Luận án sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α – amylase tái tổ hợp trong bacillus subtilis

1 MỞ ĐẦU Protein sản phẩm gene, đƣợc sử dụng nhiều lĩnh vực đời sống đặc biệt công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh tồn hai dạng protein nội bào (intracellular) protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức chúng Protein sản phẩm quan trọng công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu tế bào chủng chủ Eucaryote Procaryote Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt tăng cƣờng trình biểu protein đƣợc mức độ cao Tuy nhiên, protein tế bào lớn tạo áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ Tăng trình tiết protein ngoại bào giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả biểu protein tái tổ hợp Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết môi tƣờng theo nhiều chế khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố có vai trị trình tự peptide tín hiệu Xây dựng hệ thống biểu tốt tăng cƣờng khả tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu sản xuất, sản phẩm đƣợc tạo nhiều hơn, giảm giá thành để ứng dụng sản xuất đời sống đƣợc quan tâm nghiên cứu Amylase protein - enzyme tái tổ hợp đƣợc thu nhận Thị trƣờng tiêu thụ enzyme giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) ngành cơng nghiệp khác (56%) Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme toàn giới Vai trò ứng dụng amylase đặc biệt α-amylase đƣợc biết đến nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm cơng nghiệp hóa học, lâm sàng, y học phân tích hóa học… nhu cầu amylase nói chung α-amylase nói riêng khơng ngừng tăng lên Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt nhiều nhóm nhƣ vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều chủng thuộc nhóm Bacillus chúng có khả tiết protein có α-amylase ngồi mơi trƣờng đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men Hoạt tính enzyme tiết ngồi mơi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu khối lƣợng phân tử enzyme Sử dụng kỹ thuật gen để sâu nghiên cứu cấu trúc chế tiết enzyme ngồi mơi trƣờng nhƣ tạo đột biến trình tự peptide tín hiệu tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả tăng cƣờng biểu hoạt tính α–amylase Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu enzyme có hiệu Bacillus dựa sàng lọc peptide tín hiệu gen α-amylase từ chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập Việt Nam, lựa chọn đề tài: “Sàng lọc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến điểm peptide tín hiệu đến khả tiết α-amylase tái tổ hợp Bacillus subtilis” Mục tiêu nghiên cứu: - Có đƣợc sở dự liệu trình tự peptide tín hiệu gene α–amylase từ chủng thuộc chi Bacillus - Tạo đƣợc hệ biểu mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả tiết α-amylase ngoại bào chủng Bacillus tái tổ hợp Nội dung luận án: - Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus có khả sinh α-amylase ngoại bào cao - Tách trình tự peptide tín hiệu gen α-amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến thay peptide tín hiệu đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo chủng tái tổ hợp với peptide tín hiệu đột biến sàng lọc chủng có khả tiết α-amylase cao - Nghiên cứu điều kiện biểu α-amylase chủng tái tổ hợp thu đƣợc Những đóng góp luận án - Đã xác định đƣợc liệu khoa học peptide tín hiệu gen α amylase từ chủng điển hình số 130 chủng Bacillus phân lập Việt Nam - Tạo đƣợc đột biến điểm xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết α - amylase Bacillus subtilis CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 1.1.1 Quá trình tiết protein tế bào Eucaryotes Các preprotein hình thành nấm men có hai đƣờng vận chuyển đƣờng qua SRP trung gian đƣờng độc lập khác Vận chuyển protein qua SRP trung gian chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển protein S cerevisiae xuất polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63, protein phát thêm gần Protein Sec61 có số trình tự kỵ nƣớc liên kết với ER liên kết trực tiếp với protein tiết trình vận chuyển, tƣơng tự nhƣ TRAM tế bào động vật có vú nhƣng trình tự Sec61 khơng có điểm tƣơng đồng với TRAM mà chúng