Xác định tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục candida của các bệnh nhân tại bệnh viện sản nhi quảng ninh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN SẢN NHI QUẢNG NINH Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Trung ThS Tạ Thị Thu Hợp Sinh viên thực : Nguyễn Thị Ngọc Lớp : 13.01 Hà Nội, 2017 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, đặc biệt thầy cô khoa Công nghệ Sinh học dạy dỗ em suốt năm học trường, trang bị cho em tảng kiến thức khoa học tạo điều kiện tốt cho em làm báo cáo tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trung, công tác Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Tạ Thị Thu Hợp, Trưởng khoa Huyết học-Vi sinh-Sinh học Phân tử -Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh truyền cho em phương pháp học tập nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu vừa qua Đồng thời, em gửi lời cảm ơn tới cô chú,anh chị khoa Vi sinh-sinh học phân tử - Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh giúp đỡ em nhiều thời gian thực tập Cuối cùng,em xin gửi tới gia đình, người thân,bạn bè lời cảm ơn sâu sắc ln giúp đỡ,động viên em suốt thời gian học tập Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung nấm Candida sp Y học 1.1.1 Đại cương nấm candidas 1.1.2 Đặc điểm nấm Candida 1.2 Các yếu tố thuận lợi dễ nhiễm nấm candida 1.2.1 Yếu tố nội lai 1.2.2 Yếu tố ngoại lai 1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.3.1 Ở nữ giới 1.3.2 Ở nam giới 1.4 Cơ chế gây bệnh 1.5 Phòng diệu trị bệnh nhiễm nấm Candida 1.5.1 Nguyên tắc điều trị 1.5.2 Phòng ngừa bệnh nhiễm nấm Candida 1.6 Phương pháp phát 1.6.1 Phương pháp soi tươi 1.6.2 Phương pháp nuôi cấy 1.6.3 Phương pháp PCR PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Địa điểm thực 10 2.2 Đối tương nghiên cứu 10 2.2.1 Đối tượng 10 2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 10 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 10 2.3 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 10 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 2.3.1 Vật liệu 10 2.3.2 Trình tự mồi 11 2.3.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 11 2.3.3.1 Hóa chất 11 2.3.3.2 Các dụng cụ nghiên cứu 12 2.3.3.3 Các thiết bị nghiên cứu 12 2.3.4 Các loại môi trường sử dụng 12 2.4 Phương pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp 12 2.4.1.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp 12 2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu Gram 13 2.4.2 Phương pháp nuôi cấy 15 2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA hệ gen nấm 16 2.4.3.1 Tách chiết DNA hệ gen nấm 16 2.4.3.2 Làm DNA hệ gen nấm sau tách chiết 17 2.4.4 Phương pháp khếch đại gen cặp mồi đặc hiệu 18 2.4.5 Phương pháp cắt DNA enzyme cắt hạn chế 19 2.4.6 Phương pháp điện di DNA gel agarose 20 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết thu thập mẫu 22 3.2 Danh sách mẫu thu thập 23 3.3 Đặc điểm hình thái nấm Candida quan sát xét nghiệm 25 3.1.1 Đặc điểm hình thái nấm nấm Candida quan sát nhuộm soi 25 3.3.2 Đặc điểm hình thái nấm Candida q trình ni cấy 27 3.4 Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida mẫu nghiên cứu phương pháp soi trực tiếp 28 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI 3.4.1 Các loại vi sinh vật phát 28 3.4.2 Tỉ lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp 29 3.5 Một số đặc điểm sinh hóa Candida 30 3.6 Xác định loài nấm Candida phương pháp PCR 30 3.4.1 Đặc điểm mẫu định loài phương pháp PCR 30 3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen mẫu xác