Ứng dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (wes) nhằm xác định biến đổi gen liên quan trên bệnh nhân ung thư vú tại hà nội và quảng ninh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỤC PHÁM LUẬN VĂN THẠC sĩ Thư viên TrườngrĩaVhoc Mợ Hà Nôi ÚNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH Tự TỒN Bộ VÙNG GEN MÃ HĨA (WES) NHẦM XÁC ĐỊNH BIẾN ĐÓI GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THU vú TẠI HÀ NỘI VÀ QUẢNG NINH HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ ÁNH HÒNG HÀ NỘI - 2023 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỤC PHẤM LUẬN VẢN THẠC sĩ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH Tự TỒN Bộ VÙNG GEN MÃ HÓA (WES) NHẲM XÁC ĐỊNH ịBIÉNĐÓI GEN LIEN QUAN TRENji BỆNH NHÂN UNG THƯ vủ TẠI HÀ NỘI VÀ QUẢNG NINH HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÀ NGÀNH: 8420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYÊN HUY HOÀNG HÀ NỘI - 2023 Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đày công trinh nghiên cứu cùa cá nhân hướng dẫn khoa học cùa GS.TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các nội dung nghiên cứu đề tài “Úng dụng phương pháp giải trình tự tồn vùng gen mà hóa (WES) nhằm xác định biến đổi gen liên quan bệnh nhân ung thư vú Hà Nội Quảng Ninh” cùa trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu báng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá cá nhân thu thập từ nguồn khác có ghi rõ nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Tác giả Thư viện Trường Đại học M^àhNộihHồng LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tị lịng biết ơn tới Trường Đại Học Mở Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tó lịng biết ơn đến GS.TS Nguyền Huy Hồng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp dần đóng góp nhiều ý kiến q giá, giúp tơi hồn chình luận văn tốt nghiệp Tơi xin căm ơn BGĐ Trung tâm Kiếm soát bệnh tật tinh Quăng Ninh, Khoa Vi sinh - Huyết học, Trung tâm Kiềm soát bệnh tật tính Quãng Ninh tạo điều kiện cho tơi q trình học tập hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mờ Hà Nội, TS Nguyền Thị Kim Liên cán nghiên cửu phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ giá trị mặt chuyên môn số liệu đế tơi hồn thành luận vãn „,',„Jhư hoc Hà NpLx , yMn Cuôi xin bayJAIQPSlMi to long Diet ơn tới giaMơ đinh, bạn bè, đông nghiệp, động viên tinh thần vật chất cho tơi hồn thành việc học tập suốt năm qua Hà Nội, ngày 22 thảng 02 năm 2022 Học Viên Nguyễn Thị Ánh Hồng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII MÓ ĐẦU VIII CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1 Bệnh ung thư vú 1.1 Khái niệm 1.2 Các loại ung thư vú Tinh hình