lại có số điểm tƣơng đồng với protein SecY E coli (Simonen & Palva, 1993) Trong suốt sau vận chuyển protein tế bào động vật có vú S cerevisiae, peptide tín hiệu đƣợc loại SPase Hai phức hợp chuỗi enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) động vật có vú nấm men có tƣơng đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991) Trong khoang lƣới nội chất ER tế bào nấm men động vật có vú có BiP (Binding immunoglobulin protein), loại protein đóng vai trị quan trọng trình gấp cuộn protein tiết BiP S cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein bƣớc sớm trình vận chuyển protein qua màng BiP cần thiết cho sinh trƣởng tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993) 1.1.2 Quá trình tiết protein E coli Trong E coli, khoảng 50% protein tế bào đƣợc tiết ngồi mơi trƣờng với 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013) Các SP đƣợc cho hỗ trợ liên kết với nhân tố tham gia trình tiết nhƣ: SecB, GroEL, DnaK DnaJ SecB đóng vai trị nhân tố Liên kết SecB ngăn preprotein gấp cuộn chƣa thể chức GroEL, DnaK, DnaJ cịn có số chức khác tế bào E coli ngồi vai trị trình tiết protein Phức hợp preprotein với nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế bào lực SecA với SP SecB SecA protein màng ngoại vi có lực với phần protein trƣởng thành preprotein (Simonen & Palva, 1993) Ngồi chức vận chuyển, SecA cịn tham gia liên kết thủy phân ATP nhằm cung cấp lƣợng cho trình chuyển vận qua màng Một số protein màng SecY, SecE với SecA hình thành nên hệ vận chuyển E coli Chuỗi polypeptide trƣợt qua màng tế bào bề mặt phức hợp SecY/E Phần xúc tác enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm phía bào chất q trình phân cắt SP xảy sau trình vận chuyển Chức protein SecD SecF màng chƣa đƣợc biết rõ, nhiên chúng đóng vai trị việc hỗ trợ trình gấp cuộn protein đƣợc vận chuyển lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP động vật có vú tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993) 1.1.3 Quá trình tiết protein Bacillus 1.1.3.1 Các đường vận chuyển protein Bacillus Quá trình tiết protein Bacillus hệ thống tiết protein vi khuẩn đƣợc nghiên cứu Bacillus vi khuẩn G+ nên có chế tiết điển hình đƣợc biết đến khác so với E coli, S cerevisiae động vật có vú Tế bào Bacillus đƣợc bao quanh màng tế bào chất, đƣợc bao phủ thành tế bào dày (10 đến 50 nm) bao gồm chủ yếu chuỗi peptidoglycan teichoic teichuronic acid (Chu H.H., 2001) Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn đƣờng tiết protein đƣợc biết có mặt vi khuẩn Gram âm Gram dƣơng là: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) đƣờng Pseudopillin (Com pathway) Các SP Bacillus có nhiều cơng trình cơng bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara et al., 1993) Các đƣờng tiết protein Bacillus nhƣ enzym phân cắt tín hiệu tham gia đƣờng đƣợc thể Hình 1.1, Cơ chế tiết đƣợc thể hình 1.2 Hình 1.1 Các đƣờng tiết protein vi khuẩn (Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004) Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N SP nhờ Ffh protein Protein Ffh, Hbsu scRNA hợp phần phức hợp SRP (signal recognition particle) tham gia trình vận chuyển, sau phức hợp SRP-precusor tƣơng tác với SecA nhờ liên kết với SP Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào tƣơng tác với yếu tố protein vận chuyển màng SecYEG, SecE, SecG protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ YqjG Sau đó, SP đƣợc phân cắt enzyme màng SPase I (SipS-W), Precusor protein đƣợc đƣa qua Sec-pore SecA chủ yếu nhờ vào nguồn lƣợng ATP điện tử kênh dẫn truyền Đoạn SP bị phân cắt SPase SppA TepA, exoprotein đƣợc vận chuyển qua màng tế bào đƣợc điều khiển WprA, protease màng tế bào đƣợc tăng cƣờng tạo nhờ xúc tác PrsA, lipoprotein màng tế bào BdbB BdbC protein tham gia giúp cho việc hình thành cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond formation protein) trình hình thành cấu trúc protein Một số protease thành tế bào tích điện âm ion Ca2+ Fe3+ cần thiết cho việc ổn định hoạt tính số exoprotein Hình 1.2.Sơ đồ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P B subtilis (Nguồn: Brockmeier, 2006) 1.1.3.2 Đích vận chuyển protein