định Candida 32 3.4.3 Kết khuếch đại DNA cặp mồi ITS1-ITS4 34 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Kết luận 39 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh nấm Candida Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram 14 Hình 3.1: Phòng thí nghiệm xét nghiệm mẫu 22 Hình 3.2 Dụng cụ lấy mẫu 23 Hình 3.3: Một số hình ảnh mẫu bệnh phẩm nhuộm soi kính hiển vi 26 Hình 3.4: Mẫu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sabouraud 27 Hình 3.5: Mẫu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sabouraud thạch nghiêng 28 Hình 3.6 DNA hệ gen tách chiết từ 22 mẫu nấm kiểm tra điện di gel agarose 0,8% 33 Hình 3.7 Kết khuếch đại DNA cặp mồi IST1 – ITS4 kiểm tra điện di gel agarose 0,8% 35 Hình 3.8 Sản phẩm phản ứng PCR cắt enzyme Msp I kiểm tra điện di gel agarose 1,7% 37 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt DNA enzyme Msp I 20 Bảng 3.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm 40 bệnh nhân chọn để tiến hành xét nghiệm 23 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa số loài Candida 30 Bảng 3.3 Đặc điểm mẫu trước xét nghiệm PCR 30 Bảng 3.4 Kích thước sản phẩm PCR, sản phẩm cắt Msp I cuar loài Candida tương ứng 36 Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm PCR ITS1-ITS4 trước sau cắt Msp I 37 Bảng 3.6 Sự đa dạng loài nấm số mẫu khảo sát 38 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LỜI MỞ ĐẦU Nhiễm nấm bệnh phổ biến giới Nấm tồn khắp nơi: môi trường đất, nước,không khí,ở thực vật,động vật thể người Khi gặp điều kiện thuận lợi nóng ẩm ,sức đề kháng suy giảm…nấm phát triển gây bệnh Bệnh nấm gây gặp nhiều nước nhiệt đới ôn đới [29] Việt Nam nằm vùng nhiệt đới gió mùa có nhiệt độ độ ẩm cao điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển dễ dàng gây nhiễm nấm người Bên cạnh đó, xu hướng ngày gia tăng bệnh nhiễm khuẩn đường sinh sản (Reproductive tract infection– RTI) bệnh lây truyền qua đường tình dục (Secxually transmitted infection - STI), đặc biệt trước bùng nổ đại dịch HIV/AIDS Vì vậy, tỷ lệ bệnh nhiễm nấm hội ngày gia tăng [3] Trong đó, viêm âm đạo nấm vấn đề quan trọng chăm sóc sức khỏe sinh sản Bệnh gặp lứa tuổi thơng thường phụ nữ thời kỳ sinh đẻ có tỷ lệ mắc bệnh cao cộng đồng [58] Klein Catherine (2012) thấy khoảng 70-75% phụ nữ nhiễm nấm âm đạo lần đời nửa số hộ bị tái phát hàng năm [53] Biểu lâm sang nhiễm nấm vùng niêm mạc âm hộ, âm đạo thường không đặc hiệu như: Ngứa,đau rát, viêm trợt niêm mạc, tiết dịch, chảy máu…Bệnh ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sống người bệnh Nếu bệnh khơng điều trị kịp thời diễn biến dai dẳng, tiến triển nặng nề gây nhiều biến chứng ảnh hưởng đến quan phủ tạng chí gây vơ sinh tử vong [10] Nguyên nhân điều trị thất bại liên quan đến yếu tố thể vật chủ sử dụng thuốc vi nấm gây bệnh Trong yêu tố liên quan đến vật chủ thường có vai trò quan trọng đưa đến tượng kháng thuốc [27] Những năm gần đây,cùng với việc ứng Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp dụng thành tựu y học,việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng nấm vấn đề đáng lo ngại Trên thực tế lâm sàng có nhiều trường hợp khơng đáp ứng với kháng sinh kháng nấm [1], [2], [3] Nhiều nghiên cứu khác nhiễm nấm Candida âm đạo dai dẳng ,tái phát chúng sinh kiểu gen kháng thuốc thông qua biến đổi hình thái tính chất mơi trường có thuốc kháng nấm [36] Thực trang cho thấy, thiếu điều kiện xét nghiệm gặp khó khăn việc tìm ngun nhân để chuẩn đoán điều trị bệnh cách hiểu [27] Hiện có nhiều phương phát, nhiều kỹ thuật để phát nấm tác nhân gây bệnh đường