Phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion Arms

Từ kết quả thu được, một quy tr nh xét nghiệm đột biến gen trong điều trị BN UTPKTBN được thiết lập như sau: Trước tiên, xác định đột biến gen ở tế bào mô ung thu bằng kỹ thuật giải tr n[r]

PHÁT HIỆN ĐỘT BIÉN GEN EGFR BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH Tự GEN VÀ SCORPION ARMS

Clf Phạm Lê A nh Tuấn*

H ướng dẫn: TS Trần Văn Khánh* TÓM T T

Liệu pháp điều trị đích hứa hẹn liệu pháp điều trị mởi mang lại hiệu cao cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi không tể bào nhỏ (ƯTPKTBN), nhiên tất cà BN ung thư đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích Nhiều nghiên cứu chứng minh mối tương quan chặt chẽ đột biến gen EGFR hiệu đáp ứng ỉhuốc điều trị đích khối u Nghiên cứu tiến hành vởi mục tiêu: Xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân ƯTPKTBN kỹ thuật giải ír nh tự gen kỹ thuật Scorpion ARMS 42 BN UTPKTBN ỉựa chọn để tiển hành nghiên cứu; kỹ thuật giãi tr nh tự gen kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions­Amplification Refractory Mutation System) ứng dụng để xác định đột biến gen EGFR mẫu mô ung thư Kêt cho thấy 16/42 BNƯTPKTBN xác định có đột biến exon 18, 19,21 gen EGFR

* Từ khóa: ưng thư phổi khơng tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR

Detection o f egfr mutation in non small cell lung cancer Summary

Targeted therapy is a potential therapy for non small cell lung cancer However, not all of patients have good response with targeted drugs Previous studies demonstrated the dose relationship between EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) mutation and the response of targeted drugs with tumor The aim of this study is to identify of EGFR mutations in non small lung cancer patients by sequencing and Scorpions ARMS (Scorpions-Amplification R fractory Mutation Syst m) and compare sequencing and Scorpions ARMS techniques in identifying EGFR mutations of non small cell lung cancer 42 non small cell lung cancer patients were selected for this study; sequencing and Scorpions ARMS were applied to identify mutations Results showed that 16/42 non small cell lung cancer patients have EGFR mutations in exon 18, 19, 21

* Key words: Non small cell lung cancer; EGFR mutation I; Đ Ặ TV Á N Đ Ẻ

Ưng thư phổi bệnh lý ung thư chiếm tỷ lệ cao có tỷ lệ tử vong hàng đầu írên giới Việt Nam [1] Ưng thư phổi chia làm thể: thể không tể bào nhỏ (non­small cell ỉung cancer) chiếm khoảng 85% thể tế bào nhỏ (small cell lung cancer) chiếm khoảng 15% Thuốc ỉà nguyên nhân gây 90% trường hợp ung thư phổi nam 78% nữ [2, 3, 4] Chẩn đoán sớm bệnh ung thư điều trí phác đồ đóng vai trị quan trọng nhằm gia tăng thời gian sống cho bệnh nhân (BN) Bên cạnh phương pháp điều trị truyền thống phẫu thuật, hóa trị, xạ trị.,., nhà khoa học nghiên cứu íhế hệ thuốc tác động trực tiếp ỉên thụ thể tế bào nhằm ức chế phát triển tế bào ung thư Thế hệ thuôc gọi liệu pháp điều trị trúng đích (targeted therapy­LPĐTTĐ) [5] LPĐTTĐ hứa hẹn liệu pháp điều trị mới, có hiệu cho BN ung thư phổi khơng tế bào nhỏ (ƯTPKTBN), Tuy nhiên, tất BN ung thư đáp ứng tốt với íhuổc điều trị đích, hiệu thuốc phụ thuộc vào t nh trạng gen nằm đường tín hiệu EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) tế bào Nhiều nghiên cứu chứng minh moi liên quan chặt chẽ đột biến gen EGFR với mức độ đáp ứng thuốc khối u LPĐJ 1Đ' Khoảng ỉ " 40% BN ƯTPKTBN có đột bien exon 18, 19, 20 gen EGFR Đột biển gen EGFR mã hóa protein EGFR có lực mạnh với thuốc điều trị đích, đó, BN UTPKTBN có đột biến gen EGFR

thường đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích [6] Việc xác định đột biến gen EGFR BN UTPKTBN giúp cung cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ lâm sàng để định LPĐTTĐ Có nhiều kỹ thuật phát đột biến gen EGFR Tuy nhiên, độ nhạy kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tể bào ung thư mẫu mơ phân tích Hai kỹ thuật sử dụng phổ biển để xác định đột biến gen EGFR giải tr nh tự gen Scorpions ARMS Kỹ thuật giải tr nh tự gen có giá thành rẻ, trường hợp mẫu mô xét nghiệm có tế bào ung thư th đột biến gen không phát kỹ thuật Scorpions ARMS kỹ thuật có độ nhạy cao, phát đột biến gen EGFR khỉ aỉen đột biển chiếm tỷ lệ nhỏ; giá thành cao, nên kỹ thuật khó áp dụng với qui mơ lớn BN ung thư Với mục đích xây dựng quy tr nh xác định đột biến gen xác, giá thành phù hợp vói điều kiện BN Việt Nam, nghiên cứu thực với mục tiêu: Xác định đột biển g n EG FR B N U TPK TBN kỹ thuật giải trình tự g n Scorpions ARM S

