Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis

MỞ ĐẦU Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ. Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu nhận. Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men. Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase. Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis”

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ ĐÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT α – AMYLASE TÁI TỔ HỢP TRONG

BACILLUS SUBTILIS

Hà Nội, 2017

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 3

1.1.1 Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes 3

1.1.2 Quá trình tiết protein ở E coli 3

1.1.3 Quá trình tiết protein trong Bacillus 4

1.1.4 Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P 16

1.2 HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT 18

1.2.1 Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme 18

1.2.2 Hệ thống biểu hiện ở Bacillus 20

1.2.3 Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis 20

1.2.4 Hệ biểu hiện ở E coli và vi sinh vật khác 21

1.3 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis 22

1.3.1 Lựa chọn promoter 23

1.3.2 Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis 24

1.3.3 Chọn trình tự peptide tín hiệu 25

1.3.4 Đột biến peptide tín hiệu 25

1.3.5 Sử dụng chủng chủ đã được cải biến di truyền 28

1.4 α - AMYLASE 29

1.4.1 Cấu trúc của α – amylase 29

1.4.2 α-Amylase từ Bacillus 30

1.4.3 α-Amylase từ các vi sinh vật khác 32

1.4.4 α-Amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật 35

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID 38

2.1.1 Các chủng dại 38

2.1.2 Chủng chủ dùng trong nghiên cứu 38

2.1.3 Plasmid 39

2.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG 40

2.2.1 Môi trường nuôi cấy 40

2.2.2 Chất bổ sung 40

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 41

2.3.1 Thiết bị 41

2.3.2 Hóa chất và Kit 41

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.4.1 Phân lập chủng 42

2.4.2 Phương pháp xác định hoạt tính α – amylase 42

2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry 43

2.4.4 Phương pháp thu amylase trong tế bào 43

2.4.5 Phương pháp phân loại chủng chọn lọc 44

2.4.6 Phương pháp tách chiết DNA 44

2.4.7 Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ 46

2.4.8 Kỹ thuật PCR 46

2.4.9 Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA 49

2.4.10 Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation) 50

2.4.11 Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu 50

2.4.12 Phương pháp megaprimer 50

2.4.13 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose 52

2.4.14 Phương pháp điện di DNA 52

2.4.15 Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp 53

2.4.16 Điện di SDS – PAGE 54

2.4.17 Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid 55

2.4.18 Xử lý số liệu 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ

NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƯỜNG 56

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase 56 3.1.2 Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính

amylase cao 57 3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng 59 3.2 PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC 62 3.3 SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE 67 3.3.1 Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích 70 3.3.2 Tạo vector mang tổ hợp gen đích 72 3.3.3 Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ B subtilis 168M 75 3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƯỢC THIẾT KẾ 83 3.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA CHỦNG TÁI TỔ HỢP 91 3.5.1 Xác định động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng 168MpHVC1 91 3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 92 3.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng 168MpHVC1 93 3.5.4 Ảnh hưởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 95

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 97

4.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN 97 4.1.1 Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase 97 4.1.2 Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn 98

4.1.3 Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit

amin trong trình tự này với quá trình tiết protein 101 4.2 KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC NHAU 105 4.3 SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

BIỂU HIỆN TRONG B subtilis 168M 107

4.4 NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH CỦA CHÚNG 113 4.5 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME 119

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 123 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN LUẬN ÁN 125

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BLAST Basic local alignment search tool

CTAB hexadecyltrimethyl ammonium bromide

ER Mạng lưới nội chất/ endoplasmic reticulum

GRAS Generally recognized as safe – được coi là an toàn

SRP Signal recognition particle

TAT/P Twin-arginine translocation pathway

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G+ và G- theo

Sec/P 9

Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P 10

Bảng 1.3 Một số enzyme có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng 19

Bảng 2.1 Các mẫu đất và ký hiệu sử dụng khi nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Các chủng chủ trong nghiên cứu 38

Bảng 2.3 Các plasmid đặt theo hãng sử dụng trong nghiên cứu 40

Bảng 2.4 Các chất bổ sung sử dụng cho môi trường chọn lọc 41

Bảng 2.5 Các primer sử dụng trong nghiên cứu 47

Bảng 3.1 Số lượng khuẩn lạc phân lập trên môi trường LB tinh bột 56

Bảng 3.2 Hoạt tính và hàm lượng α- amylase của một số chủng chọn lọc 60

Bảng 3.3 Đặc điểm của các peptide tín hiệu chọn lọc 66

Bảng 3.4 Các thành phần của tổ hợp Megaprimer 68

Bảng 3.5 Hoạt tính tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp 77

Bảng 3.6 Các plasmid thiết kế 80

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các peptide tín hiệu khác nhau lên khả năng biểu hiện và tiết protein của α-amylase B licheniformis 3BT2 81

