VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CỐNG NGHẸ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đê tài Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN SẢN NHI QUẢNG NINH.
VIỆN ĐẠI HỌC MỎ HÀ NỘI KHOA CỐNG NGHẸ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đê tài: Thư viện Viện Đại học Mờ Hà Nội XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN SẢN NHI QUẢNG NINH Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Trung ThS Tạ Thị Thu Họp Sinh viên thực : Nguyễn Thị Ngọc Lóp : 13.01 Hà Nội, 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI MỤC LỤC LỜI MỚ ĐẦU PHÀN TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung nấm Candida sp Y học 1.1.1 Đại cương nấm candidas 1.1.2 Đặc điềm nấm Candida 1.2 Các yếu tố thuận lợi dề nhiễm nấm candida 1.2.1 Yếu tố nội lai 1.2.2 Yeu tố ngoại lai 1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.3.1 Ớ nữ giới .5 1.3.2 Ờ nam giới 1.4 Cơ chế gây bệnh 1.5 Phòng diệu trị bệnh nhiễm nấm Cầndidaỉ.a.?xỉộ.ị 1.5.1 Nguyên tắc điều trị .7 1.5.2 Phịng ngìra bệnh nhiễm nấm Candida 1.6 Phương pháp phát .8 1.6.1 Phương pháp soi tươi 1.6.2 Phương pháp nuôi cấy 1.6.3 Phương pháp PCR PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 10 2.1 Địa điểm thực 10 2.2 Đối tương nghiên cứu 10 2.2.1 Đối tượng 10 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 10 2.2.3 Tiêu chuấn loại trừ .10 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 10 Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 2.3.1 Vật liệu 10 2.3.2 Trình tự mồi 11 2.3.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 11 2.3.3.1 Hóa chất .11 2.3.3.2 Các dụng cụ nghiên cứu .12 2.3.3.3 Các thiết bị nghiên cứu 12 2.3.4 2.4 Các loại môi trường sử dụng .12 Phương pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp 12 2.4.1.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp 12 2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu bàn Gram .13 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy 15 2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA hệ gen nấm 16 2.4.3.1 2.4.3.2 Tách chiết DNA hệ gen nanj., x.r 16 "Thu yien y ien t)ạị nọc Mở Hạ NỘI Làm DNA hệ gen nâm sau tách chiềt 17 2.4.4 Phương pháp khếch đại gen cặp mồi đặc hiệu 18 2.4.5 Phương pháp cắt DNA enzyme cắt hạn chế 19 2.4.6 Phương pháp điện di DNA gel agarose 20 PHẦN III KÉT QUẢ VÀ THÁO LUẬN 22 3.1 Kết thu thập mầu 22 3.2 Danh sách mẫu thu thập 23 3.3 Đặc điếm hình thái nấm Candida quan sát xét nghiệm.25 3.1.1 Đặc điếm hình thái nấm nam Candida quan sát nhuộm soi 25 3.3.2 3.4 Đặc điếm hình thái nấm Candida trình ni cấy 27 Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida mẫu nghiên cứu phương pháp soi trực tiếp 28 Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI 3.4.1 Các loại vi sinh vật phát 28 3.4.2 Tì lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp 29 3.5 Một số đặc điếm sinh hóa Candida 30 3.6 Xác định loài nấm Candida phương pháp PCR 30 3.4.1 Đặc điếm mẫu định loài phương pháp PCR 30 3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen mẫu xác định Candida 32 3.4.3 Kết quà khuếch đại DNA cặp mồi ITS1-ITS4 .34 PHÀN IV KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Kết luận 39 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHÁO 40 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh nấm Candida Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram 14 Hình 3.1: Phịng thí nghiệm xét nghiệm mẫu 22 Hình 3.2 Dụng cụ lấy mầu 23 Hình 3.3: Một số hình ánh mẫu bệnh phẩm nhuộm soi kính hiến vi 26 Hình 3.4: Mầu bệnh phấm nam ni cấy môi trường sabouraud .27 Hình 3.5: Mầu bệnh phẩm nấm ni cấy môi trường sabouraud thạch nghiêng 28 Hình 3.6 DNA hệ gen tách chiết lừ 22 mầu nấm kiểm tra điện di gel agarose 0,8% 33 Hình 3.7 Kết qua khuếch đại bMÁ bằn^ằp mơi 1ST - ITS4 kiểm tra bàng điện di gel agarose 0,8% 35 Hình 3.8 Sàn phẩm phàn ứng PCR cắt enzyme Msp I kiếm tra bang điện di gel agarose 1,7% 37 Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 18 Báng 2.2 Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR 19 Bàng 2.3 Thành phần phan ứng cat DNA bang enzyme Msp 20 Bàng 3.1 Danh sách mầu bệnh phấm 40 bệnh nhân chọn đề tiến hành xét nghiệm 23 Báng 3.2 Đặc điềm sinh hóa số lồi Candida 30 Báng 3.3 Đặc điểm cùa mẫu trước xét nghiệm PCR 30 Báng 3.4 Kích thước cùa sản phẩm PCR, sàn phẩm cắt Msp cuar loài Candida tương ứng .36 Báng 3.5 Kích thước, cúạ sạn phẩm PCR.JTS1-ITS4 trước sau cắt băng Msp 37 Báng 3.6 Sự đa dạng loài nấm so mầu kháo sát 38 Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỚ HÀ NỘI LỜI MỞ ĐẦU Nhiễm nấm bệnh phố biến thẻ giới Nấm tồn khắp nơi: môi trường đất, nước.không khí,ở thực vật,động vật thẻ người Khi gặp điều kiện thuận lợi nóng ầm ,sức đề kháng suy giảm nấm phát triến gây bệnh Bệnh nấm gây gặp nhiều nước nhiệt đới ôn đới [29] Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa có nhiệt độ độ ấm cao điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triến dề dàng gây nhiễm nấm người Bên cạnh đó, xu hướng ngày gia tăng bệnh nhiễm khuấn đường sinh sàn (Reproductive tract infection- RTI) bệnh lây truyền qua đường tình dục (Secxually transmitted infection - STI), đặc biệt trước bùng nổ đại dịch HIV/AIDS Vì vậy, tỳ lệ bệnh nhiễm nấm hội ngày gia tăng [3], Trong đó, viêm âm đạo nấm van đề quan trọng chăm sóc sức khóe sinh sản Bệnh gặp lứa tuối thơng thường phụ nữ thời kỳ sinh đẻ có tỷ lệ mắc bệnh cao cộng đồng [58] Klein Catherine (2012) thấy khoảng 70-75% phụ nữ nhiễm nấm âm đạo lần đời nửa số hộ bị tái phát hàng năm [53 ] Biếu lâm sang nhiễm nấm vùng niêm mạc âm hộ, âm đạo thường không đặc hiệu như: Ngứa,đau rát, viêm trợt niêm mạc, tiết dịch, chảy máu Bệnh ánh hướng nhiêu đen chất lượng sống cùa người bệnh Neu bệnh không điều trị kịp thời có the diễn biến dai dẳng, tiến triến nặng nề gây nhiều biến chúng ânh hưởng đến quan phủ tạng chí gây vơ sinh tử vong [10] Nguyên nhân điều trị thất bại liên quan đến yếu to thể vật chủ sử dụng thuốc vi nấm gây bệnh Trong yêu tố liên quan đen vật chủ thường có vai trò quan trọng đưa đến tượng kháng thuốc |27| Những năm gần đây,cùng với việc ứng Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp dụng thành tựu cùa y học,việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng nấm vấn đề đáng lo ngại Trên thực tế lâm sàng