Bacillus Cấu trúc lớp màng tế bào Bacilli khơng có lớp màng (OM Outer membrane) sau tổng hợp protein đƣợc giữ lại tế bào chất vận chuyển vào CM chúng đƣợc vận chuyển qua CM vào thành tế bào, sau protein giữ thành tiết môi trƣờng nuôi cấy (Tjalsma et al., 2000a) Thông qua đƣờng tiết khác sản phẩm protein đƣợc tiết ngồi mơi trƣờng ni cấy (nhƣ trong: Sec/P, Tat/P, ABC transporter), tồn mặt bên màng tế bào (Sec/P, Com) nằm thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004; Brockmeier, 2006) Đối với chi Bacillus, protein chủ yếu đƣợc tiết theo Sec/P-SRP Trong q trình vận chuyển, protein thiếu tín hiệu vận chuyển đƣợc giữ lại tế bào chất đƣợc gấp cuộn cần không cần có mặt chaperone đại diện cho nhóm nhƣ protein: GroEL-GroES DnaKDnaJ-GrpE (Tjalsma et al., 2000; Chu., 2001) Thành tế bào B subtilis tƣơng tự nhƣ periplasm vi khuẩn Gram âm chiếm khoảng 9% tổng khối lƣợng protein tế bào protein đƣợc giữ lại thành tế bào bao gồm enzyme nhƣ: DNases, Rnases (Merchante, et al., 1995), protease (Margot & Karamata, 1996, Msadek, et al., 1998), enzyme tham gia vào trình tổng hợp peptidoglycan (penicillin-binding protein) hydrolases có liên quan đến q trình tăng trƣởng tế bào, phân chia tế bào, hình thành bào tử, nảy mầm (Tjalsma, et al., 2000) Hầu hết protein đƣợc vận chuyển qua màng tế bào chất đƣợc tổng hợp với SP Giống nhƣ vi khuẩn Gram dƣơng khác, B subtilis thiếu lớp màng nên nhiều protein đƣợc tiết trực tiếp mơi trƣờng ni cấy q trình sinh trƣởng chủ yếu enzyme nhƣ: proteases, lipase, carbohydrase, DNases Rnases nhằm thực vai trò giúp vsv thích ứng với điều kiện mơi trƣờng việc sử dụng nguồn dinh dƣỡng sẵn có Ngồi enzyme ra, nhóm protein thứ hai đƣợc tiết thành viên nhóm phosphatase (PhrA PhrK) đóng vai trị nhận biết mật độ tế bào, điều chỉnh phát triển hình thành bào tử (Tjalsma, et.al., 2000; Chu H H., 2001) Ngƣợc lại với enzyme phân hủy chất Phr protein, hầu hết protein không đƣợc tiết, bao gồm protein tham gia trình giống nhƣ tạo thành tế bào, liên kết chất, tiết protein, phải đƣợc giữ lại màng tế bào với đầy đủ chức nhằm để ngăn việc hoạt tính protein dạng tự tế bào chất Chúng chứa SP tƣơng tác với màng với thành tế bào nhƣng không bị phân cắt enzyme tham gia vào trình tiết protein Ngồi ra, số protein tiết cịn hình thành lên cấu trúc like – pilin bề mặt tế bào (Tjalsma, et al., 2000; Chu , 2001) 1.1.3.3 Vai trị peptide tín hiệu Các SP đƣợc biết đến gồm loại phân biệt dựa điểm nhận biết phân cắt bao gồm: peptide tín hiệu đƣờng tiết chung (Sec/P), peptide tín hiệu Twin-arginine, peptide tín hiệu Lipoprotein, peptide tín hiệu pilin-like protein cuối peptide tín hiệu tham gia trình tiết bacteriocin pheromones (Tjalsma, et al., 2000; Tjalsma, et al., 2004) Peptide tín hiệu đƣợc biết đến có chức (van Roosmalen et al., 2004): Đầu tiên, nhận biết thụ thể máy tiết chuyển tới máy xúc tác vận chuyển protein qua màng; Thứ hai, SP nhƣ yếu tố định cho xác định preprotein màng bắt đầu di chuyển đến vùng ƣa nƣớc đầu cuối C preprotein phần N đƣợc định vị phía cis tế bào; Thứ ba, SP ức chế trình gấp cuộn protein hình thành tránh đƣợc việc kích hoạt enzyme có hại cho máy tiết enzyme bên tế bào giúp cho trình tiết đƣợc xảy hồn tồn 1.1.3.4 Peptide tín hiệu Sec/P Q trình vận chuyển bên ngồi tế bào khoảng 300 protein thuộc chi Bacillus chủ yếu đƣợc tiết qua Sec/P (secretory pathway) Sec/P đƣợc coi đƣờng tiết chung cho chi (Tjalsma, et al., 2000a) Các peptide tín hiệu đƣờng ln gồm ba vùng với chức riêng: vùng N (tích điện dƣơng), vùng kỵ nƣớc H vùng đầu cuối C (Leite, 2011; Brockmeier et al., 2006b; Low et al., 2013) Sự khác biệt SP vi khuẩn G(+) G(-) đƣợc so sánh Bảng 1.1 (Dalbey&Heijne, 2002) Sec/P đƣợc xem nhƣ đƣờng tiết chung cho hầu hết protein Bacillus với máy tiết tham gia gồm thành phần chính: (1) Các chaperon tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) Bộ máy vận chuyển (SecA, SecY, SecE, SecG, SecDF-YajC); (3) Các enzyme phân cắt peptide tín hiệu (SPase) phân cắt SP preprotein tạo thành đoạn trƣởng thành; (4) Các enzyme phân cắt (hay gọi SPase) cắt SP khỏi preprotein màng; (5) Các nhân tố gấp cuộn (folding factors) Trung bình SP loại I Bacillus dài SP