Bảng 3.8 Đặc điểm của các peptide tín hiệu đột biến 84

Bảng 3.9 Thành phần của plasmid mang tổ hợp gen đột biến 85

Bảng 3.10 Khả năng tiết α - amylase và protein tổng số của các chủng tái tổ hợp 87

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng 168MpHVC1

94 94 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn C lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 95

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn N lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1 96

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các con đường tiết protein của vi khuẩn 5

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B subtilis 6

Hình 1.3 Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B subtilis 22

Hình 2.1 Các vector sử dụng trong nghiên cứu……… 39

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp Megaprimer tạo tổ hợp gen giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen đích 51

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm tạo tổ hợp promoter - signal – mature 3BT2 amylase gen bằng T4-lygase từ Pgrac và tổ hợp gen đích đã phân lập 52

Hình 3.1 Hoạt tính amylase của một số chủng sàng lọc 58

Hình 3.2 Hình thái tế bào và hình ảnh một số khuẩn lạc Bacillus phân lập 58

Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA của một số chủng nghiên cứu 60

Hình 3.4 Cây phát sinh loài của các chủng chọn lọc 61

Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm gen mang peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu 63

Hình 3.6 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng DA23 64

Hình 3.7 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng D5-2 64

Hình 3.8 Điểm phân cắt trong peptide tín hiệu gen α-amylase của chủng CN1-5 64

Hình 3.9 Hình ảnh logo trình tự peptide tín hiệu của các chủng nghiên cứu 65

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide của ba peptide tín hiệu chọn lọc 65 Hình 3.11 So sánh trình tự protein mã hóa cho SP của cả ba chủng nghiên

Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn mature gen α amylase của chủng

3BT2, các đoạn peptide tín hiệu quan tâm, sản phẩm megaprimer giữa peptide tín hiệu quan tâm và đoạn gen trưởng thành của α – amylase 3BT2 71

Hình 3.15 Sản phẩm tách DNA plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI và

XbaI của các dòng mang đoạn sản phẩm megaprimer DASsub3BT2Mature trong pTZ57R/T 71

Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại các gen quan tâm 71

Hình 3.17 Sơ đồ thí nghiệm tạo vector pHVgracAmy mới từ vector pHV33

gốc 74

Hình 3.18 Điện di đồ DNA plasmid pHVSusig5.2 tách dòng và xử lý EcoRI 75

Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính cũng như khả

năng sinh tổng hợp enzym của chủng B subtilis 168M mang

vector pHV33-promoter Pgrac - α-amylase 3BT2 78

Hình 3.20 Ảnh hưởng của promoter lên khả năng tiết enzym của chủng tái

tổ hợp 78

Hình 3.21 So sánh biểu hiện tiết α-amylase các peptide tín hiệu khác nhau 82 Hình 3.22 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng 82

hợp amylase của chủng 168MSusigD52

Hình 3.23 Sơ đồ cấu trúc và trình tự axit amin 3 vùng trên SP gen α

-amylase chủng D5-2 84

Hình 3.24 So sánh trình tự axit amin của các peptide đột biến 85

Hình 3.25 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn peptide tín hiệu mang

Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và

sinh amylase của chủng 168MpHVC1 93

Hình 3.31 Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết α - amylase của

chủng tái tổ hợp B subtilis 168MpHVC1 94

MỞ ĐẦU

Protein là sản phẩm của gene, được sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dược phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein được tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, được biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cường quá trình biểu hiện protein được ở mức độ cao Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp Các protein ngoại bào được vi sinh vật tiết ra môi tường theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình

tự peptide tín hiệu Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cường khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã được quan tâm nghiên cứu

Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên được thu nhận Thị trường tiêu thụ enzyme thế giới ước tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%) Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase được biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp như: thực phẩm, rượu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dược phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm như trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc,

vi khuẩn…Trong đó, được quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus

vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trường và có

thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lượng phân tử của enzyme Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trường cũng như tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo được chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cường biểu hiện hoạt tính α–amylase

Với mong muốn xây dựng được hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus

dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi

Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và

nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis”