có nhiều trường hợp không đáp ứng với kháng sinh kháng nam [1], [2], [3] Nhiều nghiên cứu khác chi rang nhiễm nấm Candida âm đạo dai dang ,tái phát chúng sinh kiều gen kháng thuốc thơng qua biến đối hình thái tính chất mơi trường có thuốc kháng nấm [36], Thực trang cho thấy, thiếu điều kiện xét nghiệm có thề gặp khó khăn việc tìm ngun nhân để chuẩn đoán điều trị bệnh cách hiếu [27], Hiện có nhiều phương phát, nhiều kỹ thuật đế phát nấm tác nhân gây bệnh đường sinh dục Tùy thuộc điều kiện sở vật chất, trang thiết bị có mà phịng xét nghiệm triển khai kỹ thuật đơn giãn hay đại Xuất phát từ sờ khoa học thực tiền, đề xuất đề tài: Xác định tỷ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida cùa bệnh nhân đến khám Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (tử 10/2016 đến 02/2017) Mục tiêu đề tài: Xác định tỷ lệ số yếu tố liên quan đến nấm Candida gây bệnh đường sinh dục bệnh nhân đến khám bệnh viện Khảo sát chúng nấm Candida gây bệnh đường sinh dục Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp PHẢN TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung nấm Candida sp Y học 1.1.1 Đại cương nấm candidas Bệnh Candida sp viết y văn từ thời Hypocrate Galen tên gọi khác như: Monila Candida Năm 1792, Frank mô tả lâm sàng bệnh Năm 1894, Wilkinson xác định triệu chứng lâm sàng bệnh liên quan tới nguyên nấm Đốn 1923 Berkhout mô tà chi tiết nấm tên thống Candida [28] c albicans loại nấm men sinh sản bàng đơn bào chồi Bên cạnh có sợi nam giả gồm tế bào dài dính vào bời điếm nhỏ dễ gầy Năm 1952, người ta phát có khoảng 30 lồi Candidas liên quan đến y học số 300 giống tìm thấy Ngày có khoảng 35 lồi liên quan đến y học xác định Trong lồi c albicans có độc tính cao hay gây bệnh người Ngồi cịn có c tropìcalis, c pseudotropỉcalis, c parakrusei, c krusei, c guillermondi mà lâm sàng hay gặp Những loài candida thường tạp sinh Nhưng điều kiện thuận lợi gây bệnh (gây bệnh hội) Vị trí cùa canbicans phân loại dạng nam men Theo Lodder có loại nam men là: Men có nang đàm: sinh sàn bang nang đàm (ascus) điền hình nấm men saccharomyces Men khơng có nang đàm: hợp thành họ lớn cryptococcacaae Và nấm candida loài thuốc họ cryptococcacea Tất cá bệnh nấm candida gây gọi bệnh candidose (ngày xưa gọi bệnh levures, 1.1.2 Đặc điếm nấm Candida Candida nấm men tồn phơ biến thiên nhiên, kí sinh yếu người súc vật Ngày nay, nấm Candida Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp nguyên gây bệnh thường gặp (Hình 1.1) Hình 1.1 Hình ảnh nấm Candida - Candida thuộc chi nấm men, họ Cryptococcaceae - Tồn trạng thái đơn bào có nhân chuấn - Hình dạng: Là nấm khơng màu, vách ngăn rộng, hình trịn hình bầu dục, đơi có dạng sợi vơ định hình - Kích thước dao động từ 3-10 pm , thông thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn - Sinh sàn vơ tính theo phương thức chồi Khi bào từ chồi dược sinh theo dạng tuyến tính khơng phân cắt hình thành nên cấu trúc gọi giả sợi nấm - Khà thích nghi với mơi trường cao - Tồn thiên nhiên, môi trường chứa đường hoa quả, rau dưa, mật mía 1.2 1.2.1 Các yếu tố thuận lọi dễ nhiễm nấm candida Yếu tố nội lai Bệnh nhiễm trùng cấp tính hay mãn tính; Bệnh chuyến