Đánh giá methyl hóa bất thường trên gen APC và DAPK trong ung thư vú tại Việt Nam: Tổng hợp dữ liệu và nghiên cứu thực nghiệm

Khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp

- Tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu APC, DAPK trên bộ mẫu bệnh phẩm hoặc bộ mẫu đối chứng. - Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue,…) - Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch – chủng tộc.

Khảo sát thực nghiệm

- Bổ sung một luợng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và một luợng ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi. Nhằm xác định nồng độ, hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bộ gen sau tách chiết, chuyên đề khóa luận áp dụng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 260 nm và 280 nm. - Phản ứng pcr thứ nhất khuếch đại phổ quát vùng trình tự mục tiêu: vùng trình tự promoter gen APC hoặc DAPK, bao quanh các vị trí “hot spot”.

Chú thích: Ta (Temperature annealing): nhiệt độ lai tối ưu với từng cặp mồi trong quy trình Nested- MSP; x: số chu trình luân nhiệt; NC (Number of cycle): số chu kì. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào tính chất nucleic acid (DNA) tích điện âm, vì vậy DNA có khả năng di chuyển về phía cực dương trong điện trường. Sự hiện diện của các phân tử nucleic acid (DNA) trong gel agarose được phát hiện dưới tác động của tia tử ngoại (UV) và chất nhuộm GelRed.

Kết quả điện di được thể hiện thành các băng sản phẩm với chất nhuộm (Gel Red) trên máy đọc gel (thiết bị Gel Doc). - Bên cạnh đó, dự kiến chọn lọc sản phẩm Nested-MSP dương với cặp mồi đặc hiệu với trạng thái allele methyl hóa hoặc allele không bị methyl hóa để gửi giải trình tự nhằm kiểm tra, khẳng định hiệu quả của quy trình Nested-MSP trong việc phân tích tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu liên quan đến bệnh ung thư vú, đối với một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở người Việt Nam.

Kết quả khảo sát bộ mồi trong quy trình MSP

Dựa vào một số công bố khoa học trên thế giới, chúng tôi thu thập các bộ mồi thuộc phương pháp MSP cho phép khảo sát tính chất methyl hóa gen APC và DAPK thông tin chi tiết của các bộ mồi được trình bày ở Bảng IV.1. (1): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc hairpin (kcal.mole);. (2): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer (kcal/mole);.

(3): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole);. Song song, chúng tôi khảo sát vị trí bắt cặp, tính đặc hiệu của các bộ mồi trên vùng trình tự mục tiêu bằng công cụ Annhyb và công cụ Blast (Phụ lục). Bộ mồi APC_F & APC_R, APC_MF & APC_MR, APC_UF & APC_UR khuếch đại đặc hiệu trạng thái allen có hoặc không bị methyl hóa của vùng trình tự promoter gen APC.

Bộ mồi DAPK_F & DAPK_R, DAPK_MF & DAPK_MR, DAPK_UF & DAPK_UR khuếch đại đặc hiệu trạng thái allen có hoặc không bị methyl hóa vùng trình tự promoter gen DAPK, tại đảo CpG thứ I.

Kết quả khảo sát tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK bằng phương pháp Nested-MSP

Chúng tôi thực hiện các phản ứng PCR trong quy trình Nested-MSP với cặp mồi DAPK_F &. Sản phẩm phản ứng Nested-MSP được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1,5% được trình bày ở hình IV.6. Kết quả điện di ghi nhận ở các giếng (M) tương ứng với sản phẩm khuếch đại trạng thái allen bị methyl hóa của 6 mẫu bệnh phẩm đều cho băng sáng với kích thước như dự kiến (172 bp hoặc 176 bp).

6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP của gen DAPK trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú. 7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP của gen DAPK trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú. Hạn chế của nghiên cứu này là thực hiện với rất ít mẫu bệnh phẩm ung thư vú và không triển khai phân tích trên bộ mẫu lành, tuy nhiên, các kết quả phần nào phản ánh đặc điểm tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC và DAPK trên các mẫu bệnh phẩm (mụ vỳ đỳc paraffin) ở Việt Nam.

Đồng thời, để làm rừ hơn tớnh chất methyl hóa trên gen APC và DAPK theo một số phân hạng về bệnh học ung thư vú và tương ứng với nội dung phân tích tổng hợp nêu trên, nội dung chuyên đề khóa luận xác định tần số methyl hóa trên gen APC và DAPK theo một số phân hạng: độ tuổi sớm (<50 tuổi) và độ tuổi muộn (≥50), sự biểu hiện ER (thụ thể estergone), PR (thụ thể progesterole), HER2/NEU: âm và dương; sự biểu hiện “Triple-negative” của ER, PR, HER2/NEU”. 4Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen APC trên bộ mẫu ung thư vú. Chú thích: (%*) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa trên từng phân hạng so với tổng số.

5 Tính chất methyl hóa và unmethyl hóa trên vùng promoter gen DAPK trên bộ mẫu ung thư vú. Chú thích: (%*) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa trên từng phân hạng so với tổng số. Tổng kết lại kết quả nghiêu cứu thực nghiệm chỉ triển khai trên rất ít mẫu bệnh phẩm ung thư vú (<10 mẫu), tuy nhiên, các kết quả phân tích này cung cấp thêm thông tin về tính chất methyl hóa trên một số gen mục tiêu – tương ứng với dấu chứng sinh học tiềm năng phù hợp trên người bệnh Việt Nam (so với bộ dữ liệu đã công bố của cùng nhóm nghiên cứu).

Mặt dù nghiên cứu tồn tại một số hạn chế, nhưng kết quả nghiên cứu phần nào bộc lộ đặc điểm tính chất methyl hóa bất thường trên vùng gen mục tiêu: APC và DAPK trên bộ mẫu ung thư vú, tạo nên tiền đề phát triển hướng nghiên cứu về dấu chứng sinh học trong tiên lượng, chẩn đoán bệnh ung thư vú.