Mục tiêu nghiên cứu:

- Có được cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các

chủng thuộc chi Bacillus

- Tạo được hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng

tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp

1 Nội dung luận án:

- Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào

cao

- Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc

- Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã được đột biến định hướng

- Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng

có khả năng tiết α-amylase cao

- Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu được

2 Những đóng góp mới của luận án

- Đã xác định được dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α amylase từ 3

chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam

- Tạo được các đột biến điểm và xác định được đột biến A31V giúp tăng cường tiết

α - amylase trong Bacillus subtilis

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT

1.1.1 Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes

Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đường vận chuyển một đường qua SRP trung gian và một con đường độc lập khác Vận chuyển protein qua SRP trung gian vẫn chưa được mô tả rõ ràng nhưng phức hợp vận chuyển

protein của S cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63,

và 2 protein phát hiện thêm gần đây Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nước liên kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tương tự như TRAM trong tế bào động vật có vú nhưng trình tự của Sec61 không có bất kỳ điểm tương đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tương đồng với

protein SecY ở E coli (Simonen & Palva, 1993)

Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú

và trong S cerevisiae, các peptide tín hiệu được loại bởi SPase Hai phức hợp chuỗi

các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tương đồng với Sec11 (YaDeau et al., 1991) Trong khoang lưới nội chất của ER của cả tế bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết

BiP của S cerevisiae (Kar2) tương tác với protein trong bước sớm quá trình vận

chuyển protein qua màng BiP rất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993)

1.1.2 Quá trình tiết protein ở E coli

Trong E coli, khoảng 50% protein của tế bào được tiết ra ngoài môi trường

với hơn 90% protein được vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al., 2013) Các SP được cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết như: SecB, GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính Liên kết của SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chưa thể hiện chức năng GroEL, DnaK, và

DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E coli ngoài vai trò trong quá trình

tiết protein Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết được vận chuyển đến màng tế bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực đối với với phần protein trưởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993) Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển vận qua màng Một số protein trên màng

SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E coli Chuỗi

polypeptide có thể trượt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E Phần xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển Chức năng của

2 protein SecD và SecF trên màng chưa được biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới được vận chuyển lên periplasmic tương tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993)

1.1.3 Quá trình tiết protein trong Bacillus

1.1.3.1 Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus

Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình được biết đến

là khác so với E coli, S cerevisiae và động vật có vú Tế bào của Bacillus được bao

quanh bởi màng tế bào chất, được bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm) bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu H.H., 2001) Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đường tiết protein được biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dương đó là: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đường

Pseudopillin (Com pathway) Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công

bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng

et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara

et al., 1993) Các con đường tiết protein trong Bacillus cũng như các enzym phân

cắt tín hiệu tham gia trong các con đường này được thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế tiết được thể hiện trên hình 1.2

Hình 1.1 Các con đường tiết protein của vi khuẩn

(Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004)

Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein Protein Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ tương tác với SecA nhờ các liên kết với SP Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA được đưa tới vị trí màng tế bào và tương tác với các yếu tố protein vận chuyển trên màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG Sau đó,

SP sẽ được phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor protein được đưa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lượng

ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA

và TepA, các exoprotein sẽ được vận chuyển qua màng tế bào do đó nó được điều khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và được tăng cường tạo ra nhờ xúc tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào BdbB và BdbC là các protein tham

gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein Một số protease ở thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn định hoạt tính của một số exoprotein

Hình 1.2.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B subtilis

(Nguồn: Brockmeier, 2006)

1.1.3.2 Đích vận chuyển protein trong Bacillus

Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể được giữ lại trong tế

-bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ được vận chuyển qua CM vào thành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trường nuôi cấy (Tjalsma et al., 2000a) Thông qua các con đường tiết khác nhau sản phẩm protein có thể được tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy (như trong: Sec/P, Tat/P, ABC transporter), có thể là tồn tại ở mặt bên của màng tế bào (Sec/P, Com) và cũng có thể nằm trên thành tế bào (Sec/P) (Tjalsma et al., 2000a, 2004; Brockmeier, 2006)

Đối với chi Bacillus, các protein chủ yếu được tiết theo Sec/P-SRP

Trong quá trình vận chuyển, các protein thiếu các tín hiệu vận chuyển sẽ được giữ lại trong tế bào chất và được gấp cuộn cần hoặc không cần sự có mặt của các chaperone và đại diện cho nhóm này như các protein: GroEL-GroES và DnaK-DnaJ-GrpE (Tjalsma et al., 2000; Chu., 2001)

