MỞ ĐẦU Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu nhận. Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men. Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase. Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis”
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ ĐÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG BACILLUS SUBTILIS Hà Nội, 2017 iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 1.1.1 Quá trình tiết protein tế bào Eucaryotes 1.1.2 Quá trình tiết protein E coli 1.1.3 Quá trình tiết protein Bacillus 1.1.4 Enzyme phân cắt peptide tín hiệu Sec/P 16 1.2 HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT 18 1.2.1 Vai trò Bacillus cơng nghiệp sản xuất enzyme 18 1.2.2 Hệ thống biểu Bacillus 20 1.2.3 Đặc điểm di truyền Bacillus subtilis 20 1.2.4 Hệ biểu E coli vi sinh vật khác 21 1.3 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis 22 1.3.1 Lựa chọn promoter 23 1.3.2 Các vector biểu Bacillus subtilis 24 1.3.3 Chọn trình tự peptide tín hiệu 25 1.3.4 Đột biến peptide tín hiệu 25 1.3.5 Sử dụng chủng chủ đƣợc cải biến di truyền 28 1.4 α - AMYLASE 29 1.4.1 Cấu trúc α – amylase 29 1.4.2 α-Amylase từ Bacillus 30 1.4.3 α-Amylase từ vi sinh vật khác 32 1.4.4 α-Amylase tái tổ hợp vi sinh vật 35 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 38 iv 2.1 CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID 38 2.1.1 Các chủng dại 38 2.1.2 Chủng chủ dùng nghiên cứu 38 2.1.3 Plasmid 39 2.2 MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG 40 2.2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 40 2.2.2 Chất bổ sung 40 2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 41 2.3.1 Thiết bị 41 2.3.2 Hóa chất Kit 41 2.4 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.4.1 Phân lập chủng 42 2.4.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính α – amylase 42 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo Lowry 43 2.4.4 Phƣơng pháp thu amylase tế bào 43 2.4.5 Phƣơng pháp phân loại chủng chọn lọc 44 2.4.6 Phƣơng pháp tách chiết DNA 44 2.4.7 Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ 46 2.4.8 Kỹ thuật PCR 46 2.4.9 Cắt enzyme giới hạn ligation DNA 49 2.4.10 Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation) 50 2.4.11 Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu 50 2.4.12 Phƣơng pháp megaprimer 50 2.4.13 Phƣơng pháp tinh DNA từ gel agarose 52 2.4.14 Phƣơng pháp điện di DNA 52 2.4.15 Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase chủng tái tổ hợp 53 2.4.16 Điện di SDS – PAGE 54 2.4.17 Xác định hoạt tính α – amylase gel polyacrylamid 55 2.4.18 Xử lý số liệu 55 v CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƢỜNG 56 3.1.1 Phân lập tuyển chọn sơ chủng Bacillus có hoạt tính amylase 56 3.1.2 Sàng lọc chủng phân lập thu chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính amylase cao 57 3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm phân loại chủng 59 3.2 PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HĨA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC 62 3.3 SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE 67 3.3.1 Tách peptide tín hiệu tạo tổ hợp với gen đích 70 3.3.2 Tạo vector mang tổ hợp gen đích 72 3.3.3 Đánh giá khả tiết tổ hợp gen đích chủng chủ B subtilis 168M 75 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CĨ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƢỢC THIẾT KẾ 83 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA CHỦNG TÁI TỔ HỢP 91 3.5.1 Xác định động thái sinh trƣởng sinh tổng hợp α - amylase chủng 168MpHVC1 91 3.5.