hố: tiếu Nguyễn Thị Ngọc - CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.3: Một số hình ảnh mẫu bệnh phẩm nhuộm soi dưói kính hiển vi Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 26 Khóa luận tốt nghiệp 3.3.2 Đặc điếm hình thái nấm Candida q trình ni cấy Trong ống nghiệm có chứa sẵn 0,5-1 ml huyết thị, hồ tan khuân lạc nấm bệnh phẩm vào huyết thanh, ũ 37°c Lấy giọt huyết nhở lên lam kính quan sát kính hiến vi - Nếu thấy có ống mầm: Candida albicans - Neu khơng có ống mầm: Các loại Candida khác Hình 3.4: Mẩu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sahouraud Sau soi kính, xác định mẫu chứa Candida mầu chuyến sang ni cấy ống thạch nghiêng thu sinh khối đê tiến hành thí nghiệm tách chiết DNA hệ gen xác định loài bàng phương pháp PCR kết hợp cắt bang enzyme cat hạn chế Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 27 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.5: Mẩu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sabouraud thạch nghiêng Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida mẫu nghiên cứu 3.4 phưoug pháp soi trực tiếp ỉ Các loại vi sinh vật phát 3.4 Bằng phương pháp soi trực tiếp mầu bệnh phẩm, nhiều loại vi sinh vật chấn đoán tồn mẫu Các vi sinh vật phát mẫu bệnh phấm mà thực gồm: - Candida; - Lactobacili; - Garderella vaginalis; - Coliforms; - Staphylococcus (S aureus, s epidermidis, s saprophycoccus); - Streptococcus (.S' viridans, B ); - Enterococcus; - Mycoplasma hominis; - Trùng roi đường sinh dục; - Te bào Glue; - Vi khuấn Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 28 Khóa luận tốt nghiệp 4.2 Tỉ lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác dinh qua soi trực tiếp Theo thống kê số liệu khảo sát bệnh viện Sàn nhi Quãng Ninh vào tháng 2/2017 sau: Tổng so bệnh nhân đen thăm khám viện 765 ca; Tống số ca làm xét nghiệm dịch âm đạo tìm nấm 104 ca; số ca phát nhiễm nấm sinh dục phương pháp soi trực tếp 40 ca Như tỉ lệ so ca nghi ngờ nhiễm nấm chi định soi tìm nấm 13,6 % Trong số phát 40 trường hợp nhiễm nam sinh dục, chiếm 38,5%, lại nhiễm tác nhân khác Như tính tống số ca đến thăm khám ti lệ nhiễm nấm sinh dục phát phương pháp soi trực tiếp chi 5,2% Ớ Việt Nam có nhiều nghiên cứu cơng bố liên quan đến nhiễm nấm đường sinh dục Nguyễn Thị Đào công bố ti lệ nhiễm Candida sinh dục phụ nữ khỏe mạnh 25-30%, cịn phụ nữ có thai 40-50% [13] Năm 2020, Phạm Văn Hiến Nguyễn Duy Hưng công bố ti lệ nhiễm nấm âm đạo 17,4% tổng.STIs [ l^Ị- Đàm Thị Hòa công bốtỹlệ nhiễm Candida âm đạo 26,2% cho giai đoạn 1996-1998 nghiên cứu Bệnh viện Da liễu [5], Năm 2007, Châu Thị Khánh Trang công bố tỳ lệ nhiễm nấm candida âm đạo 28,9% nghiên cứu viêm âm đạo phụ nữ Chăm [15] Năm 2001, Nguyễn Thị Ngọc Khanh cho thất tỷ lệ viêm âm đạo Candida phụ nữ có thai 44,9% |20| Khi nghiên cứu cần Thơ năm 2008, Trần Thị Lợi công bố tỷ lệ viêm âm đạo tác nhân 34%, nguyên nấm Candida chiếm 10% [16] Từ kêt thây răng, thời gian triển khai nghiên cứu không dài, sổ lượng ca bệnh chi định soi kiếm tra nam có 104 ca Neu xét số ca nhiễm Candida số ca nghi ngờ nhiễm nấm thì tý lệ thu nằm khoảng tác giã công bố Việt Nam Nhưng theo nhận định