Thành tế bào của B subtilis tương tự như periplasm ở vi khuẩn Gram âm và

nó chiếm khoảng 9% tổng khối lượng của protein tế bào và các protein được giữ lại trong thành tế bào bao gồm các enzyme như: DNases, Rnases (Merchante, et al., 1995), protease (Margot & Karamata, 1996, Msadek, et al., 1998), enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan (penicillin-binding protein) và các hydrolases có liên quan đến quá trình tăng trưởng tế bào, phân chia tế bào, sự hình thành bào tử, và sự nảy mầm (Tjalsma, et al., 2000) Hầu hết các protein được vận chuyển qua màng tế bào chất đều được tổng hợp với một SP Giống như các vi

khuẩn Gram dương khác, B subtilis thiếu lớp màng ngoài nên nhiều protein được

tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy trong quá trình sinh trưởng trong đó chủ yếu là các enzyme như: proteases, lipase, carbohydrase, DNases và Rnases nhằm thực hiện vai trò giúp vsv có thể thích ứng với điều kiện môi trường bằng việc sử dụng nguồn dinh dưỡng sẵn có Ngoài các enzyme ra, một nhóm protein thứ hai được tiết là thành viên của nhóm phosphatase (PhrA và PhrK) đóng vai trò nhận biết mật độ tế bào, điều chỉnh sự phát triển và sự hình thành bào tử (Tjalsma, et.al., 2000; Chu H H., 2001) Ngược lại với các enzyme phân hủy cơ chất và các Phr protein, hầu hết các protein không được tiết, bao gồm cả các protein tham gia quá trình giống như tạo thành tế bào, liên kết cơ chất, hoặc tiết protein, đều phải được giữ lại trên màng

tế bào với đầy đủ chức năng và nhằm để ngăn việc mất hoạt tính của các protein này khi ở dạng tự do trong tế bào chất Chúng chứa các SP tương tác với màng hoặc với thành tế bào nhưng không bị phân cắt bởi các enzyme tham gia vào quá trình tiết protein Ngoài ra, một số protein tiết còn có thể hình thành lên các cấu trúc like – pilin ở trên bề mặt tế bào (Tjalsma, et al., 2000; Chu , 2001)

1.1.3.3 Vai trò của peptide tín hiệu

Các SP được biết đến gồm 5 loại và phân biệt dựa trên điểm nhận biết phân cắt bao gồm: peptide tín hiệu của con đường tiết chung (Sec/P), peptide tín hiệu Twin-arginine, peptide tín hiệu Lipoprotein, peptide tín hiệu pilin-like protein và cuối cùng là các peptide tín hiệu tham gia trong quá trình tiết bacteriocin và pheromones (Tjalsma, et al., 2000; Tjalsma, et al., 2004) Peptide tín hiệu được biết đến có ít nhất 3 chức năng chính (van Roosmalen et al., 2004): Đầu tiên, nhận biết thụ thể trong bộ máy tiết và chuyển tới bộ máy xúc tác vận chuyển protein qua màng; Thứ hai, các SP như một yếu tố quyết định cho xác định preprotein trên màng và bắt đầu di chuyển đến các vùng ưa nước ở đầu cuối C của các preprotein trong khi phần N vẫn được định vị ở phía cis của tế bào; Thứ ba, các SP có thể ức chế quá trình gấp cuộn của các protein mới hình thành vì vậy tránh được việc kích hoạt các enzyme có hại cho bộ máy tiết của enzyme bên trong tế bào và giúp cho quá trình tiết được xảy ra hoàn toàn

1.1.3.4 Peptide tín hiệu Sec/P

Quá trình vận chuyển ra bên ngoài tế bào của khoảng 300 protein thuộc chi

Bacillus chủ yếu được tiết qua Sec/P (secretory pathway) vì thế Sec/P được coi là

con đường tiết chung cho chi này (Tjalsma, et al., 2000a) Các peptide tín hiệu của con đường này luôn gồm ba vùng với chức năng riêng: vùng N (tích điện dương), vùng kỵ nước H và vùng đầu cuối C (Leite, 2011; Brockmeier et al., 2006b; Low et al., 2013) Sự khác biệt của SP ở vi khuẩn G(+) và G(-) được so sánh trong Bảng 1.1 (Dalbey&Heijne, 2002) Sec/P được xem như con đường tiết chung cho hầu hết