E coli từ – axit amin Trong vi khuẩn Gram dƣơng, vị trí phân cắt SPase khoảng - axit amin E coli vị trí phân cắt xảy vị trí - (Leite, 2011) Vị trí +1 sau điểm phân cắt SPase thƣờng Ala (27%) lại axit amin khác ngoại trừ proline cysteine (Tjalsma et al., 2000) Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P đƣợc trình bày bảng 1.2 (Tjalsma et al., 2000) Bảng 1.1.So sánh khác biệt peptide tín hiệu G+ G- theo Sec/P STT Chỉ tiêu so sánh Gram dƣơng Gram âm Độ dài SP trung bình(axit amin) 32 25 Vùng N Tích điện dƣơng cao, giàu Lys/Arg Tích điện dƣơng (thấp), giàu Lys/Arg Vùng H Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn α dài Kỵ nƣớc, có cấu trúc xoắn α ngắn Vùng C Vị trí -1 & -3 theo trình tự Ala – X Ala Phân cực/trung tính, kéo dài Phân cực/trung tính, kéo dài hình thành cấu trúc β, dài hình thành cấu trúc β, ngắn hơn, giàu Pro/Thr hơn, giàu Ser/Ala Chủ yếu Ala, đƣợc thay Ser/Gly Chủ yếu Ala, đƣợc thay Ser/Gly (Nguồn: Dalbey & Heijne, 2002) Vùng N (N – region) mang điện tích dƣơng chuỗi preprotein SP theo Sec/P có chứa trung bình khoảng – axit amin, chứa axit amin Lysine Arginine (Low et al., 2013; Leite, 2011) Một preprotein khơng mang điện tích dƣơng đƣợc nhận biết máy vận chuyển nhiên chúng đƣợc tiết chậm Vùng N tƣơng tác với ATPase, SecA với phospholipid tích điện âm (Dalbey & Von Heijne, 2002) 10 Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P Thành phần B subtilis E coli S cerevisiae Chaperone riêng Ffh, FtsY, scRNA CsaA (?) Ffh, FtsY, 4.5S RNA, SecB YgjH (?) Phức hợp SRP (gồm scR1 RNA, Srp72p, Srp68p, Srp54p, Sec65p, Srp21p, Srp14p, Srp7p), DPα/β Chaperone chung GroEL, GroES DnaK, DnaJ, GrpE, yếu tố kích hoạt GroEL, GroES DnaK, DnaJ, GrpE, yếu tố kích hoạt Hsp70, Ydj1 Nhân tố vận chuyển SecA SecA Ribosome, Kar2 (Bip) Kênh chuyển vị SecY, SecG, SecE, SecDF, YrbF SecY, SecG, SecE, SecD/F, YajC Sec61, Ssh1 (Sec61α),Sbh1, Sbh2 (Sec61β), Sss1 (Sec61γ) Sec62/63, Sec66/67 SPases SipS/T/U/V/P, SipW, LspA LepB, LspA Sec11 SPPases SppA, TepA SppA, OpdA PrsA, BdbA/B/C SurA, PpiD, RotA, FkpA, DsbA/B/C/D/E/G Foldases CPR2, CPR4, CPR5, CPR8, FPR2, PDI, Ero1, Eug1 Kar2 (BiP),Lhs1, (Hsp70) (Nguồn: Tjalsma et al., 2000) Vùng H (hydrophobic H- region) vùng tâm kị nƣớc có chứa khoảng 19 axit amin có cấu trúc xoắn α đƣợc hình thành tƣơng tác vùng N tích điện dƣơng với phospholipid tích điện âm Thơng thƣờng hai axit amin Glycine Proline đƣợc tìm thấy nằm vùng với khoảng 60% vùng H SP Bacillus chứa Glycine 50% chứa Prolin Glycine điểm bẻ gãy cấu trúc xoắn -7 -4 (Tjalsma, et al., 2000., Leite, 2011) Hai axit amin đƣợc xem vị trí bẻ gãy liên kết xoắn α hình thành nên cấu trúc kẹp tóc vị trí 52 D8-1 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 53 D8-2 Trắng, bề mặt nhẵn, trơn, bóng + + + 54 D8-4 Trịn nhỏ, màu trắng, bề mặt khơ, khuẩn lạc già có nếp nhăn nhẹ + + + 55 D8-5 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 56 D8-6 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù + + + 57 D8-11 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 58 D8-12 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 59 D9 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù + + + 60 D9-1 Trịn, nhỏ, màu kem khuẩn lạc chuyển màu cà phê nuôi cấy thời gian dài + + + 61 D9-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 62 D9-3 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù + + + 63 D9-4 Trịn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu + + + 64 D9-5 trịn khơng đều, màu nâu, có đƣờng viền phân tâm, tâm có nếp nhăn + + + 65 D9-7 Tròn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu + + + 66 D9-11 Trắng, bề mặt khơ, mép xù + + + 67 D9-12 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 68 D9-13 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 69 D9-14 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 70 DP1-1 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 71 DP1-2 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 72 DP2 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 73 DP3 Tròn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu + + + 74 DP4 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 