sinh dục Tùy thuộc điều kiện sở vật chất, trang thiết bị có mà phòng xét nghiệm triển khai kỹ thuật đơn giản hay đại Xuất phát từ sở khoa học thực tiễn, đề xuất đề tài: Xác định tỷ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida bệnh nhân đến khám Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (từ 10/2016 đến 02/2017) Mục tiêu đề tài: Xác định tỷ lệ số yếu tố liên quan đến nấm Candida gây bệnh đường sinh dục bệnh nhân đến khám bệnh viện Khảo sát chủng nấm Candida gây bệnh đường sinh dục Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung nấm Candida sp Y học 1.1.1 Đại cương nấm candidas Bệnh Candida sp viết y văn từ thời Hypocrate Galen tên gọi khác như: Monila, Candida…Năm 1792, Frank mô tả lâm sàng bệnh Năm 1894, Wilkinson xác định triệu chứng lâm sàng bệnh liên quan tới nguyên nấm Đến 1923 Berkhout mô tả chi tiết nấm tên thống Candida [28] C albicans loại nấm men sinh sản đơn bào nảy chồi Bên cạnh có sợi nấm giả gồm tế bào dài dính vào điểm nhỏ dễ gẫy Năm 1952, người ta phát có khoảng 30 loài Candidas liên quan đến y học số 300 giống tìm thấy Ngày có khoảng 35 loài liên quan đến y học xác định Trong lồi C albicans có độc tính cao hay gây bệnh người Ngồi có C tropicalis, C pseudotropicalis, C parakrusei, C krusei, C guillermondi mà lâm sàng hay gặp Những loài candida thường tạp sinh Nhưng điều kiện thuận lợi gây bệnh (gây bệnh hội) Vị trí canbicans phân loại dạng nấm men Theo Lodder có loại nấm men là: Men có nang đảm: sinh sản nang đảm (ascus) điển hình nấm men saccharomyces Men khơng có nang đảm: hợp thành họ lớn cryptococcacaae Và nấm candida loài thuốc họ cryptococcacea Tất bệnh nấm candida gây gọi bệnh candidose (ngày xưa gọi bệnh levures, 1.1.2 Đặc điểm nấm Candida Candida nấm men tồn phổ biến thiên nhiên, kí sinh chủ yếu người súc vật Ngày nay, nấm Candida Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.3: Một số hình ảnh mẫu bệnh phẩm nhuộm soi kính hiển vi Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 26 Khóa luận tốt nghiệp 3.3.2 Đặc điểm hình thái nấm Candida trình ni cấy Trong ống nghiệm có chứa sẵn 0,5-1ml huyết thỏ, hồ tan khuẩn lạc nấm bệnh phẩm vào huyết thanh, ủ 37oC Lấy giọt huyết nhỏ lên lam kính quan sát kính hiển vi - Nếu thấy có ống mầm: Candida albicans - Nếu khơng có ống mầm: Các loại Candida khác Hình 3.4: Mẫu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sabouraud Sau soi kính, xác định mẫu chứa Candida mẫu chuyển sang nuôi cấy ống thạch nghiêng thu sinh khối để tiến hành thí nghiệm tách chiết DNA hệ gen xác định loài phương pháp PCR kết hợp cắt enzyme cắt hạn chế Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 27 Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.5: Mẫu bệnh phẩm nấm nuôi cấy môi trường sabouraud thạch nghiêng 3.4 Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida mẫu nghiên cứu phương pháp soi trực tiếp 3.4.1 Các loại vi sinh vật phát Bằng phương pháp soi trực tiếp mẫu bệnh phẩm, nhiều loại vi sinh vật chẩn đoán tồn mẫu Các vi sinh vật phát mẫu bệnh phẩm mà thực gồm: - Candida; - Lactobacili; - Garderella vaginalis; - Coliforms; - Staphylococcus (S aureus, S epidermidis, S saprophycoccus); - Streptococcus (S viridans, B ); - Enterococcus; - Mycoplasma hominis; - Trùng roi đường sinh dục; - Tế bào Glue; - Vi khuẩn Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 28 Khóa luận tốt nghiệp 3.4.2 Tỉ lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp Theo thống kê số liệu khảo sát bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh vào tháng 2/2017 sau: Tổng số bệnh nhân đến thăm