Ứng dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa wes nhằm xác định biến đổi gen liên quan trên bệnh nhân ung thư vú tại hà nội và quảng ninh

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ VÙNG GEN MÃ HÓA (WES) NHẰM XÁC ĐỊNH BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ TẠI HÀ NỘI VÀ QUẢNG NINH HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG HÀ NỘI – 2023 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ VÙNG GEN MÃ HĨA (WES) NHẰM XÁC ĐỊNH BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ TẠI HÀ NỘI VÀ QUẢNG NINH HỌC VIÊN: NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS NGUYỄN HUY HOÀNG HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu cá nhân đƣợc hƣớng dẫn khoa học GS.TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các nội dung nghiên cứu đề tài “Ứng dụng phƣơng pháp giải trình tự tồn vùng gen mã hóa (WES) nhằm xác định biến đổi gen liên quan bệnh nhân ung thƣ vú Hà Nội Quảng Ninh” trung thực chƣa cơng bố dƣới hình thức trƣớc Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc cá nhân thu thập từ nguồn khác có ghi rõ nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Tác giả Nguyễn Thị Ánh Hồng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Trƣờng Đại Học Mở Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến GS.TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp dẫn đóng góp nhiều ý kiến q giá, giúp tơi hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn BGĐ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Quảng Ninh, Khoa Vi sinh - Huyết học, Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Quảng Ninh tạo điều kiện cho q trình học tập hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Mở Hà Nội, TS Nguyễn Thị Kim Liên cán nghiên cứu phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ giá trị mặt chuyên môn số liệu để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, động viên tinh thần nhƣ vật chất cho tơi hồn thành việc học tập suốt năm qua Hà Nội, ngày 22 tháng 02 năm 2022 Học Viên Nguyễn Thị Ánh Hồng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII MỞ ĐẦU VIII CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Bệnh ung thƣ vú 1.1 Khái niệm 1.2 Các loại ung thƣ vú 2 Tình hình bệnh ung thƣ vú 2.1 Tình hình bệnh ung thƣ Việt Nam 2.2 Tình hình bệnh ung thƣ vú giới Các yếu tố nguy bệnh ung thƣ vú 10 Các gen liên quan đến bệnh ung thƣ vú 13 4.1 Nhóm gen tiền gen sinh ung thƣ gen sinh ung thƣ 13 4.2 Nhóm gen ức chế khối u 14 4.3 Nhóm gen liên quan đến trình sửa chữa DNA 14 Giải trình tự gen hệ 14 Ứng dụng WES nghiên cứu di truyền ung thƣ vú .16 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 Vật liệu 17 1.1 Đối tƣợng 17 1.2 Hóa chất Thiết bị 19 iii Phƣơng pháp nghiên cứu .20 2.1 Thu thập mẫu máu 21 2.2 Tách chiết DNA 21 2.3 Kiểm tra chất lƣợng DNA tổng số điện di 21 2.4 Xác định nồng độ độ tinh DNA tổng số 21 2.5 Xây dựng thƣ viện DNA cho giải trình tự WES 21 2.6 Giải trình tự tồn vùng mã hóa WES 22 2.7 Phân tích liệu đọc trình tự lọc đột biến gen biết liên quan đến ung thƣ vú 22 2.8 Sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh ung thƣ vú 22 2.9 Kiểm chứng lại đột biến bệnh nhân 23 CHƢƠNG KẾT QUẢ 23 Kết khám sàng lọc hồ sơ bệnh nhân 23 Kết tách chiết DNA tổng số 24 Kết nồng độ độ tinh DNA tổng số 25 Kết tạo thƣ viện 26 Giải trình tự tồn vùng gen mã hóa bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ vú 28 Phân tích vùng gen mã hóa bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ vú .30 Xác định mối liên quan biến đổi với tình trạng bệnh bệnh nhân……………………… 41 Kiểm chứng lại biến thể giải trình tự Sanger .43 Kết luận kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO .46 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt DCIS Tiếng Anh Tiếng Việt Ung thƣ biểu mô ống chỗ Ductal carcinoma in situ Hà Nội HN IDC Invasive ductal carcinoma Ung thƣ biểu mô ống xâm lấn IBC Inflammatory breast cancer Ung thƣ vú viêm NGS Next generation sequencing Giải trình tự hệ Quảng Ninh QN Giải trình tự tổng hợp SBS Sequencing by synthesis TNBC Triple negative breast cancer Ung thƣ vú ba âm tính WES Whole exome sequencing Giải trình tự tồn vùng gen mã hóa WGS Giải trình tự tồn hệ gen Whole genome sequencing v DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Nồng độ độ tinh DNA tổng số bệnh nhân ung thƣ vú QN 25 Bảng 2: Nồng độ độ tinh DNA tổng số bệnh nhân ung thƣ vú HN 25 Bảng 3: Kích thƣớc nồng độ thƣ viện WES QN 26 Bảng 4: Kích thƣớc nồng độ thƣ viện WES HN 27 Bảng 5: Thơng tin đọc trình tự tồn vùng mã hóa mẫu bệnh nhân ung thƣ vú Quảng Ninh 30 Bảng 6: Thơng tin đọc trình tự tồn vùng mã hóa mẫu bệnh nhân ung thƣ vú Hà Nội 30 Bảng 7: Kết phân tích dự đốn biến thể tồn vùng mã hóa bệnh nhân UTV Quảng Ninh .32 Bảng 8: Kết phân tích dự đốn biến thể tồn vùng mã hóa bệnh nhân UTV Hà Nội 32 Bảng 9: Tần suất bắt gặp biến thể gen bệnh nhân QN .35 Bảng 10: Tần suất bắt gặp biến thể gen bệnh nhân HN .37 vi DANH MỤC HÌNH Hình Hình ảnh minh họa cho ung thƣ biểu mơ ống chỗ DCIS Hình Quy trình phân tích sàng lọc đột biến .20 Hình Mẫu máu bệnh nhân nghiên cứu 23 Hình Kết điện di mẫu DNA tổng số bệnh nhân Quảng Ninh 24 Hình Kết điện di mẫu DNA tổng số bệnh nhân Hà Nội 25 Hình Hình ảnh minh họa file fastq 28 Hình Hình ảnh đại diện chất lƣợng giải trình tự mẫu bệnh nhân ung thƣ vú 29 Hình Kết đánh giá biến thể phần mềm MaxEntScan 42 Hình Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 44 Hình 10 Kết giải trình tự Sanger .44 vii Het rs199579239 c.4893G>C p.Gln1631His Het rs142485241 c.8116T>C p.Phe2706Leu TEX15 0.007 ZAN Het rs80067406 c.6619+1G>A rs482308 Het High c.6611G>A p.Ser2204Asn Het rs77017835 c.5904C>G p.Phe1968Leu Hom rs542137 0.986 G:0.000000 0.998 C:0.000120 0.998 A:0.005917 0.950 c.5767_5768insG Hom p.Phe1923fs rs148800656 High c.5020G>T p.Gly1674Cys Het rs10953303 c.5113G>C p.Asp1705His Het rs61428154 c.13240C>G p.Leu4414Val Het rs77865984 c.1933_1934delT p.Leu645fs T Novel 1.000 UB7 AHNAK2 AHNAK ANKLE1 84 0.011 0.998 G:0.000857 0.149 0.996 C:0.001745 Het c.797C>G p.Ala266Gly Het rs3735386 c.949G>C p.Asp317His AOAH DCLRE1A Hom rs3750898 c.1278+1delG Novel Het High c.889G>A p.Val297Ile Het rs2305948 0.000 0.997 0.007 0.993 0.059 0.998 0.118 0.915 0.222 0.998 0.061 0.972 FANCD2 KDR c.