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh trƣởng sinh amylase chủng 168MpHVC1 92 3.5.3 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên khả tiết amylase chủng 168MpHVC1 93 3.5.4 Ảnh hƣởng nguồn N, C lên khả sinh trƣởng sinh amylase chủng 168MpHVC1 95 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ 97 vi 4.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN 97 4.1.1 Phân lập thu chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase 97 4.1.2 Protein ngoại bào hoạt tính α – amylase chủng tuyển chọn 98 4.1.3 Tách dòng peptide tín hiệu Bacillus đánh giá vai trò axit amin trình tự với trình tiết protein 101 4.2 KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC NHAU 105 4.3 SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN TRONG B subtilis 168M 107 4.4 NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH CỦA CHÚNG 113 4.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN LUẬN ÁN 125 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BLAST Basic local alignment search tool Bp Base pair – cặp bazơ BSA Bovine serum albumin CM Cell membrane Cs Cộng CTAB hexadecyltrimethyl ammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid DTT Dithiothreitol ER Mạng lƣới nội chất/ endoplasmic reticulum G- Vi khuẩn Gram âm G+ Vi khuẩn Gram dƣơng GRAS Generally recognized as safe – đƣợc coi an toàn HAc Axit axetic Kb kilobase mg Milligram mg/ml Milligram/millilitre mM Milli (10-3) Molar NCBI National Centre for Biotechnology Information PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR Polymerase chain reaction PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride rDNA Ribosomal deoxynucleic acid SDS Sodiumdodecylsulfat Sec/P Sec pathway/ Secretion pathway – đƣờng tiết SP Peptide tín hiệu (SP) SPase SPase viii SRP Signal recognition particle STT Số thứ tự TAE Tris-acetic acid-EDTA TAT/P Twin-arginine translocation pathway TEMED Tetramethylethylenediamine TIM Triose phosphate Isomerase Tm Melting temperature U Unit VSV Vi sinh vật MeOH Methanol TRAM Translocating chain-associating membrane protein ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 So sánh khác biệt peptide tín hiệu G+ G- theo Sec/P Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P 10 Bảng 1.3 Một số enzyme có nguồn gốc vi khuẩn ứng dụng chúng 19 Bảng 2.1 Các mẫu đất ký hiệu sử dụng nghiên cứu 38 Bảng 2.2 Các chủng chủ nghiên cứu 38 Bảng 2.3 Các plasmid đặt theo hãng sử dụng nghiên cứu 40 Bảng 2.4 Các chất bổ sung sử dụng cho môi trƣờng chọn lọc 41 Bảng 2.5 Các primer sử dụng nghiên cứu 47 Bảng 3.1 Số lƣợng khuẩn lạc phân lập môi trƣờng LB tinh bột 56 Bảng 3.2 Hoạt tính hàm lƣợng α- amylase số chủng chọn lọc 60 Bảng 3.3 Đặc điểm peptide tín hiệu chọn lọc 66 Bảng 3.4 Các thành phần tổ hợp Megaprimer 68 Bảng 3.5 Hoạt tính tiết enzyme chủng tái tổ hợp 77 Bảng 3.6 Các plasmid thiết kế 80 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng peptide tín hiệu khác lên khả biểu tiết protein α-amylase B licheniformis 3BT2 81 Bảng 3.8 Đặc điểm peptide tín hiệu đột biến 84 Bảng 3.9 Thành phần plasmid mang tổ hợp gen đột biến 85 Bảng 3.10 Khả tiết α - amylase protein tổng số chủng tái tổ hợp 87 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG lên khả tiết amylase 94 chủng 168MpHVC1 94 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nguồn