protein của Bacillus với bộ máy tiết tham gia gồm 5 thành phần chính: (1) Các

chaperon của tế bào chất (cytosolic chaperones); (2) Bộ máy vận chuyển (SecA, SecY, SecE, SecG, và SecDF-YajC); (3) Các enzyme phân cắt peptide tín hiệu (SPase) phân cắt SP của preprotein tạo thành đoạn trưởng thành; (4) Các enzyme phân cắt (hay còn gọi là SPase) cắt SP khỏi preprotein trên màng; (5) Các nhân tố

gấp cuộn (folding factors) Trung bình SP loại I của Bacillus dài hơn SP trong E coli từ 5 – 7 axit amin Trong vi khuẩn Gram dương, vị trí phân cắt của SPase khoảng 7 - 9 axit amin trong khi ở E coli vị trí phân cắt xảy ra tại vị trí 3 - 7 (Leite,

2011) Vị trí +1 sau điểm phân cắt của SPase thường là Ala (27%) còn lại là các axit amin khác ngoại trừ proline và cysteine (Tjalsma et al., 2000) Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P được trình bày trong bảng 1.2 (Tjalsma et al., 2000)

Bảng 1.1.So sánh sự khác biệt của các peptide tín hiệu ở G + và G - theo Sec/P STT Chỉ tiêu so sánh Gram dương Gram âm

hơn, giàu Pro/Thr

Phân cực/trung tính, kéo dài hình thành cấu trúc β, ngắn

hơn, giàu Ser/Ala

(Nguồn: Dalbey & Heijne, 2002)

Vùng N (N – region) mang điện tích dương của chuỗi preprotein trong SP theo Sec/P có chứa trung bình khoảng 1 – 5 axit amin, trong đó chứa 2 axit amin Lysine

và Arginine (Low et al., 2013; Leite, 2011) Một preprotein không mang điện tích dương vẫn được nhận biết bởi bộ máy vận chuyển tuy nhiên chúng sẽ được tiết rất chậm Vùng N sẽ tương tác với các ATPase, SecA và với các phospholipid tích điện

âm (Dalbey & Von Heijne, 2002)

Bảng 1.2 Các nhân tố tham gia vận chuyển protein theo Sec/P

Thành phần B subtilis E coli S cerevisiae

Chaperone riêng

Ffh, FtsY, scRNA CsaA (?)

Ffh, FtsY, 4.5S RNA, SecB YgjH (?)

Phức hợp SRP (gồm scR1 RNA, Srp72p, Srp68p, Srp54p, Sec65p, Srp21p, Srp14p, và Srp7p), DPα/β

Chaperone chung

GroEL, GroES DnaK, DnaJ, GrpE, yếu tố kích hoạt

GroEL, GroES DnaK, DnaJ, GrpE, yếu tố kích hoạt

Hsp70, Ydj1

Kênh chuyển vị

SecY, SecG, SecE, SecDF, YrbF

SecY, SecG, SecE, SecD/F, YajC

Sec61, Ssh1 (Sec61α),Sbh1, Sbh2 (Sec61β), Sss1 (Sec61γ) Sec62/63, Sec66/67

SurA, PpiD, RotA, FkpA, DsbA/B/C/D/E/G

CPR2, CPR4, CPR5, CPR8, FPR2, PDI, Ero1, Eug1 Kar2 (BiP),Lhs1, (Hsp70)

(Nguồn: Tjalsma et al., 2000 )

Vùng H (hydrophobic H- region) là vùng tâm kị nước có chứa khoảng 19 axit amin và có cấu trúc xoắn α được hình thành do tương tác của vùng N tích điện dương với các phospholipid tích điện âm Thông thường hai axit amin Glycine và Proline sẽ được tìm thấy nằm giữa vùng này với khoảng 60% vùng H của SP ở

Bacillus chứa Glycine ở giữa và 50% chứa Prolin hoặc Glycine ở điểm bẻ gãy cấu

trúc xoắn -7 và -4 (Tjalsma, et al., 2000., Leite, 2011) Hai axit amin này được xem

là vị trí bẻ gãy các liên kết của xoắn α và hình thành nên cấu trúc kẹp tóc tại vị trí

chèn của các SP trên màng hay trên kênh vận chuyển Vùng N và vùng H đều cần cho quá trình nhận biết SP bởi SecA (Leite, 2011)