-35_21dupCGGCGG NOTCH2 CGGCGGCGG Novel Hom c.289G>C p.Gly97Arg PCDHA8 Het rs199713478 c.1888_1917delA TAGTTCAGCG p.Ile630_Gly63 TGGTTTGGTG 9del CAACCTGGT QRICH2 Novel Het c.2413T>G p.Leu805Val Het Novel c.3106G>C p.Glu1036Gln Het rs2279052 85 c.474_509delTG GTCAGTCTGA GAAACAAGAC RPTN AGAGATTCCC ACCA p.Gly159_His1 70del Novel Het c.1500_1517dup GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het p.Glu501_Gln5 06dup Novel c.512C>T p.Pro171Leu Het rs34812912 c.6611G>A p.Ser2204Asn Het rs77017835 TXNDC2 0.181 c.5767_5768insG Het 0.959 T:0.077674 0.998 A:0.005917 p.Phe1923fs rs148800656 High c.5904C>G p.Phe1968Leu Het rs542137 ZAN 0.950 c.5649G>A Het p.Trp1883* A:0.007111 rs2293766 High c.5224T>C p.Cys1742Arg Het rs17147735 1.000 UB8 86 C:0.000606 c.1912_1913insT ANKLE1 T Het p.Cys638fs Novel High c.2521G>A p.Glu841Lys Het rs200824984 c.194C>G p.Ser65Trp Het rs3735400 c.1114A>C p.Asn372His Hom rs144848 c.809T>C p.Val270Ala Het rs2230641 c.949G>C p.Asp317His Het rs3750898 c.11255A>C p.Asp3752Ala 0.015 1.000 0.000 0.998 ANLN Gây bệnh BRCA2 CCNH DCLRE1A Het Novel c.9017C>T p.Thr3006Met Het rs537395849 c.1278+1delG Novel Het High c.2668T>C p.Ser890Pro Het rs41266132 c.1delA p.Met1fs Hom rs34061715 0.010 0.965 0.007 0.993 0.023 1.000 0.026 1.000 0.003 0.997 DNAH11 FANCD2 HRNR 87 G:0.000581 High MAP3K1 c.2416G>A p.Asp806Asn Het rs702689 c.2845_2847delA CA Hom p.Gly97Arg Het rs199713478 QRICH2 Hom Hom rs2279052 c.474_509delTG RPTN AGAGATTCCC ACCA p.Gly159_His1 70del Novel Het c.1500_1517dup GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het TXNDC2 p.Glu501_Gln5 06dup Novel c.953_997delCA p.Pro318_Ser3 GAAGAAGCCA 32del TCCAGCCCAA GGAGGGTGAC 0.061 0.972 Novel p.Glu1036Gln GAAACAAGAC 0.915 p.His581del c.3106G>C GTCAGTCTGA 0.118 rs10552703 c.289G>C CA 0.999 p.Thr949del PCDHA8 c.1743_1745delT 0.195 Novel 88 ATCCCCAAGT CCC Het c.576G>A p.Trp192* Het Novel High c.6611G>A p.Ser2204Asn ZNF343 0.998 Het rs77017835 c.5904C>G p.Phe1968Leu Het rs542137 c.5224T>C p.Cys1742Arg Het rs17147735 c.268C>T p.Arg90* Het Novel High c.4817A>C p.Lys1606Thr Het rs77454674 c.5075T>G p.Val1692Gly Het rs201030252 c.7159C>T p.Pro2387Ser Het rs72702027 c.5080C>T p.Leu1694Phe Het rs202046475 c.10007C>T p.Pro3336Leu ZAN A:0.005917 0.950 1.000 C:0.000606 0.334 0.999 G:0.000372 0.001 0.985 C:0.000365 0.029 0.833 0.543 0.997 0.014 0.999 UB9 AHNAK2 89 Het rs10438247 c.16189C>G p.Pro5397Ala Het rs3742935 c.4997A>G p.Lys1666Arg 0.413 0.975 0.088 Het rs115036524 c.8822G>A p.Gly2941Glu Het rs562908073 C:0.000349 AHNAK c.1933_1934delT ANKLE1 T Het 0.043 0.999 0.059 1.000 0.007 0.993 0.027 0.999 0.006 0.819 p.Leu645fs Novel High c.1442G>A p.Gly481Asp Het rs200062099 c.949G>C p.Asp317His Het rs3750898 c.1502G>A p.Gly501Asp Het rs536599109 c.1278+1delG Novel Het High BRIP1 DCLRE1A FANCC FANCD2 c.6798_6799insC p.Gly2267fs TGTGGCCAAC AT HRNR Het Novel High c.6802T>G p.Ser2268Ala Het rs12145371 90 c.6922G>T p.Gly2308Cys Het rs12126691 c.2416G>A p.Asp806Asn Het rs702689 c.289G>C p.Gly97Arg Het rs199713478 MAP3K1 PCDHA8 0.008 0.999 0.195 0.999 0.118 0.915 0.043 0.848 c.474_509delTG