75 DP5 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù + + + 76 DA23 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khơ, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 77 DA24 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khơ, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 78 GL1-1 Màu trắng, bề mặt khơ, mép xù + + + 79 GL1-2 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép cƣa + + + 80 GL1-4 To, màu trắng, bề mặt khơ, có viền tâm, mép xù + + + 81 GL1-5 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 82 GL1-7 Nhỏ, bề mặt nhẵn, tâm vàng chanh viền trắng + + + 83 GL1-8 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 84 GL2-1 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 85 GL2-2 Trịn nhỏ, màu vàng chanh, bề mặt khơ, bóng + + + 86 GL2-3 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 87 GL2-4 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô + + + 88 GL2-6 Trắng, bề mặt bóng, mép có tia lan rộng + + + 89 GL2-7 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khô + + + 90 GL2-8 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép cƣa + + + 91 ML1-3 Khuẩn lạc màu vàng chanh, bề mặt khô, mép gọn + + + 92 ML1-4 Trắng đục, bề mặt khơ, có nhiều nếp nhăn với sóng to, mép gọn + + + 93 ML1-5 Khuẩn lạc nhẵn, màu trắng, bề mặt khơ, mép xù + + + 94 RRM11 trịn, bề mặt khơ, màu trắng, mép xù + + + 95 RRM12 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 96 RRM13 trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 97 RRM2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 98 RRM31 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 99 RRM32 ovan, màu trắng, bề mặt khô, mép gọn + + + 100 RRM4 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 101 RRM52 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 102 RRM53 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 103 RRM54 Nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 104 RRM8 To, màu trắng sáng, bề mặt khô + + + 105 TB1-1 Tròn, màu kem nâu cà phê khuẩn lạc già, bề mặt nhăn, lồi + + + 106 TB1-2 trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 107 TB2-1 Trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 108 TB2-2 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 109 TH1-1 Nhỏ, trắng, bề mặt khô, mỏng mọc sát thạch, mép gọn, có nếp nhăn + + + 110 TH1-2 trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 111 TH2 trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 112 TH5-1 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 113 TH5-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 114 TR1 To, trịn, trắng, mép xù + + + 115 TR4-1 Bề mặt khô, màu trắng trong, nhiều nếp nhăn + + + 116 TR4-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 117 TR4-3 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 118 TR5-1 Trịn, màu trắng đục, mép cƣa, có viền tâm + + + 119 TR5-2 Tròn, màu vàng, bề mặt nhẵn bóng + + + 120 TR5-3 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mép lan + + + 121 TT2-1 nhỏ, trắng đục, bề mặt khô, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 122 TT2-10 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 123 TT2-2 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 124 TT2-3 Nhỏ, bề mặt khơ, bóng, có mép hình cƣa + + + 125 TT2-4 nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 126 TT2-5 To, trịn, trắng, mép xù + + + 127 TT2-6 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 128 TT2-7 To, trịn, trắng, mép xù + + + 129 TT2-8 Nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 130 TT2-9 Trịn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + PHỤ LỤC II Hoạt tính hàm lƣợng α amylase chủng chọn lọc Ký hiệu chủng Hoạt tính amylase (U/ml) Hàm lƣợng protein tiết (µg/ml) Tỷ lệ hoạt Tỷ lệ hoạt tính tính amylase amylase Hoạt tính Hàm lƣợng hàm Ký hiệu hàm amylase protein tiết lƣợng chủng lƣợng (U/ml) (µg/ml) protein protein tiết tổng tiết tổng số, U/mg số, U/mg CN1-1 5,70±0,40 1441,64±6,11 3,95 D9-11 6,28±0,67 1085,19±4,64 5,79 CN1-2 2,53±0,76 1553,18±6,14 1,63 D9-12 2,79±0,59 1293,53±5,53 2,16 CN1-3 3,51±0,52 1179,57±13,10 2,98 D9-13 