Vùng C (carboxyl – terminal) có chứa từ 3 – 7 axit amin và phải có cấu trúc chuỗi β có chứa vị trí phân cắt bởi SPase (van Roosmalen et al., 2004) Vị trí này thường nằm ở -3 ÷ -1 (Dalbey & Von Heijne, 2002; Nielsen et al., 1997a; von Heijne & Abrahmsèn, 1989) và thông thường đặc trưng bằng các axit amin Ala-X-Ala với X là axit amin bất kỳ Vị trí -3 có thể được thay thế bằng các axit amin như: Valine, Threonine, Leucin và Isoleucin Trong các nghiên cứu về điểm nhận biết

phân cắt của SPase trên các SP trong Sec/P ở Bacillus có tới 71% là A-X-A, 18% là

V–X–A còn lại là một số axit amin khác Đặc biệt vị trí -1 của điểm phân cắt của

SPase loại I đặc trưng cho điểm phân cắt SP của preprotein trong B subtilis (van

Roosmalen et al., 2004)

Các SP loại II giống với SP loại I nhưng chứa một vùng được gọi là

“lipoprotein box” với trình tự bảo thủ Leu-Ala-Gly-Cys Trong màng tế bào chất, cystein trong trình tự này liên kết cộng hóa trị với lipid Quá trình phân cắt các lipoprotein diễn ra khi SP được phân cắt bởi SPase loại II Sau đó, nhóm acyl ( )

sẽ được liên kết với cystein

1.1.3.5 Peptide tín hiệu Tat/P (Twin Arginine Translocation pathway)

Vận chuyển protein theo Tat/P có sự tham gia của các cofactor là các ion kim loại đóng vai trò trong các phản ứng oxi hóa khử và các SP cũng được phân cắt bởi SPase I TAT/P được phát hiện trong Thylakoit và sau đó được phát hiện có mặt trong tất cả các vi khuẩn, vi khuẩn cổ (Berks et al., 2003; Kolkman et al., 2008) Ngày nay, số lượng lớn các vi khuẩn được biết có trình tự Tat mang dạng motif Z –

R - R - X– Φ - Φ, trong đó, Z có thể thay thế bằng axit amin phân cực bất kỳ và Φ đại diện cho các axit amin kỵ nước và motif này cũng phù hợp với cơ chất cắt của

hệ thống Tat trong hầu hết các Thylakoid ở thực vật (Tjalsma et al., 2004; van Dijl

et al., 2002; Tjalsma et al., 2000b)

Trong B subtilis được phát hiện có khoảng 27 protein tiết theo con đường

này Trong số đó, 14 SP có điểm nhận biết phân cắt tín hiệu bởi SPaseI, 5 SP ở lipoprotein có dạng RR-motif (một dang SP bao gồm hai Arginine tồn tại ở vùng đầu N) và 8 SP không cho thấy tồn tại điểm nhận biết phân cắt tín hiệu nào của cả SPaseI lẫn SPase II Độ dài trình tự trung bình của SP trong Tat/P dài hơn so với độ dài của SP trong Sec/P Trong procaryote, vùng N có thể chứa từ 2 – 30 axit amin, trung bình là 13 axit amin

Vùng H có thể chứa từ 13 -20 axit amin không tích điện Chiều dài vùng H trong SP của Tat/P có thể dài hơn hoặc ngắn hơn hoặc không khác nhiều so với

vùng này trong Sec/P tuy nhiên ở RR-motif trong E coli thì vùng H dài hơn và kỵ

nước hơn so với vùng H của SP trong Sec/P ở vi khuẩn Gram âm Vùng này có chứa một điểm Proline bẻ gãy cấu trúc xoắn ở vị trí -6

Vùng C chứa các axit amin cơ bản không được ưu tiên trong Sec/P và thông thường có tồn tại axit amin mang điện tích dương (Arginine or Lysine – tín hiệu tránh Sec) vì vậy không được nhận biết bởi bộ máy tiết chung theo Sec/P (Tjalsma

et al., 2000) Twin arginine có sự bảo thủ rất cao tuy nhiên trong tự nhiên cũng một

số SP của con đường này có Arginine đầu tiên có thể được thay thế bằng Lysin (Dalbey & Von Heijne, 2002) Protein được tiết theo Tat/P khi ra ngoài môi trường

đã có cấu trúc gấp cuộn trong khi đó, ở Sec/P vận chuyển protein ra màng tế bào vẫn chưa có cấu trúc này (Laskin et al., 2007) PhoD và YwbN là hai protein được

tiết theo con đường này ở B subtilis (Kolkman et al., 2008)

