muscular Atrophy MLPA Multiplex Ligation- dependent Pobe Amplification CK Creatinine kinase SMN telomeric survial motor neuron NAIP neoronal apotosis inhibitory protein MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG .3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Những hiêu biết về bệnh SMA 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu bệnh 1.1.2.Đặc điêm lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.3.Đặc điêm cận lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.4.Chẩn đoán phân biệt SMA .8 1.1.5.Đặc điêm về tần số mắc bệnh SMA .9 1.1.6.Di truyền học ý nghĩa xác định phả hệ bệnh SMA 1.1.7.Nguyên tắc phòng điều trị bệnh SMA .10 1.2.SMA góc đợ bệnh học phân tử 14 1.2.1.Các gene liên quan SMA 14 1.2.2 Các dạng đột biến cấu trúc gen SMN 17 1.3.Kỹ thuật MLPA phát đột biến gen SMN1 18 1.4.Tình hình nghiên cứu bệnh SMA Việt Nam 19 CHƯƠNG 20 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 20 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: .20 2.2 Địa điêm nghiên cứu 20 2.3 Thời gian nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 21 2.4.2 Cỡ mẫu kỹ thuật chọn mẫu .21 2.5.Sơ đồ nghiên cứu: 21 2.6 Công cụ kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 21 2.6.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu .21 2.6.2 Kỹ thuật xét nghiệm sử dụng nghiên cứu 23 2.7 Đạo đức nghiên cứu 30 CHƯƠNG 32 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Kết quả tách chiết DNA .32 3.2 Kết quả phân tích gia đình bệnh nhân thối hóa tủy 32 3.2.1 Kết quả gia đình bệnh nhân số 1: 32 3.2.2 Kết quả gia đình bệnh nhân số 32 3.2.3 Kết quả gia đình bệnh nhân số 32 3.2.4 Kết quả gia đình bệnh nhân số 32 3.2.5 Kết quả gia đình bệnh nhân số 32 3.2.6 Kết quả gia đình bệnh nhân số 33 3.2.7 Kết quả gia đình bệnh nhân số 33 3.2.8 Kết quả gia đình bệnh nhân số 33 3.2.9 Kết quả gia đình bệnh nhân số 33 3.2.10 Kết quả gia đình bệnh nhân số 10 .33 3.3 Kết quả tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh .33 3.3.1 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân thối hóa tủy 33 3.3.2 kết quả phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân nghiên cứu 34 CHƯƠNG 35 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 35 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 36 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .1 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA phát SMN1, SMN2 bệnh THCT 27 Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ độ tinh sạch mẫu DNA sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân nhóm chứng 32 Bảng 3.2 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố mẹ bệnh nhân 33 Bảng 3.3 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị bệnh nhân 33 Bảng 3.4 Tỷ lệ thành viên gia đình có không mang gen đột biến 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Teo tủy sống (Spinal muscular atrophy) Tàn phế nặng, ́u Bệnh nhân khơng kiêm sốt đầu Hình 1.2: Mô hình điện đồ Hình 1.3.Sơ đồ di truyền cả ba mẹ đều người mang gen bệnh .11 Hình 1.4: Sơ đồ khác biệt SMN1, SMN2 13 Hình 1.5: Nối hai phân tử mRNA mã hóa SMN (Trans-splicing) 14 15 Hình 1.6: Các gen SMN, NAIP liên quan đến SMA 15 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 2.2 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 25 Hình 2.3 Mẫu chứng nam bình thường 28 Hình 2.4 Kết quả MLPA người lành mang gen (1*SMN1, 2*SMN2) 28 Hình 2.5: Kết quả MLPA bệnh nhân 3*SMN1, 1*SMN2 28 Hình 2.6: Kết quả MLPA bệnh nhân nữ 4*SMN1, 0*SMN2 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Thối hóa tủy (Spinal muscular atrophy: SMA) mợt rối loạn thối hóa thần kinh, tự phát, đặc trưng yếu tiến triên SMA mô tả đầu tiên mô tả Werding vào năm 1893 sau Hoffman vào năm 1890 Đây một những bệnh lý thần kinh di trùn SMA coi bệnh thối hóa tự phát phổ biến thứ hai trẻ em Tần số mắc bệnh cũng cao ước tính khoảng 1/6000 ÷ 1/10000 trẻ sinh sống với tần suất người lành mang gene đợt biến 1/38÷ 1/50 ,, Bệnh SMA gây thối hóa