Xác định tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục candida của các bệnh nhân tại bệnh viện sản nhi quảng ninh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN SẢN NHI QUẢNG NINH Giáo viên h

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM NẤM SINH DỤC CANDIDA

CỦA CÁC BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN

SẢN NHI QUẢNG NINH

Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Trung ThS Tạ Thị Thu Hợp Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Ngọc Lớp : 13.01

Hà Nội, 2017

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Viện Đại học Mở

Hà Nội, đặc biệt các thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học đã dạy dỗ em trong suốt 4 năm học tại trường, trang bị cho em nền tảng kiến thức khoa học

và tạo điều kiện tốt nhất cho em được làm bài báo cáo tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Nguyễn Thị Trung, công tác tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS

Tạ Thị Thu Hợp, Trưởng khoa Huyết học-Vi sinh-Sinh học Phân tử -Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh đã truyền cho em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời, em cũng gửi lời cảm ơn tới các cô chú,anh chị trong khoa

Vi sinh-sinh học phân tử - Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực tập

Cuối cùng,em xin gửi tới gia đình, người thân,bạn bè lời cảm ơn sâu sắc vì đã luôn giúp đỡ,động viên em trong suốt thời gian học tập

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan chung về nấm Candida sp Y học 3

1.1.1 Đại cương về nấm candidas 3

1.1.2 Đặc điểm của nấm Candida 3

1.2 Các yếu tố thuận lợi dễ nhiễm nấm candida 4

1.2.1 Yếu tố nội lai 4

1.2.2 Yếu tố ngoại lai 5

1.3 Triệu chứng lâm sàng 5

1.3.1 Ở nữ giới 5

1.3.2 Ở nam giới 6

1.4 Cơ chế gây bệnh 6

1.5 Phòng và diệu trị bệnh do nhiễm nấm Candida 7

1.5.1 Nguyên tắc điều trị 7

1.5.2 Phòng ngừa bệnh nhiễm nấm Candida 8

1.6 Phương pháp phát hiện 8

1.6.1 Phương pháp soi tươi 8

1.6.2 Phương pháp nuôi cấy 8

1.6.3 Phương pháp PCR 9

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Địa điểm thực hiện 10

2.2 Đối tương nghiên cứu 10

2.2.1 Đối tượng 10

2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 10

2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 10

2.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 10

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

2.3.1 Vật liệu 10

2.3.2 Trình tự mồi 11

2.3.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 11

2.3.3.1 Hóa chất 11

2.3.3.2 Các dụng cụ nghiên cứu 12

2.3.3.3 Các thiết bị nghiên cứu 12

2.3.4 Các loại môi trường sử dụng 12

2.4 Phương pháp nghiên cứu 12

2.4.1 Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp 12

2.4.1.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp 12

2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu bản Gram 13

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy 15

2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA hệ gen của nấm 16

2.4.3.1 Tách chiết DNA hệ gen của nấm 16

2.4.3.2 Làm sạch DNA hệ gen của nấm sau tách chiết 17

2.4.4 Phương pháp khếch đại gen bằng cặp mồi đặc hiệu 18

2.4.5 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế 19

2.4.6 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 20

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả thu thập mẫu 22

3.2 Danh sách mẫu đã thu thập 23

3.3 Đặc điểm hình thái nấm Candida quan sát được trong xét nghiệm 25

3.1.1 Đặc điểm hình thái nấm nấm Candida quan sát được trong nhuộm soi 25

3.3.2 Đặc điểm hình thái nấm Candida trong quá trình nuôi cấy 27

3.4 Tỉ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida trong mẫu nghiên cứu bằng phương pháp soi trực tiếp 28

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

3.4.1 Các loại vi sinh vật phát hiện được 28

3.4.2 Tỉ lệ nhiệm nấm sinh dục Candida xác định qua soi trực tiếp 29

3.5 Một số đặc điểm sinh hóa của Candida 30

3.6 Xác định loài nấm Candida bằng phương pháp PCR 30

3.4.1 Đặc điểm của các mẫu được định loài bằng phương pháp PCR 30

3.4.2 Tách chiết DNA hệ gen của các mẫu xác định là Candida 32

3.4.3 Kết quả khuếch đại DNA bằng cặp mồi ITS1-ITS4 34

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

1 Kết luận 39

2 Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh nấm Candida 4

Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram 14

Hình 3.1: Phòng thí nghiệm xét nghiệm mẫu 22

Hình 3.2 Dụng cụ lấy mẫu 23

Hình 3.3: Một số hình ảnh về mẫu bệnh phẩm được nhuộm soi dưới kính hiển vi 26

Hình 3.4: Mẫu bệnh phẩm nấm được nuôi cấy trong môi trường sabouraud 27

Hình 3.5: Mẫu bệnh phẩm nấm được nuôi cấy trong môi trường sabouraud thạch nghiêng 28