1.1.3.6 Peptide tín hiệu lipoprotein

Lipoprotein của vi khuẩn là nhóm protein được liên kết với màng tế bào hoặc

lớp màng ngoài bằng các liên kết lipid và chịu phân cắt bởi SPase loại II (LspA)

(Bron et al., 1998; Vitikainen, 2004; Leite, 2011; Kakeshita & Kageyama, 2004)

Các SP của lipoprotein ở B subtilis về mặt cấu trúc có sự bảo thủ hơn SP chung

trong Sec/P Con đường vận chuyển protein cho tín hiệu này có thể được tiết theo Sec/P hoặc Tat/P, tuy nhiên tồn tại 2 axit amin RR trong trình tự của SP này nên có

thể protein sẽ nghiêng về giả thuyết được tiết theo Tat/P (Tjalsma et al., 2000) Các

SP của lipoprotein của vi khuẩn được biết cũng có cấu trúc gồm 3 vùng:

Vùng N tích điện dương và trung bình có chứa khoảng 4 axit amin Vùng H giống như trong cấu trúc của SP trong Sec/P, có chứa khoảng 12 axit amin ngắn hơn so với các nonlipoprotein SP trong khi cần ít nhất 14 axit amin ở vùng H để protein có thể kéo dài trên màng qua kênh vận chuyển Vì vậy, không phải lipoprotein nào sau khi được tổng hợp cũng xuyên ra ngoài mặt của tế bào từ đó dự đoán SPase II cũng nằm trên màng cytoplamic như SPaseI (Tjalsma et al., 2000) Vùng C của SP thuộc lipoprotein ngắn hơn so với vùng C của các SP khác và axit amin Cys luôn ở cuối của điểm phân cắt và đôi khi Glycine được thay thế bởi Alanine Trong các vị trí của Leu và Ala đôi khi được thay bởi các axit amin như: Ser., Thr., Val., Ile và thậm chí cả Gln Vùng phân chứa cấu trúc gọi là “lipobox” với sự bảo thủ về điểm nhận biết SPaseII là LeuAlaGly ↓ Cys (Dalbey & Von Heijne, 2002) Cystein là đích cho lipid biến đổi và là điểm khởi đầu cho một protein trưởng thành và protein sau khi vận chuyển ra màng tế bào chất được neo trên màng bằng chính axit amin này (Tjalsma et al., 2000)

Lipoprotein trưởng thành của các vi khuẩn gram âm có axit Aspartic ở vị trí +2 để ngăn việc chuyển các protein này ra màng ngoài Tuy nhiên, axit Aspartic đã

vắng mặt ở vị trí + 2 của các lipoprotein trưởng thành ở Bacillus cho thấy tín hiệu

phân loại này đã phát triển độc lập với vi khuẩn gram âm Thay vào đó Glycine, Phenylalanine, hoặc Tryptophan có thể được tìm thấy ở vị trí +2 này trong các

lipoprotein khác nhau của B subtilis Cả 3 axit amin này đều đóng vai trò như Cys trong E coli Vì vậy, dù B subtilis không có lớp màng ngoài nhưng axit amin chức

năng vẫn được tìm thấy trong lipoprotein trưởng thành của chúng vì các axit amin này tham gia vào việc vận chuyển các lipoprotein đến vị trí cụ thể trên màng tế

bàoB subtilis (Tjalsma et al., 2000)

Chuỗi lipoprotein ở các loài Bacillus khác với chuỗi lipoprotein SP ở E coli

và ngắn hơn so với các SP khác được so sánh Tâm kỵ nước và vùng phân cắt của chúng có chiều dài tương tự nhau Chỉ có vùng đầu N của một số lipoprotein ở vi

khuẩn hình que dài hơn và tích điện dương cao hơn so với chuỗi tương tự trong

E.coli (Simonen & Palva, 1993) Cả E coli và Bacillus đều có rất nhiều các lipoprotein khác nhau đặc trưng nhất là chuỗi Braun’s lipoprotein ở E coli và trong β–lactamase của B licheniformis