C lên khả sinh trƣởng sinh amylase chủng 168MpHVC1 95 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn N lên khả sinh trƣởng sinh amylase chủng 168MpHVC1 96 x DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các đƣờng tiết protein vi khuẩn Hình 1.2 Sơ đồ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P B subtilis Hình 1.3 Các yếu tố liên quan đến biểu gen B subtilis 22 Hình 2.1 Các vector sử dụng nghiên cứu…………………………… Hình 2.2 Sơ đồ phƣơng pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen peptide tín 39 hiệu quan tâm đoạn gen đích 51 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2 amylase gen T4-lygase từ Pgrac tổ hợp gen đích phân lập 52 Hình 3.1 Hoạt tính amylase số chủng sàng lọc 58 Hình 3.2 Hình thái tế bào hình ảnh số khuẩn lạc Bacillus phân lập 58 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA số chủng nghiên cứu 60 Hình 3.4 Cây phát sinh loài chủng chọn lọc 61 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu chủng nghiên cứu 63 Hình 3.6 Điểm phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng DA23 64 Hình 3.7 Điểm phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng D5-2 64 Hình 3.8 Điểm phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng CN1-5 64 Hình 3.9 Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu chủng nghiên cứu 65 xi Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide ba peptide tín hiệu chọn lọc 65 Hình 3.11 So sánh trình tự protein mã hóa cho SP ba chủng nghiên cứu 65 Hình 3.12 Sơ đồ thí nghiệm tăng khả tiết α-amylase Bacillus subtilis 68 Hình 3.13 Sơ đồ điểm cắt enzyme giới hạn peptide tín hiệu chọn lọc 69 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn mature gen α amylase chủng 3BT2, đoạn peptide tín hiệu quan tâm, sản phẩm megaprimer peptide tín hiệu quan tâm đoạn gen trƣởng thành α – amylase 3BT2 71 Hình 3.15 Sản phẩm tách DNA plasmid cắt kiểm tra BamHI XbaI dòng mang đoạn sản phẩm megaprimer DASsub3BT2Mature pTZ57R/T 71 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen quan tâm 71 Hình 3.17 Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy từ vector pHV33 gốc 74 Hình 3.18 Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 tách dòng xử lý EcoRI 75 Hình 3.19 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy lên hoạt tính nhƣ khả sinh tổng hợp enzym chủng B subtilis 168M mang vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 78 Hình 3.20 Ảnh hƣởng promoter lên khả tiết enzym chủng tái tổ hợp 78 Hình 3.21 So sánh biểu tiết α-amylase peptide tín hiệu khác 82 Hình 3.22 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên sinh trƣởng sinh tổng 82 52 D8-1 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 53 D8-2 Trắng, bề mặt nhẵn, trơn, bóng + + + 54 D8-4 Tròn nhỏ, màu trắng, bề mặt khơ, khuẩn lạc già có nếp nhăn nhẹ + + + 55 D8-5 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 56 D8-6 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 57 D8-11 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 58 D8-12 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 59 D9 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 60 D9-1 Tròn, nhỏ, màu kem khuẩn lạc chuyển màu cà phê nuôi cấy thời gian dài + + + 61 D9-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 62 D9-3 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 63 D9-4 Tròn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khơ, mép gọn màu + + + 64 D9-5 tròn khơng đều, màu nâu, có đƣờng viền phân tâm, tâm có nếp nhăn + + + 65 D9-7 Tròn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu + + + 66 D9-11 Trắng, bề mặt khô, mép xù + + + 67 D9-12 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khơ, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 68 D9-13 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 69 D9-14 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 70 DP1-1 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 71 DP1-2 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 72 DP2 Trắng đục, bề mặt khô, mép xù + + + 73 DP3 Tròn, màu trắng ánh nâu, bề mặt khô, mép gọn màu + + + 74 DP4 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 75 DP5 Trắng đục, bề mặt khơ, mép xù + + + 76 DA23 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 77 DA24 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mọc dính chặt vào thạch, mép lan + + + 78 GL1-1 Màu trắng, bề mặt khơ, mép xù + + + 79 GL1-2 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép cƣa + + + 80 GL1-4 To, màu trắng, bề mặt khơ, có viền tâm, mép xù + + + 81 GL1-5 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 82 GL1-7 Nhỏ, bề mặt nhẵn, tâm vàng chanh viền trắng + + + 83 GL1-8 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 84 GL2-1 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 85 GL2-2 Tròn nhỏ, màu vàng chanh, bề mặt khơ, bóng + + + 86 GL2-3 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 87 GL2-4 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khơ + + + 88 GL2-6 Trắng, bề mặt bóng, mép có tia lan rộng + + + 89 GL2-7 Trắng, mép sần sùi, có nhiều chấm nhỏ, bề mặt khơ + + + 90 GL2-8 To, màu trắng, bề mặt nhẵn, mép cƣa + + + 91 ML1-3 Khuẩn lạc màu vàng chanh, bề mặt khô, mép gọn + + + 92 ML1-4 Trắng đục, bề mặt khơ, có nhiều nếp nhăn với sóng to, mép gọn + + + 93 ML1-5 Khuẩn lạc nhẵn, màu trắng, bề mặt khơ, mép xù + + + 94 RRM11 tròn, bề mặt khơ, màu trắng, mép xù + + + 95 RRM12 To, màu trắng đục, mép xù sì, nhăn + + + 96 RRM13 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 97 RRM2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 98 RRM31 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 99 RRM32 ovan, màu trắng, bề mặt khơ, mép gọn + + + 100 RRM4 Tròn, màu kem bề mặt nhăn, lồi + + + 101 RRM52 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 102 RRM53 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 103 RRM54 Nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 104 RRM8 To, màu trắng sáng, bề mặt khô + + + 105 TB1-1 Tròn, màu kem nâu cà phê khuẩn lạc già, bề mặt nhăn, lồi + + + 106 TB1-2 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 107 TB2-1 Trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 108 TB2-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 109 TH1-1 Nhỏ, trắng, bề mặt khô, mỏng mọc sát thạch, mép gọn, có nếp nhăn + + + 110 TH1-2 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 111 TH2 tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, sóng to + + + 112 TH5-1 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, lồi + + + 113 TH5-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 114 TR1 To, tròn, trắng, mép xù + + + 115 TR4-1 Bề mặt khô, màu trắng trong, nhiều nếp nhăn + + + 116 TR4-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + 117 TR4-3 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 118 TR5-1 