cùa chúng tôi, thời gian triền khai nghiên cứu cùa chúng tồi tiến hành vào giai đoạn mùa khơ, điều kiện thời tiết ánh hưởng nhiều đến kết cuối Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 29 Khóa luận tốt nghiệp 3.5 Một số đặc điếm sinh hóa Candida Một số mẫu kiểm tra số đặc điểm sinh hóa Kết trình bày Bàng 3.2 Bảng 3.2 Dặc điểm sinh hóa sổ lồi Candida Sinh bào tứ bao dày Sabouraud lõng Candida albicans + c stellatoidea c pseudotropicahs Loại nấm Đồng hóa Lén men G M Cặn AH AH - Cặn AH AH - Cận AH - c tropicalis - Váng AH AH c krusei - Váng AH - L s G M s L Ga - AH AH + - + AH AH + - + + + + + + - + + + - - - - AH - - + - - 3.6 Xác định loài nấm Candida phuong pháp PCR 3.4.1 Đặc điếm mẫu dược dinh loài phương pháp PCR Do thời gian hạn chế chọn 22 mẫu số 40 mẫu chần đoán Candida phương pháp soi tươi đế tiến hành xác định loài nấm Candida bàng kỹ thuật PCR Tên mẫu xét nghiệm số thứ tự cùa mẫu chọn nghiên cứu nêu Bảng 3.3 Đặc điểm mẫu trước xét nghiệm PCR STT Tên mẫu Đặc điểm mẫu Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, nhiều khuẩn lạc kích thước khuấn lạc nhở Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 30 Khóa luận tốt nghiệp STT Tên mẫu Đặc điểm mẫu Te bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc rời có kích thước trung bình, phân bố bề mặt thạch Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, nhiều khn lạc kích thước khuấn lạc nhó Te bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khống 1,5 đen mm Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch 10 Các tế bào vi nấm chi mọc góc ống thạch (rất ít) 12 Te bào vi nấm mọc thành khuấn lạc, nhiều khuẩn lạc kích thựớc khuẩn lạc nhó mọc sát Thư V ệộ viện Đại nọc Mơ 11 aNội 14 Chưa lên 10 17 Tế bào vi nấm mọc thành sợi nấm dạng bông, màu hồng II 19 Te bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch 12 22 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng 1,5 mm 13 23 Te bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuân lạc mọc nhiều đè lên 14 25 Te bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc rời nhau, số lượng nhiều, kích thước khuẩn lạc nhỏ Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 31 Khóa luận tốt nghiệp STT 15 Đặc điểm mẫu Tên mẫu 27 Te bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuẩn lạc mọc nhiều đè lên 16 28 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, số lượng nhiều, kích thước nhị 17 30 Te bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuân lạc mọc nhiều đè lên 18 32 Tế bào vi nấm mọc thành sợi nấm dạng 19 33 Te bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khống mm 20 35 Te bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng mm 21 3Ĩhư V Te bào vi nấm mọc thành khn lạc to, rời nhau, kích thước khống mm 22 39 Tế bào vi nấm mọc thành khuấn lạc, rời nhau, kích thước trung bình 3.4.2 Tách chiết DNA hệgen mẫu xác định Candida DNA hệ gen mẫu tách chiết theo phương pháp mô tả chi tiết phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu Kết thu được điện di kiềm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.6) Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 32 Khóa luận tốt