t̀n tiến tế bào thần kinh sừng trước tủy sống dẫn đến suy ́u thối hóa đối xứng gốc chi, trương lực giảm, phản xạ gân xương giảm hoặc mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực cứng khớp Đây một đột biến di truyền lặn nằm nhiễm sắc thê thường, cả cha mẹ đều người mang gen bệnh thì khả sinh bị bệnh 25% Dựa vào mức độ nặng nhẹ bệnh lâm sàng tuổi xuất SMA chia làm thê , Thê I gọi bệnh Werdnig- Hoffman, thê nặng nhất Bệnh nhân mắc thê I không thê ngồi hoặc nâng đầu Bệnh nhân thê II có thê ngời, bệnh nhân thê III có thê tự đứng một mình hoặc lại mất khả lại vào tuổi thiếu niên, hoặc thậm chí vào tuổi trưởng thành Trong thê I thê II thê bệnh chiếm ¾ trường hợp, bệnh nhân tử vong năm đầu tiên hoặc muộn lứa tuổi học biến chứng viêm phổi suy hô hấp Thê III thê nhẹ, bệnh xuất muộn hơn, bệnh tiến triên chậm bệnh nhân có thê sống đến tuổi trưởng thành Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biêu chủ yếu tế bào thần kinh vận động tủy sống (spinal motor neuron) Gen SMN có hai bản rất giống SMN1 SMN2 Cả hai gen SMN1 SMN2 đều tổng hợp protein tương ứng, nhiên khác một vài nucleotid nên SMN1 tổng hợp protein có chức năng, protein gen SMN2 tổng hợp có chức rất hạn chế Các tác giả khẳng định đột biến gen SMN1 nguyên nhân chinh gây nên bệnh SMA Theo nhiều nghiên cứu 94-99% bệnh nhân SMA đột biến mất đoạn exon 7; gen SMN1, 3-6% đột biến điêm Đột biến xóa đoạn đợt biến dễ xác định, đợt biến điêm khó xác định nhiều đợt biến khơng có tính tập trung vào mợt số vị trí đặc hiệu mà nằm rải rác khắp chiều dài gen Trong cộng đồng, với tỷ lệ người lành mang gen đợt biến cao 1/38÷ 1/50, tần số mắc bệnh cũng rất cao 1/6000 ÷ 1/10000, bệnh với dấu hiệu nguy hiêm, tỷ lệ tử vong cao, đê lại di chứng nặng nề Do vậy bệnh thực không chi một vấn đề lớn bản thân người bệnh mà còn gánh nặng gia đình xã hội Mặc du SMA nguy hiêm vậy chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, phần lớn chi điều trị triệu chứng nên hầu hết bệnh nhân tử vong sớm Do vậy cần phải chẩn đốn sớm đợt biến gen SMN1 bệnh nhân, từ tiến hành phát người lành mang gen bệnh (bố, mẹ, anh chị em,…) đê quản lý hạn chế lan truyền gen bệnh cợng đờng Bên cạnh đó, cần tiến hành chẩn đoán trước sinh nhằm phát thai nhi mắc bệnh đê có hướng xử tri kịp thời, hạn chế tổn thương cho gia đình xã hội Hiện Việt Nam, một số tác giả sử dụng kỹ thuật PCR enzyme cắt giới hạn đê chẩn đốn bệnh thối hóa tủy, nhiên phương pháp chi phát bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát kiêu gen dị hợp tử, vậy bỏ sót tổn thương Hiện nay, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) phương pháp ưu tiên chọn lựa chẩn đốn đợt biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng phát kiêu gen dị hợp tử với độ chinh xác cao cho kết quả nhanh chóng Xuất phát từ thực tiễn chúng tiến hành đề tài với hai mục tiêu: Xác định đột biến gen SMN1 kỹ thuật MLPA bệnh nhân thành viên gia đình mắc bệnh thối hóa tủy Xác định số bản copy gen SMN2 kỹ thuật MLPA bệnh nhân thành viên gia đình bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những hiểu biết về bệnh SMA 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Từ năm 1891 Guido Werdnig một nhà thần kinh học người AUStralia, lần đầu tiên mơ tả đặc điềm lâm sàng bệnh thối hóa tủy hai anh em bi bệnh tuổi bú mẹ Cho đến năm 1893 Johan Hoffmann một nhà thần kinh học người Đức, cũng mô tả biêu lâm sàng bệnh nhân hai gia đình bi bệnh thối hóa tủy Sau nhiều năm, Brandt (1949) nghiên cứu 112 bệnh nhân thuộc 70 gia đình đưa kết luận bệnh di truyền lặn NST thường Sau nghiên cứu này, nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố sau cũng cho kêt luận tương tự Kugelberg Welander (1956) mô tả đặc điêm 12 bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy thê III có đợ tuổi từ đễn 17 đều có khả lại nhất 8-9 năm sau triệu chứng đẩu tiên xuất Dựa triệu chứng lâm sàng, Fried Emery (1971) đưa thê bệnh trung gian hay còn gọi thối hóa tủy thê II, nhóm bệnh nhân tḥc thê đặc điêm trung gian giữa