khám viện 765 ca; Tổng số ca làm xét nghiệm dịch âm đạo tìm nấm 104 ca; Số ca phát nhiễm nấm sinh dục phương pháp soi trực tếp 40 ca Như tỉ lệ số ca nghi ngờ nhiễm nấm định soi tìm nấm 13,6 % Trong số phát 40 trường hợp nhiễm nấm sinh dục, chiếm 38,5%, lại nhiễm tác nhân khác Như tính tổng thể số ca đến thăm khám tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục phát phương pháp soi trực tiếp 5,2% Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu công bố liên quan đến nhiễm nấm đường sinh dục Nguyễn Thị Đào công bố tỉ lệ nhiễm Candida sinh dục phụ nữ khỏe mạnh 25-30%, phụ nữ có thai 40-50% [13] Năm 2020, Phạm Văn Hiến Nguyễn Duy Hưng công bố tỉ lệ nhiễm nấm âm đạo 17,4% tổng STls [14] Đàm Thị Hòa cơng bố tỷ lệ nhiễm Candida âm đạo 26,2% cho giai đoạn 1996-1998 nghiên cứu Bệnh viện Da liễu [5] Năm 2007, Châu Thị Khánh Trang công bố tỷ lệ nhiễm nấm candida âm đạo 28,9% nghiên cứu viêm âm đạo phụ nữ Chăm [15] Năm 2001, Nguyễn Thị Ngọc Khanh cho thất tỷ lệ viêm âm đạo Candida phụ nữ có thai 44,9% [20] Khi nghiên cứu Cần Thơ năm 2008, Trần Thị Lợi công bố tỷ lệ viêm âm đạo tác nhân 34%, nguyên nấm Candida chiếm 10% [16] Từ kết thấy rằng, thời gian triển khai nghiên cứu không dài, số lượng ca bệnh định soi kiểm tra nấm có 104 ca Nếu xét số ca nhiễm Candida số ca nghi ngờ nhiễm nấm thì tỷ lệ thu nằm khoảng tác giả công bố Việt Nam Nhưng theo nhận định chúng tôi, thời gian triển khai nghiên cứu chúng tơi tiến hành vào giai đoạn mùa khơ, điều kiện thời tiết ảnh hưởng nhiều đến kết cuối Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 29 Khóa luận tốt nghiệp 3.5 Một số đặc điểm sinh hóa Candida Một số mẫu kiểm tra số đặc điểm sinh hóa Kết trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa số loài Candida 3.6 Xác định loài nấm Candida phương pháp PCR 3.4.1 Đặc điểm mẫu định loài phương pháp PCR Do thời gian hạn chế nên chọn 22 mẫu số 40 mẫu chẩn đoán Candida phương pháp soi tươi để tiến hành xác định loài nấm Candida kỹ thuật PCR Tên mẫu xét nghiệm số thứ tự mẫu chọn nghiên cứu nêu Bảng 3.3 Đặc điểm mẫu trước xét nghiệm PCR STT Tên mẫu Đặc điểm mẫu 1 Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, nhiều khuẩn lạc kích thước khuẩn lạc nhỏ Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 30 Khóa luận tốt nghiệp STT Tên mẫu Đặc điểm mẫu Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc rời có kích thước trung bình, phân bố bề mặt thạch Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, nhiều khuẩn lạc kích thước khuẩn lạc nhỏ Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng 1,5 đến mm Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch 10 Các tế bào vi nấm mọc góc ống thạch (rất ít) 12 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, nhiều khuẩn lạc kích thước khuẩn lạc nhỏ, mọc sát 14 Chưa lên 10 17 Tế bào vi nấm mọc thành sợi nấm dạng bông, màu hồng 11 19 Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn bề mặt thạch 12 22 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng 1,5 mm 13 23 Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuẩn lạc mọc nhiều đè lên 14 25 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc rời nhau, số lượng nhiều, kích thước khuẩn lạc nhỏ Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 31 Khóa luận tốt nghiệp STT Tên mẫu Đặc điểm mẫu 15 27 Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuẩn lạc mọc nhiều đè lên 16 28 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, số lượng nhiều, kích thước nhỏ 17 30 Tế bào vi nấm mọc thành lớp mịn khuẩn lạc mọc nhiều đè lên 18 32 Tế bào vi