Tròn, màu trắng đục, mép cƣa, có viền tâm + + + 119 TR5-2 Tròn, màu vàng, bề mặt nhẵn bóng + + + 120 TR5-3 Nhỏ, màu trắng, bề mặt khô, mép lan + + + 121 TT2-1 nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 122 TT2-10 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 123 TT2-2 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khô, mép gọn + + + 124 TT2-3 Nhỏ, bề mặt khơ, bóng, có mép hình cƣa + + + 125 TT2-4 nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 126 TT2-5 To, tròn, trắng, mép xù + + + 127 TT2-6 To, màu trắng, ánh nâu đỏ, mặt bóng, bề mặt có nếp nhăn + + + 128 TT2-7 To, tròn, trắng, mép xù + + + 129 TT2-8 Nhỏ, trắng đục, bề mặt khơ, mép có hình cƣa màu trong, xù + + + 130 TT2-9 Tròn, màu trắng, bề mặt nhăn, khơ, mép gọn + + + PHỤ LỤC II Hoạt tính hàm lƣợng α amylase chủng chọn lọc Ký hiệu chủng Hoạt tính amylase (U/ml) Hàm lƣợng protein tiết (µg/ml) Tỷ lệ hoạt Tỷ lệ hoạt tính tính amylase amylase Hoạt tính Hàm lƣợng hàm Ký hiệu hàm amylase protein tiết lƣợng chủng lƣợng (U/ml) (µg/ml) protein protein tiết tổng tiết tổng số, U/mg số, U/mg CN1-1 5,70±0,40 1441,64±6,11 3,95 D9-11 6,28±0,67 1085,19±4,64 5,79 CN1-2 2,53±0,76 1553,18±6,14 1,63 D9-12 2,79±0,59 1293,53±5,53 2,16 CN1-3 3,51±0,52 1179,57±13,10 2,98 D9-13 7,33±0,57 1617,70±6,92 4,53 CN1-5 6,93±0,21 1368,06±15,38 5,07 D9-14 3,93±0,43 1690,31±7,23 2,33 CN1-6 1,52±0,47 1167,37±12,96 1,30 DP1-1 8,01±0,65 1412,87±4,76 5,67 CN2-1 2,24±0,92 1631,07±18,11 1,37 DP1-2 7,81±0,65 1770,99±7,57 4,41 CN2-7 6,50±0,56 1269,36±14,09 5,12 DP2 3,82±0,54 1348,03±4,05 2,83 CN2-8 8,41±0,37 1750,91±19,44 4,80 DP3 7,58±0,98 1591,55±3,81 4,76 CN3-1 3,40±0,27 1171,43±13,01 2,90 DP4 3,90±0,65 1347,41±5,76 2,89 CN3-2 6,50±0,44 1540,13±17,10 4,22 DP5 4,01±0,27 1879,92±8,04 2,13 CN3-7 4,48±0,44 1285,33±14,27 3,49 DA23 14,23±0,92 1563,87±6,69 9,10 CN3-8 5,31±0,36 1548,03±16,08 3,43 DA24 11,23±0,52 1445,53±6,18 7,77 D1-1 5,64±0,15 1220,24±13,55 4,62 GL1-1 5,34±0,7 1069,05±4,57 5,00 D1-2 2,53±0,32 1232,45±13,68 2,05 GL1-2 6,89±0,5 1190,08±5,09 5,79 D1-17 6,97±0,33 1215,86±16,83 5,73 GL1-4 7,86±0,55 1274,79±5,45 6,17 D1-33 8,54±0,21 1532,45±13,68 5,57 GL1-5 11,24±0,79 1303,03±5,57 8,63 D1-35 3,14±0,31 1476,50±16,39 2,13 GL1-7 3,66±0,26 1625,76±6,95 2,25 D2-1 6,21±0,26 1675,81±18,61 3,71 GL1-8 4,9±0,92 1133,59±4,58 4,32 D2-2 8,61±0,1 1830,37±20,32 4,70 GL2-1 5,82±0,84 1420,02±6,07 4,10 D2-7 3,98±0,33 1460,23±16,21 2,73 GL2-2 10,61±1,2 1573,32±6,73 6,74 D2-8 10,21±0,25 1479,20±17,53 6,90 GL2-3 11,83±0,69 1504,74±6,44 7,86 D2-9 3,50±0,36 1374,51±9,71 2,55 GL2-4 1,97 3,17±0,57 1609,63±6,88 D2-10 4,39±0,27 1696,14±18,83 2,59 GL2-6 5,09±0,78 1940,43±8,30 2,62 D2-11 7,70±1,13 1754,09±17,25 4,39 GL2-7 4,48±0,89 1936,39±8,28 2,31 D2-12 3,90±0,26 1651,40±18,33 2,36 GL2-8 6,34±0,47 1435,31±5,71 4,42 D2-13 10,33±0,5 1618,87±17,97 6,38 ML1-3 8,55±0,74 1433,59±4,85 5,96 D2-15 5,35±0,56 1600,17±6,99 3,34 ML1-4 4,92±0,67 1641,90±7,02 3,00 D2-17 4,49±0,56 1517,19±6,62 2,96 ML1-5 5,18±0,59 1276,27±4,18 4,06 D2-20 8,65±0,61 1845,18±8,49 4,69 RRM1-1 3,65±0,47 1084,33±4,21 3,37 D2-22 2,48±0,56 1145,80±5,00 2,16 RRM1-2 7,97±0,51 1675,41±3,74 4,76 D3 4,65±0,65 1402,62±6,12 3,32 RRM1-3 5,34±1,31 1355,24±3,66 3,94 D4 2,07±0,96 1328,49±4,05 1,56 RRM2 10,52±1,21 1504,74±6,44 6,99 D5-2 14,12±0,99 1520,47±7,51 9,29 RRM3-1 10,38±1,01 1584,57±6,35 6,55 D6 10,09±0,67 1473,73±6,44 6,85 RRM3-2 11,33±0,59 1475,03±7,59 7,68 D6-1 7,62±0,62 1343,35±5,87 