Hình 3.6 DNA hệ gen tách chiết từ 22 mẫu nấm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% 33

Hình 3.7 Kết quả khuếch đại DNA bằng cặp mồi IST1 – ITS4 và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% 35

Hình 3.8 Sản phẩm phản ứng PCR đã cắt bởi enzyme Msp I và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,7% 37

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 18Bảng 2.2 Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 19

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme Msp I 20

Bảng 3.1 Danh sách mẫu bệnh phẩm của 40 bệnh nhân được chọn

để tiến hành xét nghiệm 23Bảng 3.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Candida 30Bảng 3.3 Đặc điểm của các mẫu trước khi xét nghiệm PCR 30

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có nhiệt độ và độ ẩm cao

là điều kiện thuận lợi cho vi nấm phát triển và dễ dàng gây nhiễm nấm ở người Bên cạnh đó, xu hướng ngày càng gia tăng các bệnh nhiễm khuẩn đường sinh sản (Reproductive tract infection– RTI) và bệnh lây truyền qua đường tình dục (Secxually transmitted infection - STI), đặc biệt trước sự bùng nổ đại dịch HIV/AIDS Vì vậy, tỷ lệ các bệnh do nhiễm nấm cơ hội ngày càng gia tăng [3] Trong đó, viêm âm đạo do nấm hiện đang là một vấn

đề quan trọng của chăm sóc sức khỏe sinh sản Bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi nhưng thông thường nhất là phụ nữ trong thời kỳ sinh đẻ và có tỷ lệ mắc bệnh cao trong cộng đồng [58] Klein Catherine (2012) thấy khoảng 70-75% phụ nữ nhiễm nấm âm đạo ít nhất một lần trong đời và hơn một nửa số hộ bị tái phát hàng năm [53]

Biểu hiện lâm sang nhiễm nấm vùng niêm mạc âm hộ, âm đạo thường không đặc hiệu như: Ngứa,đau rát, viêm trợt niêm mạc, tiết dịch, chảy máu…Bệnh ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của người bệnh Nếu bệnh không được điều trị đúng và kịp thời có thể diễn biến dai dẳng, tiến triển nặng nề gây nhiều biến chứng ảnh hưởng đến các cơ quan phủ tạng thậm chí gây vô sinh hoặc tử vong [10] Nguyên nhân điều trị thất bại liên quan đến các yếu tố như cơ thể vật chủ sử dụng thuốc và vi nấm gây bệnh Trong đó các yêu tố liên quan đến vật chủ thường có vai trò quan trọng đưa đến hiện tượng kháng thuốc [27] Những năm gần đây,cùng với việc ứng

dụng những thành tựu mới của y học,việc sử dụng rộng rãi các thuốc kháng nấm đang là vấn đề đáng lo ngại Trên thực tế lâm sàng đã có nhiều trường hợp không đáp ứng với kháng sinh kháng nấm [1], [2], [3] Nhiều nghiên cứu khác nhau chỉ ra rằng nhiễm nấm Candida âm đạo dai dẳng ,tái phát là

do chúng đã sinh ra kiểu gen kháng thuốc thông qua những biến đổi về hình thái và tính chất ngay trong môi trường có thuốc kháng nấm [36]

Thực trang trên cho thấy, nếu thiếu điều kiện xét nghiệm có thể gặp khó khăn trong việc tìm nguyên nhân để chuẩn đoán và điều trị bệnh một cách hiểu quả [27] Hiện nay có rất nhiều phương phát, nhiều kỹ thuật để phát hiện nấm và các tác nhân gây bệnh đường sinh dục Tùy thuộc và điều kiện và cơ sở vật chất, trang thiết bị hiện có mà mỗi phòng xét nghiệm có thể triển khai các kỹ thuật đơn giản hay hiện đại

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn, chúng tôi đề xuất đề tài:

Xác định tỷ lệ nhiễm nấm sinh dục Candida của bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (từ 10/2016 đến 02/2017)

1 Xác định tỷ lệ và một số yếu tố liên quan đến nấm Candida gây bệnh đường sinh dục của bệnh nhân đến khám tại bệnh viện

2 Khảo sát các chủng nấm Candida gây bệnh đường sinh dục

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan chung về nấm Candida sp Y học

1.1.1 Đại cương về nấm candidas

Bệnh do Candida sp được viết trong y văn từ thời Hypocrate và Galen dưới những tên gọi khác nhau như: Monila, Candida…Năm 1792, Frank mô

tả lâm sàng căn bệnh này Năm 1894, Wilkinson xác định các triệu chứng lâm sàng của bệnh liên quan tới căn nguyên do nấm Đến 1923 Berkhout mô

tả rất chi tiết nấm này dưới tên được thống nhất Candida [28]

C albicans là một loại nấm men sinh sản bằng đơn bào nảy chồi Bên cạnh đó có thể có sợi nấm giả gồm các tế bào dài dính vào nhau bởi một điểm nhỏ và dễ gẫy Năm 1952, người ta đã phát hiện có khoảng 30 loài Candidas liên quan đến y học trong số 300 giống đã được tìm thấy Ngày nay có

khoảng 35 loài liên quan đến y học đã được xác định Trong các loài đó thì C

albicans có độc tính cao nhất và hay gây bệnh ở người Ngoài ra còn có C

tropicalis , C pseudotropicalis, C parakrusei, C krusei, C guillermondi mà

trên lâm sàng cũng hay gặp

Những loài candida thường tạp sinh Nhưng trong điều kiện thuận lợi thì gây bệnh (gây bệnh cơ hội) Vị trí của canbicans trong phân loại dạng nấm men Theo Lodder có 2 loại nấm men là: Men có nang đảm: sinh sản bằng nang đảm (ascus) trong đó điển hình là nấm men saccharomyces Men không có nang đảm: hợp thành họ lớn cryptococcacaae Và nấm candida là một trong những loài thuốc họ cryptococcacea Tất cả các bệnh do nấm candida gây ra thì gọi là bệnh candidose (ngày xưa gọi là bệnh levures,

1.1.2 Đặc điểm của nấm Candida

Candida là một nấm men tồn tại khá phổ biến trong thiên nhiên, kí sinh chủ yếu trên người và súc vật Ngày nay, nấm Candida là một trong những

căn nguyên gây bệnh thường gặp nhất (Hình 1.1)

Hình 1.1 Hình ảnh nấm Candida

- Candida thuộc chi nấm men, họ Cryptococcaceae

- Tồn tại trạng thái đơn bào có nhân chuẩn

- Hình dạng: Là nấm không màu, vách ngăn rộng, hình tròn hoặc hình bầu dục, đôi khi có dạng sợi hoặc vô định hình

- Kích thước dao động từ 3-10 µm , thông thường lớn hơn gấp 10 lần

so với vi khuẩn

- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khi bào từ chồi được sinh ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc gọi là giả sợi nấm

- Khả năng thích nghi với môi trường cao

- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa quả, rau dưa, mật mía

1.2 Các yếu tố thuận lợi dễ nhiễm nấm candida

1.2.1 Yếu tố nội lai

Bệnh nhiễm trùng cấp tính hay mãn tính; Bệnh chuyển hoá: tiểu

đường, mập phì; Thiếu các sinh tố B (B2, B6, PP và C); Sử dụng các kháng sinh có phổ rộng kéo dài; Sử dụng cocticoid kéo dài; Sử dụng các thuốc kháng tế bào (điều trị ung thư); Bệnh đái đường, bỏng, ung thư, nhiễm HIV/AIDS, thai nghén; Sau phẫu thuật thay van tim; Bệnhnhân suy mòn, suy kiệt; Viêm sau lậu;

1.2.2 Yếu tố ngoại lai

Người già, răng rụng hết; Loét do bỏng ở bệnh nhân bỏng; Người hay tiếp xúc với nguồn nước, hoa trái, thực phẩm, công nhân sản xuất bia, thợ giặt ;

1.3 Triệu chứng lâm sàng

1.3.1 Ở nữ giới

Triệu chứng cơ năng: thường không điển hình

Ngứa, đau rát, khí hư màu trắng váng sữa, mùi hôi, bột dính, tiểu buốt Đau khi giao hợp, pH âm đạo thay đổi

Triệu chứng thực thể: Khám từ ngoài vào trong thấy có các triệu chứng

như sau:

Âm hộ: Đỏ phủ toàn bộ hoặc từng đám, bờ giới hạn rõ Môi lớn đỏ, rãnh giữ môi lớn và môi bé phủ dịch tiết trắng đục Làm kỹ thuật lau sạch dịch tiết thấy niêm mạc màu đỏ sẫm, bóng và có bờ không đều nham nhở kèm một lớp viền vảy đỏ bên ngoài

Âm đạo: Thành niêm mạc âm đạo phù nề, xung huyết và có màu đỏ tươi Có dịch màu kem dính như phủ bột ở thành âm đạo, có khi không thấy

rõ do xuất hiện nhiều dịch, đôi khi lẫn mủ Nhưng triệu chứng thường gặp hơn là dịch âm đạo trắng đục và lổn nhổ như váng sữa Cùng đồ sau thường

có nhiều dịch đọng lại giống như cặn sữa pH âm đạo thường dưới 4,5 Mùi dịch bình thường, nghiệm pháp Sniff không có mùi cá ươn

Cổ tử cung: Phù nề, trơn loét, có thể viêm lộ tuyến Cổ tử cung phủ

một lớp màng trắng như màng giả, lấy ra dễ dàng

Khi viêm âm đạo lây lan đến lớp tế bào tuyến cổ trong cổ tử cung, có khả năng sẽ lây lan đến lớp niêm mạc tử cung và vòi trứng Do đó, có khả năng gây viêm nhiễm vùng chậu và tắc vòi trứng gây vô sinh [6]

1.3.2 Ở nam giới

Viêm qui đầu do candida:

Hay gặp ở người có vợ (bạn tình) bị viêm âm đao do nấm men hoặc bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường Tổn thương bắt đầu bằng mụn nước, mụn mủ, khi

vỡ để lại các vết trợt tròn, ban đỏ rải rác hoặc liên kết thành đám màu đỏ tươi, có viền biểu bì, có chất bự trắng, có khi có vảy khô, thường ngứa [11]

Viêm niệu đạo:

Viên niệu đạo cấp do nấm Candida ít gặp Trên lâm sàng triệu chứng gần giống viên niệu đạo do lậu Niệu đạo viêm xuất tiết nhiều dịch mủ, đôi khi có màu kèm đái buốt, đái rắt [6]

1.4 Cơ chế gây bệnh

Bình thường phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ luôn chế tiết nội tiết tố Oestrogen đều đặn Nó có tác dụng kích thích tăng sinh làm dày lớp tế bào biểu mô âm đạo, tạo nhiều glycogen Nhóm vi khuẩn chủ yếu Lactobacilli đã biến đổi glycogen thành acid lactic và acid acetic tạo nên môi trường acetic cân bằng, hằng định với pH = 3,5-4,1 Từ đó, giúp bảo vệ biểu mô âm đạo trước sự tăng trưởng của các vi khuẩn gây bệnh nội sinh Ngoài ra,chúng còn ngăn cản các vi sinh vật ngoại lai xâm nhập từ ngoài vào âm đạo

Candida thuộc vi hệ tuy nhiên có thể bền vững hoặc thoáng qua Bình thường có thể tìm thấy Candida ký sinh ở trên da, trong họng miệng, đường tiêu hóa, âm đạo… mà không gây bệnh, chúng công sinh và cân bằng trong

vi hệ bình thường Candida thực sự gây bệnh cho người khi cơ thể suy giảm miễn dịch và gặp yếu tố thuận lợi [11], [40]

Có nhiều loại Candida, mỗi loại khác nhau có độc tính khác nhau nên khả năng gây bệnh và độ nhảy cảm kháng sinh chống nấm cũng khác nhau [5]

Các loại Candida tồn tại được trong môi trường niêm mạc âm đạo, đầu tiên chúng phải bám dính được vào tế bào biểu mô niêm mạc Sau đó sâm nhập vào tế bào biểu mô âm đạo nhờ men phân hủy protein đặc hiệu do

Candida tiết ra Đối với C.albicans có khả năng bám dính và sâm nhập vào tế

bào biểu mô niêm mạc cao hơn các loài Candida khác Điều này lý giải vì sao

nhiễm Candida âm đạo chủ yếu do loài C albican gây ra [8], [28]

Khi vi nấm xâm nhập – thích nghi – nhân lên - phá hủy - gây bệnh Khả năng đề kháng của cơ thể đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhập trước các tác nhân gây bệnh của nấm Có 2 cơ chế bảo vệ [1], [58]

- Miễn dịch không đặc hiệu: sự tham gia lớp da, niêm mạc, hệ vi sinh vật hội sinh, các tế bào thực bào… Ngoài ra,có sự tham gia các globulin miễm dịch

và bổ thể Những cơ chế này vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại những bệnh do nhiễm nấm cơ hội và những chủng đọc lực yếu

- Miễn dịch đặc hiệu: sự tham giá đám ứng miễn dịch trung gian tế bào

và dịch thể Trong đó, miễn dịch trung gian tế bào có vai trò quan trọng hơn Các tế bào lympho T mẫm cẩm sản sinh các lymphokine hoạt hóa đại thực bào Các đại thực bào được hoạt hóa đóng vai trò quyết định trong việc chống lại nấm gây bệnh Nhiều nghiên cứu miễn dịch học về nấm cho thấy những người có hệ miễn dịch hoạt động tốt bệnh khỏi nhanh,còn người thiếu hụt miễn dịch tế bào thường dai dẳng,dễ tái phát [16]

1.5 Phòng và diệu trị bệnh do nhiễm nấm Candida

1.5.1 Nguyên tắc điều trị

- Loại bỏ các yếu tố thuận lợi

- Điều trị cả bạn tình nếu có quan hệ tinh dục trước đó

- Dùng thuốc kháng nấm,liệu trình điều trị từ 3-7 ngày hoặc liều duy

nhất tùy theo loại thuốc hoặc theo chỉ định cụ thể của bác sĩ điều trị

- Điều trị tái phát(nếu có) hoặc điều trị dự phòng tái phát

1.5.2 Phòng ngừa bệnh nhiễm nấm Candida

Khi đi vệ sinh, nên dùng giấy lau từ trước ra sau để tránh mang các vi khuẩn từ hậu môn lên âm đạo

Không thụt rửa âm đạo nếu chưa có sự đồng ý của bác sĩ vì sẽ làm mất cân bằng môi trường âm đạo - nơi có những vi khuẩn có lợi), mất cân bằng

độ pH của âm đạo, gây nên tình trạng viêm nhiễm

Mặc quần áo rộng rãi, thoải mái, nhất là quần áo lót, không nên mặc quần áo quá dày, quá chật hay ẩm ướt.Thay quần lót thường xuyên, giặt phơi ngoài nắng và ủi cả mặt trong - ngoài trước khi mặc, nên sử dụng đồ lót chất vải cotton, giữ cho môi trường vùng kín được khô, thoáng

Trong thời gian bị bệnh nên tránh giao hợp, nếu có thì cần sử dụng bao cao su để tránh lây bệnh

Giữ trọng lượng cơ thể ổn định tránh béo phì

1.6 Phương pháp phát hiện

1.6.1 Phương pháp soi tươi

Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo, niệu đạo phát hiện nấm men và trùng roi là phương pháp thường quy, được tiến hành ở hầu hết các cơ sở khám chữa bệnh Nấm men và trùng roi là một trong nhiếu nguyên nhân gây tiết dịch âm đạo, âm hộ ở phụ nữ Ở Nam giới có thể gặp trong các trường hợp viêm niệu đạo tái phát và tồn lưu sau điều trị lậu và chlamydia

1.6.2 Phương pháp nuôi cấy

Kết quả soi tươi nhận định nấm men Candida khi hình ảnh soi tươi nhìn thấy sự hiện diện của tế bào nấm men và sợi tơ giả Có nhiều loài

Candida có khả năng gây bệnh nhưng có trên 90% trường hợp là do C

albicans Nên nhiều phương pháp nuôi cấy nhằm phát hiện C albicans đã

được phát triển Nuôi cấy bệnh phẩm trong môi trường Sabouroaud có Chloramphenicol thường được sử dụng nhiều

1.6.3 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR thường được sử dụng để phát hiện nhanh một tác nhân gây bệnh Phương pháp này có thể phát hiện được tác nhân gây bệnh từ các mẫu tươi, mẫu làm giàu và không tốn thời gian Bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu loài, chúng ta có thể phát hiện được Candida Sản phẩm PCR

nếu tiếp tục được cắt bởi enzyme Msp I thì chúng ta có thể phân biệt được

một số loài trong chi Candida [aa]

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm thực hiện

Phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Đối tương nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng

Bệnh nhân viêm âm đạo do nấm Candida đến khám và diều trị tại Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh (Phòng Vi sinh, Khoa Xét nghiệm, bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh) Đồng thời, có chỉ định xét nghiệm trực tiếp tìm nấm dương tính, nuôi cấy, phân lập nấm

Thời gian: tháng 10/2016- tháng 2/2017

2.2.2 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

Bệnh nhân biểu hiện viêm âm đạo và xét nghiệm trực tiếp tìm nấm dương tính

Bệnh nhân nữ, tuổi từ 15 đến 49

Không dùng thuốc kháng nấm trước đó 05 ngày

2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Bệnh nhân biểu hiện viêm niêm mạc âm đạo nhưng xét nghệm nấm âm tính Bệnh nhân đang trong thời kì kinh nguyệt hoặc ra máu

tiếp tìm nấm dương tính tại khoa Vi sinh- Sinh học phân tử- Bệnh viện Sản nhi Quảng Ninh Mẫu được thu trong khoảng thời gian từ tháng 10/2016 đến tháng 2/2017

2.3.2 Trình tự mồi

1 ITS1 5’ tcc gta ggt gaa cct gcg g 3’

2 ITS4 5’ tcc tcc gct tat tga tat gc 3’

2.3.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

2.3.3.1 Hóa chất

- Hóa chất được dung trong vi sinh chuẩn đoán trực tiếp: Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet); Dung dịch Iod (dung dịch Lugol); Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton; Dung dịch nhuộm bổ sung: Safranin hay Fuchsin Ziehl; Nước muối sinh lý; Dung dịch KOH 10- 20%; Dung dịch xanh Lacto- phenol

- Hóa chất được dùng trong nuôi cấy nấm Candida:

- Hóa chất được dùng trong tách chiết DNA và phát hiện nấm Candida bằng kỹ thuật PCR: Các loại hóa chất: Tris.HCl, NaCl, EDTA, agarose; Các loại dung dịch gốc: 100 mg/ml lysozyme, RNase, 100 bp DNA marker, 1 kb DNA marker,Taq PCR polymerase 5U/µl, 2.5 mM dNTP hỗn hợp, phenol, chloroform, isoamylalcohol; Các loại dung dịch sử dụng: 1 M Tris.HCl pH8;

1 M sodium EDTA pH8; 1M sodium phosphate buffer pH8; 3M NaCl; Lysis buffer; TE; 1% RNase; 20 mg/ml proteinase K; Chloroform:isoamylalcohol 24:1; Phenol:Chloroform:isoamylalcohol 25: 24:1; 10% SDS; Gel agarose 0,8% và 1,7%, Ethanol 70% và ethanol 96%

2.3.3.2 Các dụng cụ nghiên cứu

Lam kính, lamen sạch, Pipet nhỏ giọt Que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm Bút chì kính, phiến kính Kính hiển vi Đồng hồ bấm giờ Chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết khác

Eppendorf các loại (0,5 ml; 1,5 ml và 2 ml), đầu côn các loại (10 µl,

100 µl, 200 µl, 1000 µl), khay để eppendorf

2.3.3.3 Các thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài: Máy lắc 37°C – Gyromax 737R (Amerex), Máy ly tâm ống Eppendorf (Thermoscientific), Máy điện di DNA (Bio-Rad), Máy soi tia UV (Vilber Laurmat), Máy ổn nhiệt (Implen GmbH), Bộ Pipetman gồm các loại 10, 200, 1000 µl (Gilson)