bệnh thối hóa tủy thê I thê III Nhờ tiến bộ không ngừng ngành di truyền học phân tử, vào năm 1990 bệnh thoái hóa tủy nghiên cứu xác định vung gen gây bệnh nằm cánh dài NSTsổ vung 5q11.2 … 5q 13.3 Hội nghị quốc tế về bệnh thối hóa tủy diễn vào thảng năm 1992 tại Bonn (Đức) đưa tiêu chuẩn lâm sàng chẩn đoán bệnh SMA Năm 1995, việc phát đột biến mất đoạn vị tri cánh dài NST số tiếp khẳng định Lefebvre Các nghiên cứu cho thấy có hai gen liên quan đến bệnh thối hóa tủy gen SMN1 (telomeric survial motor neuron) NAIP (neoronal apotosis inhibitory protein), gen SMN1 ngun nhân bệnh, 94-99% bệnh nhân SMA đột biến mất đoạn exon 7; gen SMN1, 3-6% đột biến điêm Năm 1999, tại hội nghị quốc tế lần thứ 59 trung tâm thân kinh Châu Âu (ENMC: Euro Neuromuscular Centrer) tiếp tục bổ xung tiêu ch̉n chẩn đốn bệnh thối hóa tủy 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.2.1 Đặc điểm chung và phân loại Bệnh thối hóa tủy có biêu triệu chứng lâm sàng Rất đặc trưng tổn thương tế bào thần kinh sừng trước tủy sống, làm cho trẻ có biêu nhược sớm, không phát triên vận động, teo bệnh tiến triên nặng Dần, mất khả vận động, suy hô hấp tử vong mắc bệnh nhiễm trung viêm phổi vậy, bệnh cũng dễ chẩn đoán nhầm với bệnh lý về nguyên nhân khác bản thân bệnh thối hóa tủy, triệu chứng lâm sàng cũng khác giữa thê lâm sàng nguyên nhân gây bệnh khác nhau: đột biến gen khác nhau, loại đột biến khác cũng gây kiêu hình(phenotype) khác lâm sàng Bệnh SMA một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thê thường nên bệnh có tinh chất gia đình, tỷ lệ tỷ lệ bệnh giữa trẻ trai trẻ gái hàng ngang theo công bố Nguyễn Ngọc Cảnh năm 2005 thì ti lệ Nam nữ /1,5 một nghiên cứu Trong vòng năm từ 2004 đ 2006 với số lượng 75 bệnh nhân tại qua nợi tiết chun hóa di truyền, bệnh viện Nhi Trung Ương nghiên cứu AHM.Lai(2005) tỷ lệ bệnh nhân SMA Nam thiên nữ 1/1,3 Dựa vào mức độ nặng lâm sàng tuổi biêu mà người ta chia thành hóa tủy thành thê: Type I Type II Phân loại Spinal Muscular Atrophy (SMA) Phân loại cổ điển Bệnh Werdnig-Hoffman cấp tính khới phát < tháng Bệnh Werdnig-Hoffman mạn tính khởi phát 6-24 tháng Bệnh Kugelberg-Welander khởi phát > 24 tháng Phân loại hiện Nặng - không thê ngồi, thường tử vong tuổi nhũ nhi Trung bình - chẩn đốn tuổi nhũ nhi, khơng thê ngồi, tử vong Type III 20-30 tuổi Nhẹ - chẩn đốn sau tuổi, ít, thường ngừng trước bước Type I Type II Type III vào tuổi thiếu niên 1.1.2.2 Thoái hóa tủy thể I Là thê bị nặng nhất chiếm 25% thê bệnh lâm sàng còn gọi bệnh Werdnig - Hofmann theo báo cáo Nguyễn Ngọc Khánh công bố 2005 thì 26 + Đoạn nằm đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid đoạn giống cho tất cả probe Đây vị trí gắn với mời Y đê kh́ch đại probe tiến hành phản ứng PCR -Phân tử oligonucleotid dài gồm đoạn: + Đoạn 1’ chứa 25 – 43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích đầu tận 5’ + Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid đầu 3’, trình tự nucleotid giống cho tất cả probe Đây vị trí gắn với mời X đặc hiệu đê khuếch đại probe + Đoạn 3’ còn gọi đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid khơng đặc hiệu với DNA đích nên khơng gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn Stuffer khác probe, vì vậy probe khác se có chiều dài khác Do đó, sản phẩm khuếch đại probe se phân tách bằng cách điện di Trong mỗi phản ứng chứa probe nội chuẩn, probe nội chuẩn lên đỉnh tương ứng điều kiện đảm bảo độ tin cậy nhận định kết quả Ngồi chúng tơi sử dụng chứng DNA người bình thường chạy song song cung mẫu bệnh nhân đê so sánh Sau phản ứng PCR, mỗi probe se khuếch đại thành nhiều bản Các probe khác se có kích thước khác độ dài đoạn đệm chúng khác Do vậy, chúng se phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuếch đại mỗi probe se tỷ lệ thuận với số bản coppy đoạn DNA đích đặc hiệu với probe 27 Bảng 2.1 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA phát SMN1, SMN2 bệnh THCT SALSA MLPA probe Vị trí probe NST, gen Q-fragments (chỉ dung với mẫu DNA nồng độ