5,67 RRM4 12,84±0,74 1608,76±6,88 7,98 D6-3 2,25±1,03 1031,22±4,50 2,18 RRM5-2 8,59±0,45 1242,52±5,31 6,91 D6-6 5,28±0,17 1210,10±4,19 4,36 RRM5-3 7,59±0,68 1702,41±7,28 4,46 D6-8 3,14±0,77 1213,91±3,55 2,59 RRM5-4 11,00±0,71 1488,60±6,37 7,39 D6-9 3,07±0,45 1173,46±5,12 2,62 RRM8 10,76±0,79 1549,11±6,62 6,95 D6-10 7,53±0,31 1841,18±8,04 4,09 TB1-1 10,05±0,66 1380,96±6,76 7,28 D6-11 6,43±0,08 1248,53±5,45 5,15 TB1-2 7,94±0,42 1473,08±4,59 5,39 D6-12 8,53±0,23 1054,92±4,61 8,09 TB2-1 5,75±0,39 1511,34±7,75 3,80 D6-14 3,87±0,14 1036,39±4,09 3,73 TB2-2 5,70±0,92 1334,67±3,14 4,27 D6-19 10,61±0,46 1556,71±6,80 6,82 TH1-1 6,28±0,86 1054,21±4,51 5,96 1536,68±5,4 5,31 TH1-2 11,03±0,78 1889,16±8,08 5,84 D7-1 6,48±0,13 1260,38±5,50 5,14 TH2 7,84±0,68 1379,23±3,76 5,68 D7-4 11,03±0,25 1529,35±6,68 7,21 TH5-1 6,22±0,33 2119,67±9,07 2,93 D7-5 11,49±0,36 1805,62±7,88 5,81 TH5-2 7,1±0,56 1932,36±8,26 3,67 D7-6 8,90±0,72 2086,15±9,11 4,27 TR1 3,63±0,65 1311,10±5,61 2,77 D7-10 5,22±0,62 1608,07±7,02 3,25 TR4-1 12,72±0,86 1658,04±7,09 7,67 D7-11 4,90±0,46 1149,75±5,02 4,26 TR4-2 8,50±0,3 1488,60±6,37 5,71 D8-1 4,09±0,77 1683,53±2,98 2,43 TR4-3 10,74±0,71 1590,93±5,52 6,75 D7 8,16±0,15 D8-2 4,61±0,44 1879,45±3,76 2,45 TR5-1 8,60±0,4 1698,38±7,26 5,06 D8-4 9,55±0,58 1658,04±7,09 5,76 TR5-2 11,79±0,61 1562,93±7,54 7,54 D8-5 12,82±1,03 1441,92±6,17 8,89 TR5-3 10,27±0,69 1460,36±6,25 7,03 D8-6 4,25±0,85 1508,77±6,45 2,82 TT2-1 4,04±0,37 1137,63±4,87 3,55 D8-11 5,94±0,74 1078,59±3,33 5,51 TT2-2 12,23±0,48 1764,86±5,41 6,93 D8-12 2,95±0,62 1024,68±4,38 2,88 TT2-3 2,71±0,71 1016,60±4,35 2,67 D9 3,61±0,56 1097,29±4,69 3,29 TT2-4 3,54±0,63 1101,33±4,71 3,21 D9-1 11,18±1,05 1469,30±6,28 7,61 TT2-5 4,18±0,71 1637,86±7,00 2,55 D9-2 3,83±0,59 1444,22±6,18 2,65 TT2-6 8,98±0,63 1415,99±6,06 6,34 D9-3 3,99±0,32 1149,73±4,92 3,47 TT2-7 5,90±0,78 1391,78±5,95 4,24 D9-4 11,15±0,99 1615,99±6,06 6,90 TT2-8 9,66±0,63 1658,34±7,09 5,83 D9-5 9,46±0,57 1359,51±5,81 6,96 TT2-9 5,60±0,68 1407,69±3,88 3,98 D9-7 10,17±0,79 1767,16±5,42 5,75 TT2-10 4,71±0,44 2129,44±9,96 2,21 PHỤ LỤC III Kết thử kit API 50 CHB số chủng vi khuẩn chọn lọc PHỤ LỤC IV ĐIỂM XỬ LÝ PHÂN CẮT CỦA CÁC ĐOẠN SP Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng DA23 Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng D5-2 10 Trình tự nucleotide, protein vị trí phân cắt peptide tín hiệu gen α-amylase chủng CN1-5 11 PHỤ LỤC V PHÂN TÍCH PROTEIN THEO LOWRY Phƣơng pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden- photphovonphramat (thuốc thử Folin- ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bƣớc sóng 750nm Cƣờng độ màu hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định đƣợc hàm lƣợng protein mẫu nghiên cứu Dung dịch dùng cho phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Lowry + Dung dịch A: 2,85g NaOH 14,31g Na2CO3 pha 500ml nƣớc cất + Dung dịch B: 1,42g CuS04.5H2O pha 100ml nƣớc cất + Dung dịch C: 2,85g Na2 Tartrate.2H2O pha 100ml nƣớc cất + Dung dịch D (Lowry solution; 0,7mL/mẫu): trộn dung dịch A, dung dịch B, dung dịch C theo tỉ lệ 100:1:1 + Dung dich E: Thuốc thử folin (0,1 ml/mẫu): 5ml thuốc thử Folin - Ciocalteu’s Phenol + 5ml nƣớc đề ion DUONG CHUAN PROTEIN 0.45 0.4 y = 0.0021x - 0.0084 R2 = 0.9953 0.35 0.3 0.25 OD 0.2 0.15 0.1 0.05 -0.05 Linear (OD) 50 100 150 200 Đồ thị đƣờng chuẩn protein 12 250 PHỤ LỤC VI PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BẰNG DNSA Nguyên tắc phản