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 Đối tượng nghiên cứu

42 mẫu mô BN UTPKTBN đúc block parafin thu thập Bệnh viện K Hà Nội, Bệnh viện Hữu Nghị, Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Những BN chẩn đốn xác định dựa vào kết mơ bệnh học, BN không mắc loại h nh bệnh tật hay ung thư khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu ­ Kỹ thuật tách chiết A D N

Tách chiết ADN từ mẫu mô đúc parrafin BN theo qui tr nh phenoỉ/chỉoroform sau lựa chọn xác vùng tế bào ung thư Trước tách chiết phenol/chloroform, loại bỏ parafin mô đúc xyỉen Xác định nồng độ độ tinh ADN tách chiết máy Nano­Drop, mẫu ADN đạt giá trị OD 280/OD2ỔO > 1,8 sử dụng để phân tích

­ Kỹ thuật giải trình tự g n

Sau khuyéch đại vùng exon 18, 19, 20, 21 gen EGFR kỹ thuật nested PCR, sản phẩm PCR tinh từ gel agarose, sử dụng Promega Wizard s v gel clean­up system (Prom ga, USA), au đồ đưa vào giải tr nh tự phương pháp BigDye terminator sequencing (Appli d Biosyst ms, Fost r city, USA) Đối chiếu so sánh tr nh tự gen với tr nh tự gen EGFR hoang dại (wild type) GeneBank (National c nt rfo r biot chnology information, NCBỈ)

- Kỹ thuật Scorpions-Amplification R fractory Mutation Syst m (Scorpions AR M S)

ra KẾT QUA E18

*— 281 bp H nh H nh ảnh điện sản phẩm nested PCR khuểch đại cệc exon 8,19,20,2 gen EGFR

EJ8, EĨ9, E20, E2 ỉ: Kết PCR xon ĩ 8, ĩ 9, 20, 2Ĩ; (+): Mau đổi chứng dư ng; (-): Mau đối chúng âm; MK: Mark r 6174

H nh ảnh điện di cho thấy sản phẩm khuếch đại exon gen EGFR băng đặc hiệu có kích thước tương ứng: Exon 18 ~ 400bp; Exon 19 ­ 349bp; Exon 20 ~ 410bp; Exon 21~ 374bp Sản phẩm PCR sau tinh từ gel agarose giải tr nh tự so sánh với mẫu người b nh thường để xác định đột biến

A CjTG

< :< Q iG C ir «3#43'CS J tk A

CTG > CGG L858R

_ ĩ

o css­<B<zr <3­ <3­ <3T<ZÍ<r 5PV

B nh thường ; c T G G C C T

Binh thường

Bệnh nhân L1 GGOAGC

G719S

c X o m a 1

Bệnh nhân L41

BN LI mang đột biến CTG>CGG vị trí 2573 thuộc exon 21 gen EGFR (đột biến L858R); BN L14 bị đột biến xóa 15 nucỉeot t vị trí 2235 thuộc exon 19 gen EGFR (đột bién LREA deletion); BN L41 bị đột biến GGC>AGC vị trí 2155 exon 18 gen EGFR (đột biến G719S)

Kết giải tr nh tự phát thấy đột biến EGFR 13 BN UTPKTBN khác; đó, BN L28 nghi ngờ mang đột biến L858R (tín hiệu đột biến thấp) BN L28 kiểm tra ại với kỹ thuật Scorpions ARMS, kết cho thấy BNmang đột biến L858R (h nh 3)

i í* cHMhxbl

unỉ

mđ­­­

H nh Kết qua Scorpion ARMS cua BN mã số L28

Kết qua Scorpions ARMS khẳng định bệnh nhân L28 mang đột biến L858R 26 BN ƯTPKTBN không thây đột biến kỹ thuật giải tr nh tự gen kiểm ứa lại kỹ thuật Scorpions ARMS, kết cho thấy BN đột biến gen EGFR mẫu mơ ung thư

Tổng họp kết kỹ thuật cho phép xác định 16/42 BN ƯTPKTBN mang đột biến gen EGFR (bảng 1) Bảng Đột biến gen EGFR BN ƯTPKTBN