nấm mọc thành sợi nấm dạng 19 33 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng mm 20 35 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng mm 21 37 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc to, rời nhau, kích thước khoảng mm 22 39 Tế bào vi nấm mọc thành khuẩn lạc, rời nhau, kích thước trung bình 3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen mẫu xác định Candida DNA hệ gen mẫu tách chiết theo phương pháp mô tả chi tiết phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu Kết thu được điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 3.6) Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 32 Khóa luận tốt nghiệp ĐC 22 23 25 27 28 30 10 12 14 17 19 32 33 35 37 39 Hình 3.6 DNA hệ gen tách chiết từ 22 mẫu nấm kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 33 Khóa luận tốt nghiệp Kết Hình 3.6 cho thấy, DNA hệ gen dòng tế bào tách chiết được, thể đường chạy có băng DNA có kích thước lớn, rõ nét Một số mẫu lượng DNA genome nhiều nên chạy gel agarose băng DNA hệ gen to rõ vệt mờ băng DNA hệ gen Tuy nhiên không thấy xuất vệt băng DNA phía dưới, điều cho thấy DNA hệ gen sử dụng làm khn DNA khuếch đại đoạn DNA kỹ thuật PCR 3.4.3 Kết khuếch đại DNA cặp mồi ITS1-ITS4 Sử dụng DNA hệ gen tách chiết thí nghiệm trước, phản ứng PCR thực với thành phần mô tả phần phương pháp Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8% (Hình 3.7) M100 10 12 14 17 M1kb bp 10000 3000 1000 500 250 M100 22 23 25 28 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 30 32 33 34 35 39 M1kb Khóa luận tốt nghiệp bp 10000 3000 1000 500 250 Hình 3.7 Kết khuếch đại DNA cặp mồi IST1 – ITS4 kiểm tra điện di gel agarose 0,8% Kết Hình 3.7 cho thấy, mẫu thu sản phẩm PCR băng DNA rõ nét, điều chứng tỏ DNA hệ gen có chất lượng tốt, mồi chương trình chạy PCR phù hợp Trong số 18 mẫu thí nghiệm, có 12 mẫu thí nghiệm xuất băng DNA có kích thước khoảng 500 bp, mẫu xuất băng DNA mẫu 1, mẫu 10, mẫu 22, mẫu 30, mẫu 33 mẫu 39 Chúng tơi nghĩ mẫu ni cấy có chứa nhiều 01 loài Candida nên tách chiết DNA cho băng DNA hệ gen DNA hệ gen có kichs thước lớn Trong sản phẩm PCR xuất băng, chứng tỏ tồn nhiều lồi mẫu ni cấy Để xác định loài Candidaa, sản phẩm PCR cắt kiểm tra enzyme cắt hạn chế Msp I Quy trình thực phản ứng cắt sản phảm PCR enzzyme cắt hạn chế thực theo mô tả phần vật liệu phương pháp nuôi cấy Theo Mirhendi đồng tác giả năm 2006, nhóm nghiên cứu sử dụng enzyme Msp I để cắt sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại mồi ITS1 – ITS4 Theo đó, nhóm nghiên cứu phân biệt lồi Candida gây bệnh, cụ thể trình bày Bảng [aa] Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 35 Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.4 Kích thước sản phẩm PCR, sản phẩm cắt Msp I cuar loài Candida tương ứng Kích thước PCR Kích thước sản phẩm ITS1-ITS4 (bp) cắt enzyme C albicans 535 297,238 C glabrata 871 557, 314 C tropical 524 340, 184 C krusei 510 261, 249 C guilermondii 608 371, 155, 82 C parapsilosis 520 520 Loài Candida sp Sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra điện di gel agarose 1,7% (Hình 3.8) M100 10 12 14 17M1kb bp 10000 1000 500 250 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 36 Khóa luận tốt nghiệp M100 22 23 25 28 30 32 33 35 39 M1kb bp 10000 3000 1000 500 250 Hình 3.8 Sản phẩm phản ứng PCR cắt enzyme Msp I kiểm tra điện di gel agarose 1,7% Kết Hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR cắt enzyme Msp I tạo thành băng DNA có kích thước khác hình ảnh điện di Kết tổng hợp kích thước sản phẩm PCR, kích thước sản phẩm