bệnh ung thư vú 2.1 Tinh hình bệnh ung thư Việt Nam 2.2 Tinh hình bệnh ung thư vú giới Thư viện Trương Đại học Mở Hà Nội Các yếu tố nguy bệnh ung thư vú 10 Các gen liên quan đến bệnh ung thư vú 13 4.1 Nhóm gen tiền gen sinh ung thư gen sinh ung thư 13 4.2 Nhóm gen ức chế khối u 14 4.3 Nhóm gcn liên quan đến trinh sứa chữa DNA 14 Giải trình tự gen hệ 14 ứng dụng WES nghiên cứu di truyền ung thư vú 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 17 Vật liệu 17 1.1 Đối tượng 17 1.2 Hóa chất Thiết bị 19 iii Phương pháp nghiên cứu 20 2.1 Thu thập mẫu máu 21 2.2 Tách chiết DNA 21 2.3 Kiểm tra chất lượng DNA tống số bàng điện di 21 2.4 Xác định nồng độ độ tinh DNA tong số 21 2.5 Xây dựng thư viện ĐNA cho giải trinh tự WES 21 2.6 Giãi trình tự tồn vùng mã hóa WES 22 2.7 Phân tích liệu đọc trình tự lọc đột biến gen biết liên quan đến ung thư vú 22 2.8 Sàng lọc biến liên quan đến bệnh ung thư vú .22 2.9 Kiếm chứng lại đột biến bệnh nhân 23 CHƯƠNG KẾT QUÁ 23 Két quà któmlMyèe hĩ W M.hsc Mờ Hà Nội 23 Kết quà tách chiết DNA tổng số 24 Kết nồng độ độ tinh cùa DNA tổng số 25 Ket tạo thư viện 26 Giãi trình tự tồn vùng gen mã hóa bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú 28 Phân tích vùng gcn mã hóa bệnh nhân mắc bệnh ung thư vú 30 Xác định mối liên quan biến tình trạng bệnh bệnh nhân .41 Kiềm chứng lại biến thể giải trinh tự Sanger 43 Kct luận kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẮT Viết tắt DC1S Tiếng Anh Ductal carcinoma in situ Tiếng Việt Ung thư biểu mô ống chồ Hà Nội HN IDC Invasive ductal carcinoma Ưng thư biểu mô ống xâm lấn IBC Inflammatory breast cancer Ung thư vú viêm NGS Next generation sequencing Giải trình tự hệ Quàng Ninh QN SBS Sequencing by synthesis Giãi trình tự bang tống hợp TNBC Triple negative breast cancer Ung thư vú ba âm tính WES Whole exome sequencing Giải trình tự tồn vùng gen mã hóa WGS Whole genome sequencing Giái trình tự tồn hệ gcn DANH MỤC BẢNG Bàng 1: Nồng độ độ tinh DNA tồng số bệnh nhân ung thư vú QN 25 Bảng 2: Nồng độ độ tinh DNA tống số cúa bệnh nhân ung thư vú HN 25 Bàng 3: Kích thước nồng độ thư viện WES ỌN 26 Bảng 4: Kích thước nồng độ thư viện WES HN 27 Bảng 5: Thơng tin đọc trinh tự tồn vùng mã hóa mẫu bệnh nhân ung thư vú Quãng Ninh 30 Bàng 6: Thông tin đọc trình tự tồn vùng mã hóa mẫu bệnh nhân ung thư vú Hà Nội 30 Bàng 7: Kết quà phân tích dự đốn biến thề tồn vùng mà hóa bệnh nhân UTV cùa Quàng Ninh 32 Băng 8: Kct q phân tích dự đốn biến thồ tồn vùng mã hóa bệnh nhân UTV HpỊ^viện ■'Prơờng Đại •Ị1ỌC"MỞ'ỉỉà"NỘÌ 32 Bàng 9: Tần suất bắt gặp biến gen bệnh nhân QN 35 Bàng 10: Tần suất bắt gặp biển thê gen bệnh nhân HN 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình Hình ánh minh họa cho ung thư biểu mô ống chỗ DCIS Hình Quy trình phân tích sàng lọc đột biến 20 Hình Mầu máu cùa bệnh nhân nghiên cứu 23 Hình Kết điện di mầu DNA tổng số cùa bệnh nhân Quảng Ninh 24 Hỉnh Kết điện di mầu DNA tồng số bệnh nhân Hà Nội 25 Hình Hình ảnh minh họa file fastq 28 Hình Hình ánh đại diện chất lượng giái trinh tự mầu bệnh nhân ung thư vú.29 Hình Ket đánh giá biến the bang phần mềm MaxEntScan 42 Hình Kết điện di sàn phấm PCR khuếch đại đoạn gen 44 Hỉnh 10 Ket quà giải trinh tự Sanger 44 Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội vii Het rs 199579239 c.4893G>C p.Gln 1631 His Het rs 142485241 C.8116T>C p.Phe2706Leu Het rs80067406 C.66I9+1OA ĨS482308 Het High C.66I1OA p.Ser2204Asn Het rs77017835 C.5904OG p.Phel968Leu Hom rs542137 C.5767 5768insG rương Di học M( í Hà Nộ 0.007 TEX15 ZAN 0.986 G:0.000000 0.998 C:0.000120 0.998 A:0.005917 0.950 Hom p.Phcl923fs rs 148800656 High c.5020G>T p.Glyl674Cys Het rs 10953303 c.5113G>C p.Aspl705His Het rs61428154 C.13240OG p.Leu4414Val Het rs77865984 c,1933_1934delT p.Leu645fs T Novel 1.000 UB7 AHNAK2 AHNAK ANKLE1 84 0.011 0.998 G:0.000857 0.149 0.996 C:0.001745 Het C.797OG p.Ala266Gly Het rs3735386 c.949G>C p.Asp317His Hom rs3 750898 c,1278+ldelG Novel Het High C.889G>A p.Va!297Ile Het «2305948 AOAH DCLRE1A 0.000 0.997 0.007 0.993 0.059 0.998 FANCD2 KDR c.-35_21dupCGGCGG NOTCH2 CGGCGGCGG Novel HomThtr viện Trường Di i học M( í Hà Nộ c.289G>C p.Gly97Arg Het rs 199713478 PCDHA8 0.118 0.915 0.222 0.998 0.061 0.972 C.18881917delA TAGTTCAGCG p.lle630_Gly63 TGGTTTGGTG 9del CAACCTGGT QRICH2 Novel Het C.2413T>G p.Lcu805Val Het Novel c.3106G>C p.GIul036Gln Het «2279052 85 c.474_509delTG GTCAGTCTGA GAAACAAGAC RPTN AGAGATTCCC ACCA p.Glyl59_Hisl 70del Novel Het O.1500_1517dup GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het p.Glu501_Gln5 06dup Novel C.512OT p.Prol71Lcu Het «34812912 C.6611G>A p.Scr2204Asn Het Thư viện TWẳĐẹ 0.181 TXNDC2 c.5767_5768insG Het 0.959 T:0.077674 0.998 A:0.005917 i học M( Hà Nộ p.Phel923fs «148800656 High C.5904OG p.Phel968Leu Het «542137 0.950 ZAN C.5649G>A Het p.Trpl883* A:0.007111 «2293766 High c.5224T>C p.Cysl742Arg Het «17147735 1.000 ƯB8 86 C:0.000606 0.1912_1913insT ANKLEI T p.Cys638fs Novel High Het C.2521G>A p.Glu841Lys Het «200824984 C.194OG p.Ser65Trp Het «3735400 C.1114A>C p.Asn372His Hom rs 144848 c.809T>C p.Val270Ala Het «2230641 0.015 1.000 0.000 0.998 ANLN Gây bệnh BRCA2 0.010 CCNH c.949G>C DCLRE1A Het 0.965 p.Asp317His Thư viện Trường Đi iP-hổc M( «3750898 C.11255A>C p.Asp3752Ala Het Novel C.9017OT p.Thr3006Mct Het «537395849 C-1278+ldelG Novel Het High c.2668T>C p.Ser890Pro Het «41266132 c.ldelA