STT M ã số BN Thể bệnh Đột biến

ỉ LOI K phổi L858R

2 L14 K phế quản LREA deletion

3 L16 K phê quản LREA deletion

4 L22 K phế quản LREA de etion

5 L21 K phế quản LREA deletion

6 L28 K phôi L858R

7 L30 Kphổi L858R

8 L33 K phê quản LREA deletion

9 L34 Kphôi LREA deletion

ỈO L40 Kphôi L858R

n L41 K phế quản G719S

12 L45 K phê quản LREA deletion

13 146 K phế quản L858R

14 L51 K phôi LREA deletion

15 L55 K phế quản L858R

IV BÀN LUẬN

Trong nghiên cứu này, việc xác định đột bién gen EGFR exon 18, 19, 20, 21 tiến hành 42 BN UTPKTBN Kết cho thấy 16/42 BN ƯTPKTBN có đột biến gen EGFR V có giá thành thấp nên kỹ thuật giải tr nh tự gen tiến hành trước tiên để xác định đột biến, nhiên, số trường hợp, số lượng tế bào ung thư lấy khơng xác vùng ung thư, đột biến cùa gen không phát kỹ thuật Scorpions ARMS kỹ thuật nhanh nhạy để phát đột biến gen EGFR, cho dù alen đột biến chiểm tỉ lệ nhỏ tổng số sợi khuôn ADN [7] Trường hợp nghi r> TỊ' ĨT’ " Ĩ 'Í ? Ị h t í r 'M A i ’ Í=ỊA* V ­* ~ f ụ é r » \ lÝ ỉr­ị­ l í ­ i x r A ti a U T k iC

iigư íĩicuig UỤiL 7ỈC ĨÌgCu Liui ivi u i n i i iiii lỉỉCU UỌi ulCii Inajj/ uuyC KiittugU U I 1 iẹũ vơi Ky Inũặí õCuĩlỡiiS rtiuvio 26 BN UTPKTBN không thấy đột biến kỹ thuật giải tr nh tự gen kiểm tra lại kỹ thuật Scorpions ARMS có kết tương tự giải tr nh tự gen

Đây lần kỹ thuật Scorpion ARMS thực Việt Nam Kỹ thuật cho phép phát đột biến gen cách xác mơ phân tích có tỷ lệ tế bào ung thư thấp Điều có ý nghĩa đặc biệt BNung thư, tạo điều kiện cho BN nhanh chóng áp dụng phác đồ điều trị hiệu [8] Từ kết thu được, quy tr nh xét nghiệm đột biến gen điều trị BN UTPKTBN thiết lập sau: Trước tiên, xác định đột biến gen tế bào mô ung thu kỹ thuật giải tr nh tự, sau trường hợp có kết nghi ngờ âm tính xác định lại kỹ thuật Scorpions ARMS

Theo thống kêt tỷ lệ đột biến gen EGFR 10 ­ 40% BN UTPKXBN [7, 9] s ố lượng mẫu nghiên cứu hạn chế, kết thu tương tự công bố trước Việc xét nghiệm đột biến gen EGFR ƯTPKTBN có ý nghĩa quan trọng, giúp đua chứng xác t nh trạng gen, từ bác sĩ lâm sàng định phác đồ điều trị có hiệu BN

V KẾ T LUẬN

­ Bằng kỹ thuật giải tr nh tự gen Scorpions ARMS phát đựợc 11/42 BN UTPKTBN có đột biến gen EGER

­ Kỹ thuật Scorpion ARMS giúp khẳng đinh trường hợp h nh ảnh đột biến gen không rõ ràng với kỹ thuật giải trinh tự gen

TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1 Jemal A, Siegel R, Ward E (2008), Cancer statistics, CA Canc r J Clin, 58,71­96

2 Sato M, Shames DS, Gazdar AF, Minna JD (2007), A translational view of the molecular pathogenesis of lung cancer J Thorac Oncol 2, 327­343

3 Wistuba n, Mao L, Gazdar AF (2002), Smoking molecular damage in bronchial epithelium Oncog n , 21, 7298­7306

4 Lê Trần Ngoan (2010), T nh h nh tử vong ung thư Hà Nội Thái Nguyên, 2005­2008 Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học

5 Lievre A, Blons H (2010); Oncogenic mutation as predictive factor in colorectal cancer, Oncog n 29, 3033­3043

6 Amado RG, Wolf M (2008), Wild­type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer, J Clin Oncol ,1626­34

7 Hisayuki s., Li L., Takao T, et al (2005), Clinical and Biological Features Associated With Epidermal Growth Factor Receptor Gene Mutations in Lung Cancers, Journal ofth National Canc r In stitut 97(5), pp 339­346

8 Mok T.S., Wu Y.L., Thongprasert s et al (2009), Gefitinib or Carboplatin­Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma, NEngJM d., 361(10), 947­958