cắt enzyme cắt hạn chế định loài theo Mirhendi đồng tác giả năm 2006 trình bày Bảng Bảng 3.5 Kích thước sản phẩm PCR ITS1-ITS4 trước sau cắt Msp I Kích thước Kích thước sản phẩm ITS1-ITS4 (bp) cắt enzyme (Hình 3.7) (Hình 3.8) 535, ~400 297, 238 >500 520 C parapsilosis >500 520 C parapsilosis Mẫu Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 37 Lồi Candida sp C albicans Khóa luận tốt nghiệp ~ 600 Không cắt Không xác định >500 520 C parapsilosis 10 535, ~400 297,238 C albicans 12 535 297, 238 C albicans 14 >500 520 17 535 297, 238 22 >500 520 23 535, 500 520 28 535, >500 297, 238 C albicans 30 524, ~ 600 340, 184 C tropical 32 535 297, 238 C albicans 33 >500, 500 + < 400 Không cắt C parapsilosis C albicans C parapsilosis C albicans C parapsilosis C parapsilosis C tropical Không xác định Bảng 3.6 Sự đa dạng loài nấm số mẫu khảo sát Tên loài Số lượng Phần trăm % C albicans 38,39 38,39 C tropical 11,11 Không xác định 11,11 18 100 C parapsilosis Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 38 Khóa luận tốt nghiệp PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tỷ lệ ca nghi ngờ nhiễm nấm sinh sục định soi tươi tìm nấm tổng số ca thăm khám 13,6% Tỷ lệ nhiễm nấm sinh dục số ca nghi ngờ nhiễm nấm định soi tươi tìm nấm 38,5% Sử dụng phương pháp PCR kết hợp cắt sản phẩm PCR enzyme cắt hạn chế xác định loài C albicans, loài C parapsilosis loài C tropical số 18 mẫu thí nghiệm Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR cắt enzyme hạn chế để chẩn đoán sớm, xác tác nhân gây bệnh nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh điều trị Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 39 Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Xét nghiệm vi sinh lâm sàng - PGS.TS Nguyễn Đạt Anh chủ biên Atlas Hình thể vi khuẩn khuẩn lạc- PGS.TS Lê văn Phủng 3.http://text.xemtailieu.com/tai-lieu/khao-sat-mot-so-yeu-to-lien-quan-dennam-candida-gay-benh-niem-mac-am-dao-108691.html Giaso trình vi sinh vật Y học, Y tế ban hành 2006 Tài liệu tiếng Anh DROUHET E, COUTEAU M Sur la détermination des Candida; étude des caractères morphologiques et physiologiques de 78 souches isolées de prélèvements pathologiques Ann Inst Pasteur (Paris) 1954 May;86(5):602–617 MARPLES MJ, DI MENNA ME The incidence of Candida albicans in Dunedin, New Zealand J Pathol Bacteriol 1952 Jul;64(3):497–502 DI MENNA ME Natural occurrence of rough variant of a yeast, Candida albicans Nature 1952 Mar 29;169(4300):550–551 NICKERSON WJ, MANKOWSKI Z A polysaccharide medium of known composition favoring chlamydospore formation in Candida albicans J Infect Dis 1953 Jan-Feb;92(1):20–25 Skinner CE THE YEAST-LIKE FUNGI: CANDIDA AND BRETTANOMYCES Bacteriol Rev 1947 Dec;11(4):227–274 Tanner FW, Jr, Vojnovich C, VAN Lanen JM RIBOFLAVIN PRODUCTION BY CANDIDA SPECIES Science 1945 Feb 16;101(2616):180–181 Nguyễn Thị Ngọc – CNSH 13.01 40 Khóa luận tốt nghiệp ... tài: Xác định tỷ lệ nhi m nấm sinh dục Candida bệnh nhân đến khám Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (từ 10/2016 đến 02/2017) Mục tiêu đề tài: Xác định tỷ lệ số yếu tố liên quan đến nấm Candida gây bệnh. .. thu thập mẫu Các mẫu dịch âm đạo lấy từ bệnh phẩm bệnh nhân đến khám bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh tháng 2/2017 Các mẫu bệnh phẩm định xét nghiệm tìm nấm bệnh phẩm nghi ngờ nhi m bệnh Dùng tăm... viêm âm đạo nấm Candida đến khám diều trị Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (Phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh) Đồng thời, có định xét nghiệm trực tiếp tìm nấm dương tính,