7,33±0,57 1617,70±6,92 4,53 CN1-5 6,93±0,21 1368,06±15,38 5,07 D9-14 3,93±0,43 1690,31±7,23 2,33 CN1-6 1,52±0,47 1167,37±12,96 1,30 DP1-1 8,01±0,65 1412,87±4,76 5,67 CN2-1 2,24±0,92 1631,07±18,11 1,37 DP1-2 7,81±0,65 1770,99±7,57 4,41 CN2-7 6,50±0,56 1269,36±14,09 5,12 DP2 3,82±0,54 1348,03±4,05 2,83 CN2-8 8,41±0,37 1750,91±19,44 4,80 DP3 7,58±0,98 1591,55±3,81 4,76 CN3-1 3,40±0,27 1171,43±13,01 2,90 DP4 3,90±0,65 1347,41±5,76 2,89 CN3-2 6,50±0,44 1540,13±17,10 4,22 DP5 4,01±0,27 1879,92±8,04 2,13 CN3-7 4,48±0,44 1285,33±14,27 3,49 DA23 14,23±0,92 1563,87±6,69 9,10 CN3-8 5,31±0,36 1548,03±16,08 3,43 DA24 11,23±0,52 1445,53±6,18 7,77 D1-1 5,64±0,15 1220,24±13,55 4,62 GL1-1 5,34±0,7 1069,05±4,57 5,00 D1-2 2,53±0,32 1232,45±13,68 2,05 GL1-2 6,89±0,5 1190,08±5,09 5,79 D1-17 6,97±0,33 1215,86±16,83 5,73 GL1-4 7,86±0,55 1274,79±5,45 6,17 D1-33 8,54±0,21 1532,45±13,68 5,57 GL1-5 11,24±0,79 1303,03±5,57 8,63 D1-35 3,14±0,31 1476,50±16,39 2,13 GL1-7 3,66±0,26 1625,76±6,95 2,25 D2-1 6,21±0,26 1675,81±18,61 3,71 GL1-8 4,9±0,92 1133,59±4,58 4,32 D2-2 8,61±0,1 1830,37±20,32 4,70 GL2-1 5,82±0,84 1420,02±6,07 4,10 D2-7 3,98±0,33 1460,23±16,21 2,73 GL2-2 10,61±1,2 1573,32±6,73 6,74 D2-8 10,21±0,25 1479,20±17,53 6,90 GL2-3 11,83±0,69 1504,74±6,44 7,86 D2-9 3,50±0,36 1374,51±9,71 2,55 GL2-4 1,97 3,17±0,57 1609,63±6,88 D2-10 4,39±0,27 1696,14±18,83 2,59 GL2-6 5,09±0,78 1940,43±8,30 2,62 D2-11 7,70±1,13 1754,09±17,25 4,39 GL2-7 4,48±0,89 1936,39±8,28 2,31 D2-12 3,90±0,26 1651,40±18,33 2,36 GL2-8 6,34±0,47 1435,31±5,71 4,42 D2-13 10,33±0,5 1618,87±17,97 6,38 ML1-3 8,55±0,74 1433,59±4,85 5,96 D2-15 5,35±0,56 1600,17±6,99 3,34 ML1-4 4,92±0,67 1641,90±7,02 3,00 D2-17 4,49±0,56 1517,19±6,62 2,96 ML1-5 5,18±0,59 1276,27±4,18 4,06 D2-20 8,65±0,61 1845,18±8,49 4,69 RRM1-1 3,65±0,47 1084,33±4,21 3,37 D2-22 2,48±0,56 1145,80±5,00 2,16 RRM1-2 7,97±0,51 1675,41±3,74 4,76 D3 4,65±0,65 1402,62±6,12 3,32 RRM1-3 5,34±1,31 1355,24±3,66 3,94 D4 2,07±0,96 1328,49±4,05 1,56 RRM2 10,52±1,21 1504,74±6,44 6,99 D5-2 14,12±0,99 1520,47±7,51 9,29 RRM3-1 10,38±1,01 1584,57±6,35 6,55 D6 10,09±0,67 1473,73±6,44 6,85 RRM3-2 11,33±0,59 1475,03±7,59 7,68 D6-1 7,62±0,62 1343,35±5,87 5,67 RRM4 12,84±0,74 1608,76±6,88 7,98 D6-3 2,25±1,03 1031,22±4,50 2,18 RRM5-2 8,59±0,45 1242,52±5,31 6,91 D6-6 5,28±0,17 1210,10±4,19 4,36 RRM5-3 7,59±0,68 1702,41±7,28 4,46 D6-8 3,14±0,77 1213,91±3,55 2,59 RRM5-4 11,00±0,71 1488,60±6,37 7,39 D6-9 3,07±0,45 1173,46±5,12 2,62 RRM8 10,76±0,79 1549,11±6,62 6,95 D6-10 7,53±0,31 1841,18±8,04 4,09 TB1-1 10,05±0,66 1380,96±6,76 7,28 D6-11 6,43±0,08 1248,53±5,45 5,15 TB1-2 7,94±0,42 1473,08±4,59 5,39 D6-12 8,53±0,23 1054,92±4,61 8,09 TB2-1 5,75±0,39 1511,34±7,75 3,80 D6-14 3,87±0,14 1036,39±4,09 3,73 TB2-2 5,70±0,92 1334,67±3,14 4,27 D6-19 10,61±0,46 1556,71±6,80 6,82 TH1-1 6,28±0,86 1054,21±4,51 5,96 1536,68±5,4 5,31 TH1-2 11,03±0,78 1889,16±8,08 5,84 D7-1 6,48±0,13 1260,38±5,50 5,14 TH2 7,84±0,68 1379,23±3,76 5,68 D7-4 11,03±0,25 1529,35±6,68 7,21 TH5-1 6,22±0,33 2119,67±9,07 2,93 D7-5 11,49±0,36 1805,62±7,88 5,81 TH5-2 7,1±0,56 1932,36±8,26 3,67 D7-6 8,90±0,72 2086,15±9,11 4,27 TR1 3,63±0,65 1311,10±5,61 2,77 D7-10 5,22±0,62 1608,07±7,02 3,25 TR4-1 12,72±0,86 1658,04±7,09 7,67 D7-11 4,90±0,46 1149,75±5,02 4,26 TR4-2 8,50±0,3 1488,60±6,37 5,71 D8-1 4,09±0,77 1683,53±2,98 2,43 TR4-3 10,74±0,71 1590,93±5,52 6,75 D7 8,16±0,15 D8-2 4,61±0,44 1879,45±3,76 2,45 TR5-1 8,60±0,4 1698,38±7,26 5,06 D8-4 9,55±0,58 1658,04±7,09 5,76 TR5-2 11,79±0,61 1562,93±7,54 7,54 D8-5 12,82±1,03 1441,92±6,17 8,89 TR5-3 10,27±0,69 1460,36±6,25 7,03 D8-6 4,25±0,85 1508,77±6,45 2,82 TT2-1 4,04±0,37 1137,63±4,87 3,55 D8-11 5,94±0,74 1078,59±3,33 5,51 TT2-2 12,23±0,48 1764,86±5,41 6,93 D8-12 2,95±0,62 1024,68±4,38 2,88 TT2-3 2,71±0,71 1016,60±4,35 2,67 D9 3,61±0,56 1097,29±4,69 3,29 TT2-4 3,54±0,63 1101,33±4,71 3,21 D9-1 11,18±1,05 1469,30±6,28 7,61 TT2-5 4,18±0,71 1637,86±7,00 2,55 D9-2 3,83±0,59 1444,22±6,18 2,65 TT2-6 8,98±0,63 1415,99±6,06 6,34 D9-3 3,99±0,32 1149,73±4,92 3,47 TT2-7 5,90±0,78 1391,78±5,95 4,24 D9-4 11,15±0,99 1615,99±6,06 6,90 TT2-8 9,66±0,63 1658,34±7,09 5,83 D9-5 9,46±0,57 1359,51±5,81 6,96 