ứng: Phƣơng pháp dựa nguyên tắc có mặt nhóm carbonyl tự (C=O) Phản ứng ơxi hóa nhóm chức aldehyt có mặt glucose nhóm ketone fructose 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) bị khử thành 3-amino,5-nitrosalicylic acid dƣới điều kiện môi trƣờng kiềm Màu phản ứng phụ thuộc vào xác lƣợng đƣờng khử dung dịch Nồng độ chất bổ sung mẫu thí nghiệm đƣờng khử Tên đối Thể tích dịch Thể tích dịch tinh bột Đệm/nƣớc tƣợng mẫu enzyme (ml) đệm (ml) cất DNSA (ml) Đối chứng 0 Đối chứng 0.5 0.5 Đối chứng 0.5 0.5 Mẫu 0.5 0.5 Thể tích Duong chuan glucose y = 5.3486x + 0.0619 R2 = 0.9934 30 25 20 15 10 0 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose 13 PHỤ LỤC VII CHUẨN BỊ CÁC DUNG DỊCH NGHIÊN CỨU Pha IPTG: + 1.2g IPTG pha vào 50ml nƣớc sau lọc qua filter-sterilise bảo quản 4ºC 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside (2ml): + 100mg X-Gal hòa 2ml N, N’-dimethylformamide Bảo quản 20ºC, tránh ánh sáng TE (Tris/EDTA) buffer pH 8.0 : + Tris/HCl pH 8.0 10mM EDTA pH 8.0 10mM 10% SDS (sodium dodecyl sulphate): + 10g SDS 100ml nƣớc deion khử trùng bảo quản nhiệt độ phòng CTAB/NaCl + Cân 10% cetyltrimethylammonium bromide 0.7 M NaCl bổ sung nƣớc đến 100ml Dung dịch A Tách chiết DNA tổng số + 567 µl 1xTE, 30 µl SDS 10% µl proteinase K 20 mg/ml Tách plasmid E.coli + Sol I: 50mM glucose, 25mM Tris – HCl (pH 8), 10mM EDTA(pH 8) + Sol II: 0.2N NaOH, 1% SDS + Sol III: 60.0 ml potassium acetate 5M; 11.5 ml acetic acid; H2O, 28.5 ml Tách chiết DNA plasmid Bacillus + SET: 25% sucrose, 50mM EDTA, 50mM Tris – HCl pH + Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS 14 LOCUS KU214590 366 bp DNA linear BCT 17MAY-2016 DEFINITION Bacillus licheniformis strain DA23 alpha amylase gene, partial cds ACCESSION KU214590 VERSION KU214590.1 KEYWORDS SOURCE Bacillus licheniformis ORGANISM Bacillus licheniformis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus REFERENCE (bases to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus sp d5-2 and bacillus sp da23 isolated from soil JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 366) AUTHORS Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 366 /organism="Bacillus licheniformis" /mol_type="genomic DNA" /strain="DA23" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1402" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" CDS >366 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80847.1" /translation="MKQQKRLYARFCCRLLFALIFLLPHSAAAAANLKGTLMQYFEWY MPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGT VRTKYGTKGELQSAIKSLHT" ORIGIN atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttttgctgcc gcctgttatt tgcgctcatc 61 ttcttgctgc ctcattctgc agcagcggcg gcaaatctta aagggacgct gatgcagtat 121 tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa cattggaagc gcttgcaaaa cgactcggca 181 tatttggctg aacacggtat tactgccgtc tggattcccc cggcatataa gggaacgagc 241 caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa 301 gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt 361 catacc // 15 LOCUS MAY-2016 DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM KU214591 352 bp DNA linear BCT 17- Bacillus cereus strain CN1-5 alpha amylase gene, partial cds KU214591 KU214591.1 Bacillus cereus Bacillus cereus Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus; REFERENCE AUTHORS TITLE sp d5-2 JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL Quoc FEATURES source CDS Bacillus cereus group (bases to 352) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus and bacillus sp da23 isolated from soil Unpublished (bases to 352) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Direct Submission Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam Location/Qualifiers 352 /organism="Bacillus cereus" /mol_type="genomic DNA" /strain="CN1-5" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1396" /country="Viet Nam" /collection_date="31-Oct-2010" /collected_by="Da, N T" >352 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80848.1" /translation="MFKKVTIVGLSVVMFLPSIYEGSKAYADTVNNGTLMQYFEWYAP NDGNHWNRLRTDVENLAEKGITSVWIPPAYKGTTQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVR TKYGTKAQLKSAIDA" ORIGIN atgtttaaaa aagtaacaat agtcggattg tcggttgtta tgtttttacc tagtatatat 61 gaggggagta aagcatatgc agacacagtt aacaatggaa cgttaatgca gtattttgag 121 tggtatgctc cgaatgatgg gaatcattgg aatcgtttgc gtactgatgt tgaaaattta 181 gcggaaaaag gaattacatc tgtttggata ccacctgcat ataaaggaac tacgcaaaat 241 gacgtaggat atggagcata tgatttatat gatctggggg aattcaatca aaagggcaca 301 gtgcggacga aatatgggac gaaagcacaa ttgaaatctg caattgacgc tt // 16 LOCUS MAY-2016 DEFINITION cds ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM Bacillus REFERENCE AUTHORS TITLE sp d5-2 JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL Quoc FEATURES source CDS KU214589 397 bp DNA linear BCT 17- Bacillus subtilis strain D5-2 alpha amylase gene, partial KU214589 KU214589.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; (bases to 397) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Signal peptide sequences of alpha amylase gene of bacillus and bacillus sp da23 isolated from soil Unpublished (bases to 397) Da,N.T.Man T.D, Thoa, N.K Direct Submission Submitted (01-DEC-2015) Biomaterial, IBT, VAST, 18, Hoang Viet, Cau Giay, Ha Noi 084, Viet Nam Location/Qualifiers 397 /organism="Bacillus subtilis" /mol_type="genomic DNA" /strain="D5-2" /isolation_source="soil" /db_xref="taxon:1423" /country="Viet Nam" /collection_date="22-Nov-2010" /collected_by="Da, N T" >397 /EC_number="3.2.1.1" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="alpha amylase" /protein_id="AND80846.1" /translation="MFKKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLSGPAAANAETANKSNKVTA SSVKNGTILHAWNWSFNTLTQNMKDIRDAGYAAIQTSPINQVKEGNQGDKSMRNWYWL YQPTSYQIGNRYLGTEQEFKDMWQPRIKYG" ORIGIN atgtttaaaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgccggatt tttattgctg 61 tttcatttgg ttttgtcagg cccggcggct gcaaacgctg aaactgcaaa caaatcgaat 121 aaggtgaccg cgtcatcggt caaaaacggg accatccttc atgcatggaa ttggtcgttc 181 aatacgttaa cacaaaatat gaaagatatt cgtgatgcgg gctatgcagc cattcagacg 241 tctccgatta accaagtaaa ggaagggaac caaggagata aaagcatgag gaactggtac 301 tggctgtatc agccgacatc gtaccaaatc ggcaaccgtt acttaggcac tgaacaagaa 361 tttaaggaca tgtggcagcc gcggataaag tatggcg // 17 ... đề tài: Sàng lọc nghiên cứu ảnh hưởng đột biến điểm peptide tín hiệu đến khả tiết α-amylase tái tổ hợp Bacillus subtilis Mục tiêu nghiên cứu: - Có đƣợc sở dự liệu trình tự peptide tín hiệu gene... 4.3 SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN TRONG B subtilis 168M 107 4.4 NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT... α-amylase ngoại bào cao - Tách trình tự peptide tín hiệu gen α-amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến thay peptide tín hiệu đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo chủng tái tổ hợp với peptide tín hiệu