Ngày đăng: 07/08/2019, 20:24

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • 1.1. Những hiểu biết về bệnh SMA

    • 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh

    • 1.1.2. Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân SMA

    • 1.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân SMA

    • 1.1.4. Chẩn đoán phân biệt SMA

    • 1.1.5. Đặc điểm về tần số mắc bệnh SMA

    • 1.1.6. Di truyền học và ý nghĩa xác định phả hệ bệnh SMA

    • 1.1.7. Nguyên tắc phòng và điều trị bệnh SMA

  • 1.2. SMA dưới góc độ bệnh học phân tử

    • 1.2.1. Các gene liên quan SMA

    • 1.2.2. Các dạng đột biến cấu trúc gen SMN

  • 1.3. Kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến gen SMN1

  • 1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh SMA ở Việt Nam

  • 2.1. Đối tượng nghiên cứu

    • 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu:

    • 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ:

  • 2.2. Địa điểm nghiên cứu

  • 2.3. Thời gian nghiên cứu

  • 2.4. Phương pháp nghiên cứu

    • 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

    • 2.4.2. Cỡ mẫu và kỹ thuật chọn mẫu

  • 2.5.Sơ đồ nghiên cứu:

  • 2.6. Công cụ và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

    • 2.6.1 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

    • 2.6.2. Kỹ thuật xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu

  • 2.7. Đạo đức nghiên cứu

  • 3.1 Kết quả tách chiết DNA

  • 3.2. Kết quả phân tích các gia đình bệnh nhân thoái hóa cơ tủy

    • 3.2.1. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 1:

    • 3.2.2 . Kết quả của gia đình bệnh nhân số 2

    • 3.2.3. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 3

    • 3.2.4. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 4

    • 3.2.5. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 5

    • 3.2.6. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 6

    • 3.2.7. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 7

    • 3.2.8. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 8

    • 3.2.9. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 9

    • 3.2.10. Kết quả của gia đình bệnh nhân số 10

  • 3.3. Kết quả tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh

    • 3.3.1. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh của các thành viên trong gia đình bệnh nhân thoái hóa cơ tủy

    • 3.3.2. kết quả phân tích phả hệ các gia đình bệnh nhân nghiên cứu

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan