Khảo sát hoạt tính biến tính tinh bột gạo của enzyme phân nhánh tái tổ hợp trong bacillus subtilis p2

28 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu nghiên cứu 2 1 1 Vật liệu Plasmid BBE (Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc) Bacillus subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) được sử dụng làm chủng biểu hiện cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên ĐHQG TpHCM Thang protein Hình 2 1 Thang chuẩn Promega 10 225 kDa 2 1 2 Dụng cụ thiết bị 2 1 2 1 Dụng cụ HisTrapTMFF (GE Healthcare) Hình 2 2 Cột sắc ký ái lực Ni NTA (GE Healthcare).

CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu - Plasmid BBE (Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc) - Bacillus subtilis 1012 (leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1) sử dụng làm chủng biểu cung cấp Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên- ĐHQG TpHCM - Thang protein Hình 2.1 Thang chuẩn Promega 10-225 kDa 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 2.1.2.1 Dụng cụ - HisTrapTMFF (GE Healthcare) Hình 2.2 Cợt sắc ký lực Ni-NTA (GE Healthcare) 28 - Màng lọc 0.45µm (Whatman) - Màng lọc 0,47 µm (MS) - Màng thẩm tích 12 MWCO (Spectrum Laboratries) - Erlen, beaker, ống nghiệm - Đèn cồn - Eppendorf 1,5 mL; 2,0 mL - Falcon 15 mL - Bộ micropipette đơn kênh (Micropipette Nexty Single Chanel Pipetter, Watson-Nhật) 2.1.2.2 Thiết bị - Máy ly tâm lạnh (Hettich, Đức) - Máy ly tâm lạnh (SER 148/3 F30300240, Ý) - Máy vortex (Velp, Ý) - Máy đo quang phổ (Cary 50) - Máy khuấy từ (IKA, Đức) - Máy phá mẫu sóng siêu âm (Q500-Qsonica, Mỹ) - Cân phân tích (Kern ABJ 220-4NM, Đức) - Cân phân tích (SJ 220CE-Vibra, Nhật Bản) - Máy đo pH (Adwai Instruments, Hungary) - Nồi hấp tiệt trùng (ALP, Nhật Bản) - Máy lắc ổn nhiệt - Tủ lạnh -20 ºC, 4ºC 29 - Tủ cấy vô trùng 2.1.3 Hóa chất 2.1.3.1 Hóa chất biến nạp * Tạo tế bào B subtilis 1012 khả nạp - Dung dịch CaCl2 100 mM vô trùng (giữ ºC) - Dung dịch glycerol 100% vô trùng (giữ ºC) - Dung dịch EGTA 0,1M, pha nước cất vô trùng giữ ºC * Cảm ứng biểu protein B subtilis 1012 - Dung dịch IGPT, pha nước cất khử trùng giữ ºC 2.1.3.2 Hóa chất điện di - Dung dịch đệm điện di: Tris 40 g, Glycine 45,5 g lít nước - Acrylamide mix (29:1) - SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - TEMED (N,N,N’,N’- tetramethyl ethylen ediamine) - APS (Amonium persulfate) - Tris- HCl (pH 8,8) Tris- HCl (pH 6,8) - Thang protein chuẩn BioLab - Comassie blue R-250 Stain - SDS- loading buffer 5X: 200mM Tris- HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% glycerol, 0,4% bromophenol blue, 200mM DTT (Dithiolthreitol) - Dung dịch điện di 10X: 140 g Glycine, 30g Tris- HCl, 10 g SDS, thêm dH2O vừa đủ lít Pha lỗng 10 lần trước dùng 30 - Dung dịch nhuộm: 0,625 g comassive brilliant blue, 112,5 mL ethanol 99%, 25 mL glacial acetic acid, thêm H2O vừa đủ lít - Dung dịch giải nḥm: 75 mL acid acetic, 100 mL ethanol, thêm H2O đến lít Thành phần thể Bảng 2.1 Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylmaide Thành phần Gel gom Gel phân tích Nước 2115,4 µl 2307,7 µl Acrylamide mix 461,5 µl 2769,2 µl Tris 0,5 M (pH 6,8) 746,2 µl Tris 1,5 M (pH 8,8) 1730,8 µl SDS 10% 34,6 µl 69,2 µl APS 10% 23,1 µl 46,2 µl TEMED 3,46 µl 3,46 µl 2.1.3.3 Hóa chất tinh chế protein Bảng 2.2 Thành phần buffer dùng tinh chế protein Nồng độ Hóa chất Binding buffer Washing buffer Elution buffer Tris-Cl (pH 8,0) 50 mM 50 mM 50 mM Imidazole mM 20 mM 300 mM NaCl 100 mM 100 mM 50 mM EDTA 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM PMSF mM mM mM 31 2.1.3.4 Hóa chất định lượng đường khử - 0,016 M sodium acetate, pH 4,8 - 2,0 N sodium hydroxide - Thuốc thử Dinitrosalicylic acid Chuẩn bị cách hòa g 3,5-dinitrosalicylic acid 50 mL nước cất Thêm thật chậm 30 g sodium potassium tartrate tetrahydrate, dung dịch có màu vàng đục Thêm 20 ml 2,0 N sodium hydroxide, dung dịch chuyển sang màu vàng cam suốt Định mức đến 100 mL nước cất Tránh tiếp xúc với carbon dioxide bảo quản không tuần chai tối màu - 1% Tinh bột: g tinh bột 100 mL 0,016 M đệm sodium acetate pH 4,8 Đun nóng kh́y đến tan, sau làm ng̣i - Dung dịch maltose chuẩn (5 µM/mL): 180 mg maltose (MW 360,3) 100 mL nước cất 2.1.3.4 Hóa chất khác - Kanamycin 50 mg/mL, pha nước cất vô trùng bảo quản -20 ºC - Dung dịch IPTG, pha nước cất vô trùng bảo quản -20 ºC 2.1.4 Môi trường - Môi trường LB (Luria - Bertami): 10 g trypton, g yeast extract (cao nấm men), g NaCl, dH2O vừa đủ lít - Mơi trường LB - Agar: thành phần LB lỏng, bổ sung 2% agar - Môi trường LB - Kana: mơi trường LB có bổ sung Ampicillin nồng đợ cuối 50 µg/mL - Mơi trường LB - Agar - Kana: mơi trường LB - Agar có bổ sung Ampicillin nồng đợ cuối 50 µg/mL 32 Các môi trường hấp khử trùng 121 ºC, 20 phút Sau bổ sung kháng sinh vơ trùng để đạt nồng đợ thích hợp - 10X S - Base (Spizizen’s salt): g (NH4)2SO4, 14 g K2HPO4, g KH2PO4, g sodium citrate, thêm dH2O đủ 100 mL, hấp khử trùng Bổ sung 0,1 mL MgSO4 1M vô trùng sau hấp - Môi trường HS (High salt medium): 10 mL 10X S - Base, 2,5 mL glucose 40%, mL L - tryptophan 0,1%, mL casein 2%, mL yeast extract 10%, 10 mL arginine 8% histidine 0,4%, thêm dH2O đủ 100 mL - Môi trường LS (Low salt medium): 10 mL 10X S – Base, 2,5 mL glucose 20%, 0,5 mL L - tryptophan 0,1%, 0,5 mL casein 2%, mL yeast extract 10%, 0,25 mL MgCl2 M, 0,05 mL CaCl2 M, thêm dH2O đủ 100 mL Tất thành phần pha HS LS hấp khử trùng 121 ºC, 20 phút trước pha môi trường, amino acid pha nước cất khử trùng 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý cấu trúc phân tử tinh bột gạo - Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận tinh enzyme phân nhánh: + Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis + Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp + Thu nhận tinh enzyme phân nhánh sắc ký lực với Ni-NTA resin - Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới điều kiện khác nhau: + Khảo sát ảnh hưởng pH; 33 + Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ; + Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột gạo; + Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme; + Khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân Trong thí nghiệm khảo sát, hiệu biến tính đánh giá thơng qua chỉ tiêu DE Trong sản phẩm thí nghiệm cuối cùng, cấu trúc tinh bợt biến tính đánh giá so sánh với cấu trúc tinh bột ban đầu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nội dung 1: Phân tích tính chất hoá lý cấu trúc phân tử tinh bột gạo - Các mẫu gạo lấy từ: Công ty Lương thực Tiền Giang - Giống gạo sử dụng thí nghiệm IR50404 (tên thương mại gạo 504) Đây giống gạo sử dụng sở bánh bún, hủ tiếu thuộc làng nghề bánh bún, hủ tiếu xã Mỹ Phong, Tp Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang (loại gạo làm cám) Gạo thu về, tiến hành nghiền thành bột sở sản xuất - Các chỉ tiêu phân tích: + Phân tích tính chất hóa lý, bao gồm: i) Xác định đợ hịa tan bợt gạo nước; ii) Đánh giá độ nhớt dung dịch bột gạo nhớt kế; iii) Khả tạo gel; iv) Tốc đợ thối hố bảo quản gel (hồ) tinh bợt: theo phương pháp Singh et al (2004); + Phân tích cấu trúc phân tử tinh bợt gạo: 34 i) Hàm lượng amylose: xác định cách đo màu bột tạo phức với iodine theo phương pháp chuẩn Juliano cợng (1971, có điều chỉnh); ii) Cấu trúc phân tử: phân tích sắc ký trao đổi ion với hệ thống sắc ký lỏng cao áp (C18) Để phân tích cấu trúc mạch tinh bợt (chiều dài mạch tỉ lệ nhánh) bột bợt sau biến tính, sử dụng HPLC với quy trình sau: + mL mẫu xử lý với enzyme isoamylase (25 mM; 0,36 U/mg) dung dịch đệm acetate (pH 4,3) 60oC, 48 + Dừng phản ứng cách đun sôi dung dịch 10 phút + Sau mang ly tâm với tốc đợ 12.000 vòng/phút 10 phút Mẫu sau ly tâm lọc màng lọc 0,45m (Millex, Millipore, Bedford, MA, USA) + Cấu trúc chuỗi phân tích HPAEC (high-performance anion-exchange chromatography), hệ thống (Dionex-300, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) đồng bợ với đầu dị điện tử (ED40, Dionex) Cột trao đổi ion CarboPacTM PA1(250 x mm, Dionex) cột bảo vệ sử dụng để tách riêng mẫu gắn thêm nhánh + Sau cột cân NaOH 150 mM, mẫu rửa giải nhiều lần với hệ dung dịch sodium acetate 600 mM NaOH 150 mM, tốc độ mL/phút Tốc độ thay đổi nồng độ sodium acetate sau: 10 - 30% - 10 phút, 30 - 40% 10 - 16 phút, 40 - 50% 16 - 27 phút, 50 - 60% 27 - 44 phút 60 64% 44 - 60 phút 2.3.2 Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận tinh enzyme phân nhánh Đề tài kế thừa: có sẵn plasmid sinh enzyme phân nhánh cho chất tinh bột vi sinh vật nuôi cấy: sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis (Các nội dung chọn dòng, biến nạp plasmid vào vi khuẩn, nuôi cấy thu nhận enzyme đã tác giả Lê Quang 35 Trí [40] nghiên cứu, khơng bố trí thí nghiệm, chỉ thực quy trình để nhận vi khuẩn mang plasmid cần enzyme thô đủ số lượng cho nội dung sau) 2.3.2.1 Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis - Chuẩn bị tế bào khả nạp B subtilis: + Cấy khuẩn lạc B subtilis vào mL môi trường HS, lắc 37oC, qua đêm + Cấy truyền sang 55 mL môi trường HS cho giá trị OD600 cuối đạt 0,1, lắc 250 vòng/phút 37oC + Tiến hành dựng đường cong tăng trưởng + Khi tăng trưởng bắt đầu vào pha cân bằng, thu 10 mL dịch nuôi cấy (mỗi lần thu cách 15 phút) cho vào mL glycerol (100%), huyền phù giữ đá 15 phút Sau chia vào eppendorf mL dịch, bảo quản -800C + Các phân đoạn tế bào khả nạp cho biến nạp vào plasmid để chọn phân đoạn cho hiệu suất biến nạp cao nhất - Biến nạp plasmid vào tế bào B subtilis: + Lắc nhẹ mL tế bào khả nạp 10 mL LS, tốc đợ lắc 60 vịng/phút 300C + Bổ sung 100 µl EGTA, ủ 10 phút nhiệt đợ phịng + Chia mL dịch ni cấy vào eppendorf chứa 10 µg plasmid, lắc 250 vịng/phút 370C + Ly tâm 9.000 vòng/phút, bỏ phần dịch nổi, huyền phù sinh khối với phần dịch lại, trải dịch huyền phù đĩa LB-Agar-Kana + Ủ 370C, qua đêm 36 2.3.2.2 Thu nhận tinh enzyme phân nhánh - Sau trình biến nạp ni cấy vi khuẩn điều kiện thích hợp để tạo enzyme phân nhánh Tiến hành phá vỡ tế bào thu nhận enzyme thô - Tinh enzyme thô Theo kết nghiên cứu, enzyme phân nhánh có trọng lượng phân tử 74 KDa - Quy trình ni cấy biểu enzyme với tổng thể tích lên men L: + Chủng B subtilis hoạt hóa 15 mL mơi trường LB chứa Kanamycin nồng đợ 50 µg/mL, ni cấy lắc 250 rpm, 370C qua đêm + Tiếp tục hoạt hóa thứ cấp từ dịch hoạt hóa sơ cấp 50 mL mơi trường LB Kana, nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C 16 - 18 + Đo OD600 chuyển dịch nuôi cấy sang L môi trường LB - Kana, cho OD đạt 0,1 Nuôi cấy lắc 250 rpm, 370C dịch nuôi cấy đạt giá trị OD600 khoảng 0,8 - 1,0; tiến hành cảm ứng với nồng độ 0,5 mM IPTG thời gian cảm ứng điều kiện lắc 37 ºC + Tiến hành thu tổng sinh khối vào thời điểm khảo sát + Bảo quản sinh khối -800C - Quy trình tinh chế: + Sinh khối B subtilis thu sau nuôi cấy cảm ứng biểu trước huyền phù dung dịch Binding buffer, bổ sung 20 µg/mL Dnase I mM PMSF Huyền phù sinh khối + Phá tế bào sống siêu âm Chu trình phá tế bào gồm biên đợ sóng 70 10 giây, nghỉ 25 giây, chu kỳ, thực đá lạnh + Tiến hành ly tâm 13.000 rpm, 30 phút, 40C, thực lần, thu nhận phần dịch chứa enzyme dạng tan 37 + Phần dịch lọc qua màng lọc 0,22 µm + Phần dịch sau lọc cho chảy qua cột Histrap HP (GE healthcare) cân với dung dịch Binding buffer; enzyme có His-tag bám lên cột + Rửa enzyme bám không đặc hiệu 100 mL dung dịch rửa chứa nM Imidazole + Enzyme mục tiêu dung ly khỏi cột dung dịch dung ly chứa Imidazole với nồng độ tăng dần từ 10, 40, 100 250 nM, thu với nhiều phân đoạn + Kiểm tra phân đoạn enzyme phương pháp SDS-PAGE + Sau có kết điện di, thu nhận enzyme phân đoạn có protein mục tiêu tinh tiến hành thẩm tách dung dịch bảo quản (50mM Tris pH 7,5, 1mM PMSF), đo nồng độ enzyme bảo quản -200C 2.3.3 Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính enzyme phân nhánh tinh bột gạo nhiều điều kiện khác 2.3.3.1 Nguyên lý Enzyme phân nhánh xúc tác thủy phân liên kết α-1-4-glycosidic amylose tạo dextrin amylose mạch ngắn, song song xúc tác tạo liên kết α-1-6-glycosidic với dextrin amylose lại Kết tạo glucan phân nhánh Đồng thời enzyme phân nhánh xúc tác thủy phân amylopectin liên kết α-1-4-glycosidic mạch, tạo bó amylopectin Như sau giai đoạn thu bột gạo biến tính với hàm lượng amylose thấp bó amylopectin có trọng lượng thấp 2.3.3.2 Bố trí thí nghiệm Bố trí thí nghiệm thích hợp q trình biến tính bợt gạo enzyme phân nhánh: Thơng thường, thông số nhiệt độ pH thuộc chất enzyme, đó, cần khảo sát thơng số trước chỉ cần khảo sát biến Sau tìm thơng số nhiệt đợ pH thích hợp, tiếp tục khảo sát tiếp thông số nồng độ bột gạo nồng độ enzyme; cuối cùng, khảo sát thời gian phản ứng 38 a Thí nghiệm khảo sát pH thích hợp cho phản ứng enzyme Bảng 2.3 Thơng số thí nghiệm a Thơng số khảo sát Giá trị pH phản ứng enzyme 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 Thông số cố định Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột 5% (w/w) Lượng enzymm sử sụng 25 U/g Nhiệt độ enzyme 60OC Thời gian ủ - Số lần lặp lại: lần → Hàm mục tiêu: Chỉ số DE tinh bột gạo - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bột gạo Hồ hóa Hạ nhiệt Ủ enzyme pH5.0 … pH5.5 Đánh giá mẫu Chọn pH 39 pH7.0 - Cách thực hiện: + Hịa tan bợt gạo dung dịch đệm pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 hồ hóa 100 mL huyền phù bợt nồng đợ 5% (w/w) (có kh́y trợn) 15 phút 60℃ + Làm nguội hồ tinh bột xuống 600C cho dịch enzyme α-amylase 25 U/g vào ủ 600C trong bể điều nhiệt có rung lắc + Sau cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột ủ với enzyme để kết tủa tinh bột Tách kết tủa cách ly tâm 6000 vòng 20 phút Tinh bột rửa lại lần nước cất tách cách ly tâm Tinh bợt biến tính enzyme sấy đối lưu 500C 24 Mẫu bột gạo đối chứng tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa sấy khô mẫu mẫu khảo sát (độ ẩm mẫu sau sấy khô vào khoảng 12 ± 0,5%) Sau tiến hành nghiền mịn Bợt gạo sau biến tính sử dụng cho bước nhằm xác định DE b Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzyme phân nhánh Bảng 2.4 Thơng số thí nghiệm b Thơng số khảo sát Nhiệt độ ủ enzyme Giá trị 50oC; 55oC; 60oC; 65oC; 70oC; 75oC; 80oC Thông số cố định Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột có nồng đợ 5% (w/w) Lượng enzyme sử sụng 25 U/g pH phản ứng enzyme Kết thí nghiệm a Thời gian ủ - Số lần lặp lại: lần → Hàm mục tiêu: Chỉ số DE tinh bột gạo - Cách thực hiện: + Hồ hóa 100 mL huyền phù bợt nồng đợ 5% (w/w) (đệm pH thích hợp thí nghiệm a) (có kh́y trộn) 15 phút 40 + Cho dịch hồ tinh bột vào bể ổn nhiệt, cho dịch enzyme phân nhánh 25 U/mẫu ủ nhiệt độ 50, 55, 60, 65, 70, 75, 800C trong bể điều nhiệt có rung lắc + Sau cho 300 mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột ủ với enzyme để kết tủa tinh bột Tách kết tủa cách ly tâm 6000 vòng 20 phút + Bột rửa lại lần nước cất tách cách ly tâm Bợt biến tính enzyme sấy đối lưu 500C 24 Mẫu bột đối chứng tiến hành hồ hóa, kết tủa, rửa tủa sấy khô mẫu mẫu khảo sát (độ ẩm mẫu sau sấy khô vào khoảng 12 ± 0,5%) Sau tiến hành nghiền mịn Bợt gạo sau biến tính sử dụng cho bước nhằm xác định DE - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bột gạo Hồ hóa Hạ nhiệt Ủ enzyme 50oC … 55oC Đánh giá mẫu Chọn nhiệt độ 41 80oC c Thí nghiệm khảo sát nồng độ bột gạo thích hợp cho phản ứng enzyme Bảng 2.5 Thông số thí nghiệm c Thơng số khảo sát Giá trị Nồng độ dung dịch hồ tinh bột 1%; 3%; 5%; 7%, 10% (w/w) Thông số cố định Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bột Lượng enzymm sử sụng 25 U/g pH phản ứng enzyme Kết thí nghiệm a Nhiệt đợ ủ enzyme Kết thí nghiệm b Thời gian ủ - Số lần lặp lại: lần → Hàm mục tiêu: Chỉ số DE tinh bợt gạo - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bột gạo 1% 3% 5% Hồ hóa Hạ nhiệt Ủ enzyme Đánh giá mẫu Chọn nồng độ bột 42 7% 10 % - Cách thực hiện: + Hồ hóa 100 mL huyền phù bợt với nồng đợ khác 1%, 3%, 5%, 7%, 10% (w/w), (có khuấy trộn) 15 phút + Các bước thực tương tự thí nghiệm a d Thí nghiệm khảo sát nồng độ enzyme phân nhánh thích hợp cho phản ứng Bảng 2.6 Thơng số thí nghiệm d Thơng số khảo sát Giá trị Nồng độ enzyme 15 U; 20 U; 25 U; 30 U, 35 U Thông số cố định Lượng mẫu sử dụng 100 mL dung dịch hồ tinh bợt có nồng đợ kết chọn từ thí nghiệm c pH phản ứng enzyme Kết thí nghiệm a Nhiệt đợ ủ enzyme Kết thí nghiệm b Thời gian ủ - Số lần lặp lại lần → Hàm mục tiêu: Chỉ số DE tinh bột gạo 43 - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bột gạo Hồ hóa Hạ nhiệt Ủ enzyme 15U 20U 25U 30U 35U Đánh giá mẫu - Cách thực hiện: Chọn nờng độ enzyme + Hồ hóa 100 mL huyền phù bợt gạo có nồng đợ kết chọn từ thí nghiệm c, (có kh́y trợn) 15 phút + Làm nguội hồ tinh bột xuống nhiệt đợ thích hợp cho dịch enzyme phân nhánh mức sơ đồ bố trí thí nghiệm, ủ nhiệt đợ pH thích hợp trong bể điều nhiệt có rung lắc + Các bước thực tương tự thí nghiệm a 44 e Thí nghiệm khảo sát thời gian thủy phân thích hợp phản ứng enzyme Bảng 2.7 Thơng số thí nghiệm e Thơng số khảo sát Thời gian ủ Giá trị 0,5 giờ; giờ; giờ; giờ; 18 giờ; 24 Thông số cố định Lượng mẫu sử dụng 100mL dung dịch hồ tinh bợt có nồng đợ kết chọn từ thí nghiệm c pH phản ứng enzyme Kết thí nghiệm a Nhiệt đợ ủ enzyme Kết thí nghiệm b Nồng đợ enzyme Kết thí nghiệm d - Số lần lặp lại lần → Hàm mục tiêu: Chỉ số DE tinh bột gạo - Cách thực hiện: + Hồ hóa 100mL huyền phù bợt gạo có nồng đợ kết chọn từ thí nghiệm c, (có kh́y trộn) 15 phút + Làm nguội hồ bột xuống nhiệt đợ thích hợp cho dịch enzyme phân nhánh với nồng đợ thích hợp trên, ủ 0,5; 3; 6; 9; 18; 24 bể điều nhiệt có rung lắc + Sau thời gian ủ, cho 300mL ethanol 960 vào dịch hồ tinh bột ủ với enzyme để kết tủa tinh bột Tách kết tủa cách ly tâm 6000 vòng 20 phút + Các bước thực tương tự thí nghiệm a 45 - Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Bợt gạo Hồ hóa Hạ nhiệt Ủ enzyme 0,5 giờ giờ giờ giờ 18 giờ 24 giờ Đánh giá mẫu Chọn thời gian 2.3.3.3 Chỉ tiêu đánh giá Phương pháp xác định chỉ số DE (Dextrose Equivalent) Chỉ số DE tỷ lệ hàm lượng đường khử/tổng lượng chất khô dung dịch, DE tối đa đạt 100 Hút 1mL dung dịch hồ tinh bợt biến tính vào ống nghiệm, bổ sung mL dịch enzyme (5 U/ml) α-amylase, thủy phân 20 phút 37 ºC bể điều nhiệt có rung lắc để α-amylase phân cắt tinh bột tạo đường khử Dung dịch sau phản ứng đem xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp Miller Nếu tinh bột ban đầu 46 biến tính nhiều DE thấp α-amylase không ưu tiên phân cắt tinh bột phân nhánh Phương pháp định lượng đường khử theo phương pháp Miller + Nguyên tắc: phương pháp dựa phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid 3,5-Dinitrosalisylic (DNS) có khả hấp thụ bước sóng 540 575 nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa vào đồ thị chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử (ĐK) mẫu cần khảo sát + Hóa chất: • Thuốc thử acid Dinitrosalisylic (DNS) 1%: ✓ Cân g NaOH tinh thể hòa vào 30mL nước cất dung dịch NaOH (dung dịch A) ✓ Cân xác 1g DNS pha tan dung dịch A bếp ổn nhiệt 70oC ✓ Cân 30 g muối Natri-Kali tartrate kép (muối Seignet) pha tan 50 mL nước cất, đun khuấy bếp ổn nhiệt 70oC (dung dịch B) ✓ Trộn hai dung dịch A B lại với nhau, thêm nước cất định mức đủ 100 mL (thuốc thử DNS giữ chai nâu tránh ánh sáng) • Dung dịch glucose mẫu có nồng đợ 0,5 mg/mL: cân xác 0,05 g Dglucose pha 100 mL nước cất + Cách tiến hành: • Dựng đường chuẩn với dung dịch glucose: pha glucose nước với nồng độ khác nhau: 0,02 %; 0,04%; 0,06%; 0,08%; 0,1% • Cho mL dung dịch chuẩn vừa pha vào mL dung dịch DNS, đun sôi cách thủy phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt đợ phịng, sau đo đợ hấp thu 47 máy quang phổ bước sóng 575 nm Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung mật đợ quang (OD), trục hồnh nồng đợ glucose • Tiến hành tương tự với dung dịch glucose Lấy 1mL dung dịch mẫu có chứa đường khử, thêm vào mL thuốc thử DNS Đun sôi cách thủy vịng phút Làm lạnh nhanh nhiệt đợ phịng Đo đợ hấp thu bước sóng 575 nm • Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định nồng đợ đường khử có dung dịch bợt theo thời gian thủy phân enzyme amylase 48 ... 3: Khảo sát hoạt tính enzyme phân nhánh đối với tinh bột gạo dưới điều kiện khác nhau: + Khảo sát ảnh hưởng pH; 33 + Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ; + Khảo sát ảnh hưởng nồng độ bột gạo; + Khảo. .. enzyme phân nhánh: + Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis + Nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis tái tổ hợp + Thu nhận tinh enzyme phân nhánh sắc... 1: Phân tích tính chất hố lý cấu trúc phân tử tinh bột gạo - Nội dung 2: Biến nạp plasmid mang gen mã hóa cho enzyme phân nhánh vào vi khuẩn Bacillus subtilis; biểu hiện, thu nhận tinh enzyme