nghiệp ĐC 22 10 12 14 17 19 23Ĩhỉfeviệ& Vjgn ỉầôi lw Mơ hà ĩ$ậi 39 Hình 3.6 DNA hệ gen tách chiết từ 22 mẫu nấm kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 33 Khóa luận tốt nghiệp Kết q Hình 3.6 cho thấy, DNA hệ gen dòng tể bào tách chiết được, đường chạy có băng DNA có kích thước lớn, rõ nét Một số mẫu lượng DNA genome nhiều nên chạy gel agarose băng DNA hệ gen to rõ vệt mờ băng DNA hệ gen Tuy nhiên không thay xuất vệt băng DNA phía dưới, điều cho thay DNA hệ gen sử dụng làm khuôn DNA khuếch đại đoạn DNA bang kỹ thuật PCR 3.4.3 Kết khuếch đại DNA cặp mồi ỈTS1-ITS4 Sử dụng DNA hệ gen tách chiết thí nghiệm trước, phản ứng PCR thực với thành phần mô tà phần phương pháp Sàn phẩm PCR kiếm tra điện di gel agarose 0,8% (Hình 3.7) M100 M100 22 23 25 28 30 Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 10 32 34 12 33 14 17 Mlkb 35 bp 39 Mlkb Khóa luận tốt nghiệp Ml 00 9C 90 99 100 102 103 104 105 103 M1B> bp Hình 3.7 Ket khuếch đại DNA cặp mồi IST1 - ITS4 kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết Hình 3.7 cho thấy, mầu thu sàn phẩm PCR băng DNA rõ nét, điều nậy chứng'tộ DNA hệ gen có chất lượng tốt, mồi chương trình chạy PCR phù hợp Trong số 18 mầu thí nghiệm, có 12 mẫu thí nghiệm xuất băng DNA có kích thước khống 500 bp, mầu xuất băng DNA mẫu 1, mẫu 10, mẫu 22, mẫu 30, mẫu 33 mẫu 39 Chúng nghĩ rang mẫu ni cấy có chứa nhiều 01 loài Candida nên tách chiết DNA vần cho băng DNA hệ gen DNA hệ gen có kichs thước lớn Trong sán phấm PCR xuất băng, chứng tở tồn nhiều loài mẫu ni cấy Để xác định lồi Candidaa, sán phẩm PCR cắt kiểm tra bang enzyme cắt hạn che Msp I Quy trình thực phán ứng cắt sản phâm PCR bang enzzyme cắt hạn che thực theo mô tà phần vật liệu phương pháp nuôi cấy Theo Mirhendi đồng tác giá năm 2006, nhóm nghiên cứu sử dụng enzyme Msp để cắt săn phấm phản ứng PCR khuếch đại mồi ITS - ITS4 Theo đó, nhóm nghiên cứu phân biệt lồi Candida gây bệnh, cụ trình bày Báng [aa] Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 35 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.4 Kích thước sản phẩm PCR, sản phẩm cắt Msp I cuar lồi Candida tng ứng Kích thước PCR Kích thước sản phẩm ITS1-ITS4 (bp) cắt enzyme c albicans 535 297,238 c glabrata 871 557,314 c tropical 524 340, 184 c krusei 510 261,249 c guilermondii 608 371, 155,82 c parapsilosis 520 520 Loài Candida sp San phẩm phan ứng cắt kiếm tra diện di gel agarose 1.7% (Hình 3.8) M100 Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 10 36 12 14 17Mlkb Khóa luận tốt nghiệp M100 22 23 25 28 30 32 33 35 39 Mlkb bp Hình 3.8 Sản phẩm phản ứng PCR cắt bỏi enzyme Msp I kiểm tra điện di gel agarose 1,7% Kết Hình 3.8 cho thấy0ặji phạm PCR cắt enzyme Msp tạo thành băng DNA có kích thước khác hình ảnh điện di Kết quà tổng hợp kích thước sản phấm PCR kích thước sản phẩm cắt bang enzyme cắt hạn chế định loài theo Mirhendi đồng tác già năm 2006 trình bày Báng Bảng 3.5 Kích thước săn phẩm PCR ITS1-ITS4 trước sau cắt Msp I Kích thưóc Kích thưóc sản phẩm ITS1-ITS4 (bp) cắt enzyme (Hình 3.7) (Hình 3.8) 535 -400 297 238 >500 520 c parapsilosis >500 520 c parapsilosis Mầu Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 