GTCAGTCTGA GAAACAAGAC RPTN AGAGATTCCC ACCA p.Gly159_His1 70del Novel Het c.142C>G p.Leu48Val TAS2R30 Het c.1500_1517dup GGAGAGGCGC TCHH GAGCAGCA Het ZAN rs113026132 p.Glu501_Gln5 06dup Novel c.8116T>C p.Phe2706Leu Het rs80067406 c.6388_6391dup p.Ala2131fs GCGG rs141127397 Het High c.5708G>A p.Cys1903Tyr Het rs12673041 91 0.998 C:0.000120 1.000 A:0.037787 UB10 c.11327C>G p.Pro3776Arg Het Novel c.3553T>A p.Ser1185Thr Het rs200159018 c.4022C>T p.Ser1341Phe Het rs2396457 c.7159C>T p.Pro2387Ser Het rs72702027 c.10007C>T p.Pro3336Leu Het rs10438247 c.11405A>G p.Lys3802Arg 0.000 0.996 0.231 0.891 0.014 1.000 0.029 0.833 0.014 0.999 0.028 0.921 0.010 0.965 0.089 0.896 0.007 0.993 0.001 1.000 AHNAK2 Het rs553656839 c.809T>C p.Val270Ala Het rs2230641 c.337C>G p.Leu113Val Hom rs13147559 c.949G>C p.Asp317His Hom rs3750898 c.1278+1delG Novel Het High c.6530C>T p.Ser2177Phe Het Novel CCNH CLRN2 DCLRE1A FANCD2 HRNR 92 A:0.002747 c.1292C>T p.Ser431Phe Het rs72477389 c.2701G>A p.Gly901Arg Het rs142336181 c.110G>A p.Arg37His Hom rs13817 MUS81 0.003 1.000 0.148 0.997 0.170 0.999 0.061 0.972 0.043 0.848 0.001 1.000 A:0.000000 c.-21_20insCGGAGGA NOTCH2 Novel GG Het c.1888_1917delA TAGTTCAGCG p.Ile630_Gly63 TGGTTTGGTG 9del CAACCTGGT QRICH2 Novel Het c.3106G>C p.Glu1036Gln Het rs2279052 c.142C>G p.Leu48Val TAS2R30 Het rs113026132 c.4813C>T p.Arg1605Cys Het Novel c.6611G>A p.Ser2204Asn Hom rs77017835 c.5904C>G p.Phe1968Leu TCHH 0.998 ZAN 93 0.950 A:0.005917 Hom rs542137 94 Phụ lục 3: Thông tin bệnh nhân Ký hiệu UB1 UB2 UB3 UB4 UB5 UB6 Họ tên Trƣơng T.N.T Hoàng T.N Nguyễn T.T.T Trần M.H Trần T.H Nguyễn Năm sinh 1976 Tuổi chẩn đoán 44 Cho Loại ung bú thƣ khác Có Khơng Ngƣời nhà bị ung thƣ vú Mẹ đẻ, chị gái ruột Ung thƣ 1974 39 Có buồng Khơng trứng Ngƣời nhà bị ung thƣ buồng PR Her2 + + + 10 – – – – 70 (%) trứng Khơng Mẹ đẻ, dì ruột 1983 37 Có Khơng Khơng Khơng – – – 1982 38 Có Khơng Chị gái họ Khơng + + 2+ 1966 53 Có Khơng Khơng Khơng + + – 1968 50 Có Khơng Khơng Khơng – – 2+ 96 Ki67 ER 20 Ký hiệu Họ tên Năm sinh Tuổi chẩn đoán Cho Loại ung bú thƣ khác Ngƣời nhà bị ung thƣ vú Ngƣời nhà bị ung thƣ buồng ER PR Her2 Ki67 (%) trứng T.L UB7 UB8 UB9 UB10 QN1 QN2 Trần T.L Bùi T.H Nguyễn T.H.T Nguyễn T.T Trƣơng T.C Bạc T.D 1972 2000 1959 1968 1972 1966 Không Không Không – + – Không Không Khơng NA NA NA NA Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA NA Có Khơng Khơng Khơng – – + 40 Có Khơng Cơ ruột Khơng + + + 40 Có Khơng Khơng Khơng + + + 44 Có Khơng Chƣa có sinh 62 Khơng có Khơng có Khơng có 97 Ký hiệu QN3 QN4 QN5 QN6 QN7 QN8 Họ tên Nguyễn T.N Nguyễn T.H.H Chu T.H Đinh T.T Trần T.H Phạm T.H Năm sinh 1967 1981 1981 1949 1968 1958 Tuổi chẩn đốn Khơng có 37 Khơng có Khơng có Khơng có Khơng có Cho Loại ung bú thƣ khác Ngƣời nhà bị ung thƣ vú Ngƣời nhà bị ung thƣ buồng ER PR Her2 Ki67 (%) trứng Không Chị họ Không – – 2+ 70 Không Khơng Cơ ruột – – – 40% Có Khơng Khơng Khơng 2+;70% – 2+ Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA Có Khơng Khơng Khơng 80% 80% 2+ Có Khơng Khơng Khơng NA NA NA Có Chƣa sinh Dƣơng tính: “+”; Âm tính: “–”; Khơng có thơng tin: “NA” 98 NA NA 99