p.Metlfs Hom «34061715 0.023 1.000 0.026 1.000 0.003 0.997 DNAHI1 FANCD2 HRNR 87 G:0.000581 High MAP3K1 C.2416G>A p.Asp806Asn Het ĨS702689 c.2845_2847delA CA Hom QR1CH2 p.Gly97Arg Het rs 199713478 Hom C.3106OC RPTN AGAGATTCCC ACCA GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het TXNDC2 i học M( í Hà Nộ p.Glyl59_Hisl 70del Novel p.Glu501_Gln5 06dup Novel c.953_997dclCA p.Pro318_Ser3 GAAGAAGCCA 32del TCCAGCCCAA GGAGGGTGAC 0.972 p.GlulO36Gln Het c.l500_1517dup 0.061 p.His581del c.474_509delTG GAAACAAGAC 0.915 Novel HomThtr viện GTCAGTCTGA 0.118 rs 10552703 C.289OC CA 0.999 p.Thr949del PCDHA8 c,1743_1745delT 0.195 Novel 88 ATCCCCAAGT ccc Het C.576G>A p.Trpl92* Het Novel High C.6611OA p.Ser2204Asn Het rs77017835 C.5904OG p.Phel968Leu Het rs542137 c.5224T>C p.Cysl742Arg Het rsl 7147735 ZNF343 0.998 A:0.005917 0.950 ZAN 1.000 C:0.000606 (JB9 111U V1C11 1 llUliU Uc 11ỤV iVll > Lia 1NỤ C.268OT p.Arg90* AHNAK2 Het Novel High c.4817A>C p.Lys!606Thr Het rs77454674 c.5075T>G p.Va!1692Gly Het rs201030252 C.7159OT p.Pro2387Ser Het «72702027 C.50800T p.Leul694Phe Het rs202046475 C.100070T p.Pro3336Leu 89 0.334 0.999 G:0.000372 0.001 0.985 C:0.000365 0.029 0.833 0.543 0.997 0.014 0.999 Het rs 10438247 C.16189OG p.Pro5397Ala Het rs3742935 C.4997A>G p.Lys!666Arg Het rsl 15036524 C.8822G>A p.Gly2941Glu Het rs562908073 0.413 0.975 C:0.000349 0.088 AHNAK c,1933_1934delT ANKLE! T Het 0.043 0.999 0.059 1.000 p.Leu645fs Novel High C.1442OA p.Gly481 Asp Het rs200062099 BRIPl _ Thir viện Trường Dẹ i học M( c.949G>C p.Asp317His DCLREIA Het rs3750898 C.15O2G>A p.Gly50l Asp Het rs536599IO9 0.1278+ldelG Novel Het High FANCC la Nọ 0.007 0.993 0.027 0.999 0.006 0.819 FANCD2 c.6798_6799insC p.Gly2267fs TGTGGCCAAC AT HRNR Het Novel High c.6802T>G p.Ser2268Ala Het rsl2145371 90 C.6922G>T p.Gly2308Cys Het FS12126691 C.24I6G>A p.Asp806Asn Het rs702689 c.289G>C p.Gly97Arg Het rs 199713478 MAP3K1 PCDHA8 0.008 0.999 0.195 0.999 0.118 0.915 c.474_509delTG GTCAGTCTGA GAAACAAGAC RPTN AGAGATTCCC ACCA p.Glyl59_Hisl 70del Novel Het C.142C>G TAS2R30 Het c,1500_1517dup GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het ZAN p.Lcu48Val Thư viện Trương Di PhụcM( rs 113026132 0.848 p.Glu501_Gln5 06dup Novel c.8116T>C p.Phe2706Leu Het I-S80067406 c.6388_6391dup p.Ala2131fs GCGG rsl41127397 Het High C.5708OA p.Cysl903Tyr Het rs 12673041 91 0.998 C:0.000120 1.000 A:0.037787 UB10 C.11327OG p.Pro3776Arg Het Novel C.3553T>A p.Serll85Thr Het «200159018 C.4022OT p.Serl 341 Pile Het «2396457 C.7159OT p.Pro2387Ser Het «72702027 C.100070T p.Pro3336Leu Het «10438247 C.114jị^acviện p.Lys3802Arg Het «553656839 C.809TX p.Va!270Ala Het «2230641 C.337OG p.Lcull3Val Hom «13147559 c.949G>C p.Asp317His Hom «3750898 c,1278+ldelG Novel Het High C.6530OT p.Ser2177Phe Het Novel 0.000 0.996 0.231 0.891 0.014 1.000 0.029 0.833 0.014 0.999 A:0.002747 AHNAK2 CCNH CLRN2 DCLRE1A i hoc M( f Ha 0.028 0.921 0.010 0.965 0.089 0.896 0.007 0.993 0.001 1.000 FANCD2 HRNR 92 NỘ C.1292OT p.Ser431Phe Het rs72477389 c.2701G>A p.Gly901 Arg Het rs 142336181 c.l 10G>A p.Arg37His I lorn I-S13817 MLÌS81 0.003 1.000 0.148 0.997 0.170 0.999 A:0.000000 c.-21_- 20insCGGAGGA N0TCH2 Novel GG Het C.1888_1917delA TAGTTCAGCG p.Ile630_Gly63 TGGTTTGGTG 9dcl CAACCTGGT Trường Di i học M( i Hà Nộ QRICH2 Novel Het c.31O6G>C p.GlulO36Gln Het rs2279052 C.142OG p.Leu48Val Het rs 113026132 C.4813OT p.Arg!605Cys Het Novel C.6611OA p.Ser2204Asn Hom rs77017835 C.5904OG p.Phcl968Leu TAS2R30 TCHH 0.061 0.972 0.043 0.848 0.001 1.000 0.998 ZAN 93 0.950 A:0.005917 Hom rs542137 Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội 94 Phụ lục 3: Thông tin bệnh nhân Ký hiệu UB1 UB2 UB3 UB4 Họ tên Trương T.N.T Hoàng T.N Nguyễn T.T.T Năm sinh chẩn doán Cho Loại ung bú thư khác 1976 44 Có 1974 39 Có UB6 T.H Nguyễn bị ung thư vú Mẹ đẻ, chị gái ruột buồng Không Người nhà bị ung thư buồng ER PR Her2 KĨ67 (%) trứng Khơng + Mẹ đè, dì + + 10 - - - 70 Thư 'ÌệlíứỈẩlừ Tig Đại h( )C ưồH ì Nội 1983 37 Có Khơng Khơng Khơng - - - 1982 38 Có Khơng Chị gái họ Khơng + + 2+ 1966 53 Có Khơng Khơng Khơng + + - 1968 50 Có Khơng Không Không - - 2+ Trần UB5 Không Người nhà Ung thư Trần M.H Tuổi 96 20 Ký hiệu Họ tên Năm sinh Tuổi chấn đoán Cho Loại ung bú thư khác Ngưòi nhà bị ung thư Ngưòi nhà bị ung thư vú buồng ER PR Hcr2 KĨ67 (%) trúng T.L UB7 UB8 UB9 UB10 ỌN1 QN2 Trần T.L Bùi T.H Nguyền T.n.T Nguyền T.T Trương T.c Bạc T.D 1972 2000 44 Có Khơng Chưa có sinh Khơng Không Không - + - Không Không Không NA NA NA NA liu ' 'iệii Tiuì 1959 1968 1972 1966 62 Khơng có Khơng có Khơng có Iig Đại lí )C Mơ H i Nội Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA NA Có Khơng Khơng Khơng - - + 40 Có Khơng Cơ ruột Khơng + + + 40 Có Khơng Khơng Khơng 4- 4- 4- 97 Ký hiệu QN3 QN4 QN5 QN6 ỌN7 QN8 Họ tên Nguyễn T.N Nguyễn T.H.H Chu T.H Đinh T.T Trần T.H Phạm T.H Dương tính: Năm sinh 1967 1981 1981 Tuổi chấn đốn Khơng có 1968 1958 Âm tính: Loại ung bú thư khác Có Chưa 37 sinh Ngưịi nhà bị ung thư vú Ngưòi nhà bị ung thư buồng ER PR có Khơng cỏ Khơng có KĨ67 (%) Không Chị họ Không - - 2+ 70 Không Không Cô ruột - - - 40% - 2+ h< )cWh Ọ ■fflll' có Hcr2 trúng Khơng Khơng 1949 Cho Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA Có Khơng Khơng Khơng 80% 80% 2+ Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA Khơng có thơng tin: “NA” 98 NA NA Thư viện Trường Đại học Mở Hà Nội 99