2.3.4 Các loại môi trường sử dụng

Môi trường Sabouraud có đường: Pepton: 10 g, Glucose hoặc maltose:

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp soi vi sinh chẩn đoán trực tiếp

2.4.1.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp

chỉ định xét nghiệm (barcode, tên, tuổi, địa chỉ, khoa, phòng…)

Bước 2: Nhỏ Nacl 0,9 % lên lam kính, hòa bệnh phẩm vào giọt dung dịch đến khi đục

Bước 3: Dùng lá kính sạch đậy trên giọt dung dịch

Bước 4: Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 10X-40X

Nhận định kết quả:

Dương tính:

- Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục kích thước 3- 5µm nảy chồi hoặc không

- Tế bào nấm men có quầng sáng bao quanh khi làm tiêu bản mực tàu

- Sợi nấm giả (Sợi nhánh được tạo thành từ các chỗ thắt)

- Nấm sợi có vách ngăn (sợi nhánh được tách ra cách vách ngăn)

Âm tính:

- Không quan sát thấy nấm

2.4.1.2 Kỹ thuật nhuộm soi tiêu bản Gram

Nguyên lý:

Đánh giá hình thể, kích thước, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) bằng kỹ thuật nhuộm và soi dưới kính hiển vi quang học

- 2 phút, rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ

Bước 4: Nhỏ dung dịch lugol, để 30 giây Đổ dung dịch lugol, rửa nước

Bước 5: Tẩy màu: nhỏ vài giọt cồn 95% lên tiêu bản, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia Khi thấy màu tím trên lam kính vừa phai hết thì rửa nước ngay

Bước 6: Nhỏ dung dịch đỏ fuchsin, để 1 - 2 phút Rửa nước kỹ, để khô tiêu bản

Bước 7: Soi và quan sát kính hiển vi vật kính 100X

Nhận định kết quả:

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm của gentian

Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ của fuchsin

Hình 2.1: Quy trình nhuộm Gram

2.4.2 Phương pháp nuôi cấy

Nguyên lý:

Vi nấm được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên

Aspergillus màu sắc khuẩn lạc khác nhau

P marneffei: sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào môi trường khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng

- Quan sát kính hiển vi sau cấy: Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục (đối với nấm Candida), nẩy chồi hoặc không; Cryptococcus thường hình tròn, kích thước lớn

- Kết quả:

+ Đọc kết quả loài nấm theo kết quả định danh

+ Không thấy khuẩn lạc mọc sau 4 ngày trả kết quả sơ bộ: Âm tính

- Các đĩa cấy được bỏ sau 7 ngày nuôi cấy

2.4.3 Phương pháp tách chiết DNA hệ gen của nấm

2.4.3.1 Tách chiết DNA hệ gen của nấm

Nguyên lý:

Vỏ tế bào cần được phá hủy để bộc lộ DNA hệ gen Các phần DNA hệ gen, protein, xác tế bào và các chất khác được kết tủa và phân ly vào các pha dung dịch nhờ ly tâm Dung dịch chứa DNA hệ gen được thu lại và DNA hệ gen của nấm được thu lại bằng cách tủa với ethanol

Các bước tiến hành:

Dùng que cấy gạt lớp tế bào nấm cho vào eppendorf 2 ml chứa 0,5 ml lysis buffer, nhúng que cấy vài lần trong dung dịch để tế bào nấm men rơi vào trong dung dịch

Bổ sung 25 µl 100 mg/ml lysozyme và 10 µl 1% RNase vào mỗi mẫu,

ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 37oC trong thời gian 60 phút

Thêm 10 µl 20 mg/ml proteinase K và 55 µl 10% SDS (nồng độ cuối đạt 1%) vào mỗi mẫu, ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 37oC trong thời gian 30 phút Thêm 500 µl TE vào mỗi mẫu, ủ hỗn hợp dung dịch tế bào ở 65oC trong thời gian 120 phút

Li tâm hỗn hợp dung dịch tế bào 13000 vòng/phút, 10 phút Thu 1000

µl pha trên, bổ sung 1000 µl Phenol:Chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), lắc đều hỗn hợp

Li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút Thu 900 µl pha trên, bổ sung 900 µl