TT2-9 5,60±0,68 1407,69±3,88 3,98 D9-7 10,17±0,79 1767,16±5,42 5,75 TT2-10 4,71±0,44 2129,44±9,96 2,21 PHỤ LỤC III Kết thử kit API 50 CHB số chủng vi khuẩn chọn lọc PHỤ LỤC IV ĐIỂM XỬ LÝ PHÂN CẮT CỦA CÁC ĐOẠN SP Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng DA23 Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng D5-2 10 Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng CN1-5 11 PHỤ LỤC V PHÂN TÍCH PROTEIN THEO LOWRY Phƣơng pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden- photphovonphramat (thuốc thử Folin- ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bƣớc sóng 750nm Cƣờng độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định đƣợc hàm lƣợng protein mẫu nghiên cứu Dung dịch dùng cho phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Lowry + Dung dịch A: 2,85g NaOH 14,31g Na2CO3 pha 500ml nƣớc cất + Dung dịch B: 1,42g CuS04.5H2O pha 100ml nƣớc cất + Dung dịch C: 2,85g Na2 Tartrate.2H2O pha 100ml nƣớc cất + Dung dịch D (Lowry solution; 0,7mL/mẫu): trộn dung dịch A, dung dịch B, dung dịch C theo tỉ lệ 100:1:1 + Dung dich E: Thuốc thử folin (0,1 ml/mẫu): 5ml thuốc thử Folin - Ciocalteu’s Phenol + 5ml nƣớc đề ion DUONG CHUAN PROTEIN 0.45 0.4 y = 0.0021x - 0.0084 R2 = 0.9953 0.35 0.3 0.25 OD 0.2 0.15 0.1 0.05 -0.05 Linear (OD) 50 100 150 200 Đồ thị đƣờng chuẩn protein 12 250 PHỤ LỤC VI PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BẰNG DNSA Nguyên tắc phản ứng: Phƣơng pháp dựa nguyên tắc có mặt nhóm carbonyl tự (C=O) Phản ứng ơxi hóa nhóm chức aldehyt có mặt glucose nhóm ketone fructose 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) bị khử thành 3-amino,5-nitrosalicylic acid dƣới điều kiện môi trƣờng kiềm Màu phản ứng phụ thuộc vào xác lƣợng đƣờng khử dung dịch Nồng độ chất bổ sung mẫu thí nghiệm đƣờng khử Tên đối Thể tích dịch Thể tích dịch tinh bột Đệm/nƣớc tƣợng mẫu enzyme (ml) đệm (ml) cất DNSA (ml) Đối chứng 0 Đối chứng 0.5 0.5 Đối chứng 0.5 0.5 Mẫu 0.5 0.5 Thể tích Duong chuan glucose y = 5.3486x + 0.0619 R2 = 0.9934 30 25 20 15 10 0 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose 13 PHỤ LỤC VII CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH NGHIÊN CỨU Pha IPTG: + 1.2g IPTG pha vào 50ml nƣớc sau lọc qua filter-sterilise bảo quản 4ºC 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside (2ml): + 100mg X-Gal hòa 2ml N, N’-dimethylformamide Bảo quản 20ºC, tránh ánh sáng TE (Tris/EDTA) buffer pH 8.0 : + Tris/HCl pH 8.0 10mM EDTA pH 8.0 10mM 10% SDS (sodium dodecyl sulphate): + 10g SDS 100ml nƣớc deion khử trùng bảo quản nhiệt độ phòng CTAB/NaCl + Cân 10% cetyltrimethylammonium bromide 0.7 M NaCl bổ sung nƣớc đến 100ml Dung dịch A Tách chiết DNA tổng số + 567 µl 1xTE, 30 µl SDS 10% µl proteinase K 20 mg/ml Tách plasmid E.coli + Sol I: 50mM glucose, 25mM Tris – HCl (pH 8), 10mM EDTA(pH 8) + Sol II: 0.2N NaOH, 1% SDS + Sol III: 60.0 ml potassium acetate 5M; 11.5 ml acetic acid; H2O, 28.5 ml Tách chiết DNA plasmid Bacillus + SET: 25% sucrose, 50mM EDTA, 50mM Tris – HCl pH + Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS 14 LOCUS KU214590 366 bp DNA linear BCT 17MAY-2016 DEFINITION Bacillus licheniformis strain DA23 alpha amylase gene, partial cds ACCESSION KU214590 VERSION KU214590.1 KEYWORDS SOURCE Bacillus licheniformis ORGANISM Bacillus licheniformis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus REFERENCE (bases to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus sp d5-2 and bacillus sp da23 isolated from soil JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 366 /organism="Bacillus licheniformis" /mol_type="genomic DNA" /strain="DA23" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1402" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" CDS >366 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80847.1" /translation="MKQQKRLYARFCCRLLFALIFLLPHSAAAAANLKGTLMQYFEWY MPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGT VRTKYGTKGELQSAIKSLHT" ORIGIN atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttttgctgcc gcctgttatt tgcgctcatc 61 ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg gcaaatctta aagggacgct gatgcagtat 121 tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa cattggaagc gcttgcaaaa cgactcggca 181 tatttggctg aacacggtat tactgccgtc tggattcccc cggcatataa gggaacgagc 241 caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa 301 gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt 361 catacc // 15 LOCUS MAY-2016 DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM KU214591 352 bp DNA linear BCT 17- Bacillus cereus strain CN1-5 alpha amylase gene, partial cds KU214591 KU214591.1 Bacillus cereus Bacillus cereus Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; REFERENCE AUTHORS TITLE sp d5-2 JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL Quoc FEATURES source CDS Bacillus cereus group (bases to 352) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus and bacillus sp da23 isolated from soil Unpublished (bases to 352) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Direct Submission Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam Location/Qualifiers 352 /organism="Bacillus cereus" /mol_type="genomic DNA" /strain="CN1-5" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1396" /country="Viet Nam" /collection_date="31-Oct-2010" /collected_by="Da, N T" >352 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80848.1" /translation="MFKKVTIVGLSVVMFLPSIYEGSKAYADTVNNGTLMQYFEWYAP NDGNHWNRLRTDVENLAEKGITSVWIPPAYKGTTQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVR TKYGTKAQLKSAIDA" ORIGIN atgtttaaaa aagtaacaat agtcggattg tcggttgtta tgtttttacc tagtatatat 61 gaggggagta aagcatatgc agacacagtt aacaatggaa cgttaatgca gtattttgag 121 tggtatgctc cgaatgatgg gaatcattgg aatcgtttgc gtactgatgt tgaaaattta 181 gcggaaaaag gaattacatc tgtttggata ccacctgcat ataaaggaac tacgcaaaat 241 gacgtaggat atggagcata tgatttatat gatctggggg aattcaatca aaagggcaca 301 gtgcggacga aatatgggac gaaagcacaa ttgaaatctg caattgacgc tt // 16 LOCUS MAY-2016 DEFINITION cds ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM Bacillus REFERENCE AUTHORS TITLE sp d5-2 JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL Quoc FEATURES source CDS KU214589 397 bp DNA linear BCT 17- Bacillus subtilis strain D5-2 alpha amylase gene, partial KU214589 KU214589.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; (bases to 397) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus and bacillus sp da23 isolated from soil Unpublished (bases to 397) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Direct Submission Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam Location/Qualifiers 397 /organism="Bacillus subtilis" /mol_type="genomic DNA" /strain="D5-2" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1423" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" >397 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80846.1" /translation="MFKKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLSGPAAANAETANKSNKVTA SSVKNGTILHAWNWSFNTLTQNMKDIRDAGYAAIQTSPINQVKEGNQGDKSMRNWYWL YQPTSYQIGNRYLGTEQEFKDMWQPRIKYG" ORIGIN atgtttaaaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgccggatt tttattgctg 61 tttcatttgg ttttgtcagg cccggcggct gcaaacgctg aaactgcaaa caaatcgaat 121 aaggtgaccg cgtcatcggt caaaaacggg accatccttc atgcatggaa ttggtcgttc 181 aatacgttaa cacaaaatat gaaagatatt cgtgatgcgg gctatgcagc cattcagacg 241 tctccgatta accaagtaaa ggaagggaac caaggagata aaagcatgag gaactggtac 301 tggctgtatc agccgacatc gtaccaaatc ggcaaccgtt acttaggcac tgaacaagaa 361 tttaaggaca tgtggcagcc gcggataaag tatggcg // 17 ... tự peptide tín hiệu gen α- amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến thay peptide tín hiệu đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo chủng tái tổ hợp với peptide tín hiệu đột biến sàng lọc chủng có khả tiết. .. có hiệu Bacillus dựa sàng lọc peptide tín hiệu gen α- amylase từ chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập Việt Nam, lựa chọn đề tài: ? ?Sàng lọc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến điểm peptide tín hiệu. .. biểu mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả tiết α- amylase ngoại bào chủng Bacillus tái tổ hợp Nội dung luận án: - Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus có khả sinh α- amylase ngoại bào