37 Loài Candida sp c albicans Khóa luận tốt nghiệp -600 Khơng cắt Không xác định >500 520 c parapsilosis 10 535 -400 297,238 c albicans 12 535 297, 238 c albicans 14 >500 520 c parapsilosis c albicans 17 535 297, 238 22 >500 520 23 535, 500 520 28 535, >500 297, 238 c albicans 30 524, - 600 340 184 c 535 297, 238 32 33 >500^iện c parapsilosis c albicans c parapsilosis c albicans Viện Đại^ôc Mớ Hà 35 524 340 184 39 > 500 + < 400 Không cắt tropical ^.flarapsilosis c tropical Không xác dinh Bảng 3.6 Sự đa dạng loài nấm số mẫu khảo sát Tên loài Số luựng Phần trăm % c albicans 38,39 38,39 c tropical 11,11 Không xác định 11,11 18 100 c parapsilosis Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 38 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tỷ lệ ca nghi ngờ nhiễm nấm sinh sục chi định soi tươi tìm nấm tồng số ca thăm khám 13,6% Tý lệ nhiễm nấm sinh dục số ca nghi ngờ nhiễm nấm chi định soi tươi tìm nấm 38,5% Sừ dụng phương pháp PCR kết hợp cắt sản phẩm PCR enzyme cắt hạn chế xác định loài c albicans, loài c parapsilosis lồi c tropical số 18 mẫu thí nghiệm Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR cắt enzyme hạn chế để chẩn đoán sớpỊ, gây bệnh thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 39 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Xét nghiệm vi sinh lâm sàng - PGS.TS Nguyễn Đạt Anh biên Atlas Hình thể vi khuẩn khuẩn lạc- PGS.TS Lê vãn Phủng http://text.xemtailieu.com/tai-lieu/khao-sat-mot-so-yeu-to-lien-quan-dennam-candida-gay-benh-niem-mac-am-dao-108691 html Giaso trình vi sinh vật Y học, Y tế ban hành 2006 Tài liệu tiếng Anh DROUHET E, COUTEAU M Sur la determination des Candida; étude des caractères morphologiques et physiologiques de 78 souches isolées de prélèvements pathologiques Ann Inst Pasteur (Paris) 1954 May;86(5):602-617 MARPLES MJ, DI MẸNNẠ ME< The incidence of Candida albicans in Dunedin, New Zealand J Pathol Bacteriol 1952 Jul;64(3):497-502 DI MENNA ME Natural occurrence of rough variant of a yeast, Candida albicans Nature 1952 Mar 29; 169(4300):550-551 NICKERSON WJ, MANKOWSKI z A polysaccharide medium of known composition favoring chlamydospore formation in Candida albicans J Infect Dis 1953 Jan-Feb;92(l):20-25 Skinner CE THE YEAST-LIKE FUNGI: CANDIDA AND BRETTANOMYCES Bacteriol Rev 1947 Dec;l (4):227-274 Tanner FW, Jr, Vojnovich c, VAN Lanen RIBOFLAVIN PRODUCTION BY CANDIDA SPECIES JM Science 1945 Feb 16;101(2616):180-181 Nguyền Thị Ngọc - CNSH 13.01 40 Khóa luận tốt nghiệp ... đề tài: Xác định tỷ lệ nhi? ??m nấm sinh dục Candida cùa bệnh nhân đến khám Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (tử 10/2016 đến 02/2017) Mục tiêu đề tài: Xác định tỷ lệ số yếu tố liên quan đến nấm Candida. .. tỉ lệ so ca nghi ngờ nhi? ??m nấm chi định soi tìm nấm 13,6 % Trong số phát 40 trường hợp nhi? ??m nam sinh dục, chiếm 38,5%, lại nhi? ??m tác nhân khác Như tính tống số ca đến thăm khám ti lệ nhi? ??m nấm. .. 3.4.2 Tì lệ nhi? ??m nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp 29 3.5 Một số đặc điếm sinh hóa Candida 30 3.6 Xác định loài nấm Candida phương pháp PCR 30 3.4.1 Đặc điếm mẫu định loài