1.1.3.7 Peptide tín hiệu pseudopilins

Một loại SP khác được biết có mặt trong Bacillus đó là pseudopilins hay loại

IV protein like-pilin, chịu sự phân cắt của enzyme pseudopilin-SPase ở mặt bên của

màng tế bào (ở Bacillus là protein ComC) và không phụ thuộc vào bộ máy Sec/P

Trình tự cuối của pseudopilin SP được bảo thủ với motif được xác định với trình tự axit amin -2KG-1↓F+1X3E+5(Meima & van Dijl, 2003) Điểm nhận biết phân cắt nằm giữa vùng N và vùng H Sau khi bị cắt bởi ComC vùng H sẽ gắn với các đoạn pilin

protein trưởng thành Protein ComG được mã hóa bởi các gen comGC, comGD, comGE, and comGG không tiết theo Sec/P mà được vận chuyển phụ thuộc vào việc

phân cắt ở mặt bên màng tế bào chất (phía màng trong tế bào chất) Enzyme phân

cắt tín hiệu ComC của B subtilis là một protein neo trên màng có chứa 8 vùng vận

chuyển màng và có mức độ tương đồng cao với các prepilin peptidase của nhiều vsv khác Hai protein shock lạnh là CspB và CspC cùng với 1 protein giả định YqaF cũng có thể được tiết theo con đường này (Tjalsma et al., 2000)

1.1.3.8 Peptide tín hiệu tham gia trong quá trình tiết bacteriocin và pheromone

Các SP này không được dự đoán là SP vì thiếu vùng H chỉ có vùng N và C Chúng được phân cắt tạo đoạn trưởng thành nhờ vào các transport protease của

ABC transporter (bacteriocin và pheromone) Một số loài Bacillus có khả năng sinh

kháng sinh peptide Các kháng sinh này có thể được tổng hợp ở ribosome hoặc cơ quan khác không phải ở ribosome Một số các peptide kháng khuẩn được tổng hợp ribosome chứa các SP cho sự vận chuyển qua màng nhờ nhân tố ABC chuyên dụng

Trong B subtilis, có ba SP loại này được biết đến trong bacteriocin là sublancin

168, subtilosin và pheromone ComX Trong B subtilis 168, các operon sunS - sunT

chứa gen mã hóa lantibiotic sublancin 168 và ABC transporter SunT Nhân tố vận

chuyển ABC như SunT có vai trò kép trong quá trình tiết vì vừa giúp loại bỏ các SP

và vừa vận chuyển các lantibiotic trưởng thành qua màng tế bào chất Một số

peptide kháng khuẩn khác của Bacillus như subtilin (B subtilis ATCC 6633), subtilosin, hai ericins mới được phát hiện ở B subtilis A1/3 có trình tự peptide khác

với sublancin nhưng chúng lại đều được phân cắt theo cùng một cách thức Pheromone ngoại bào ComX, protein tham gia vào việc kiểm soát mật độ tế bào, sự sao mã của các gen chức năng cũng được tiết ra nhờ nhân tố vận chuyển ABC

Ngoài ra, việc xác định tồn tại khoảng 77 nhân tố ABC transporter ở B subtilis có

thể đưa ra gợi ý rằng một vài protein không xác định có thể cũng được vận chuyển qua các hệ thống này (Tjalsma et al., 2000)

1.1.3.9 Propeptide

Một số protein tiết của vi khuẩn có chứa propeptide là một đoạn axit amin nằm giữa SP và protein trưởng thành với vai trò chủ yếu cho quá trình gấp cuộn, thể hiện hoạt tính và ổn định cấu trúc của protein Đoạn propeptide được loại bỏ khỏi các protein sau quá trình vận chuyển (Harwood & Cranenburgh, 2008) Protein tiết

trong Bacillus có thể bao gồm hai loại của propeptide dài và propeptide ngắn với

vai trò: (1) Chúng đã được đề xuất để đóng một vai trò trong quá trình tiết, mặc dù không có bằng chứng trực tiếp cho các chức năng như đã được trình bày; (2) Ngăn chặn hoạt tính thủy phân của các enzyme này trong quá trình tiết gây hại cho tế bào chủng sản nếu biểu hiện không đúng; (3) Propeptides tích điện cao sẽ giúp các protease được vận chuyển tới màng thông qua tương tác ion; (4) Một số nghiên cứu chỉ ra rằng propeptides có một vai trò quan trọng trong việc gấp và hoạt hóa các

protease sau khi vận chuyển chúng qua màng tế bào

Propeptide dài được đặc trưng trong protease của vi khuẩn và chiều dài của

nó có thể đạt được 60 – 200 axit amin và nó có khả năng tự xúc tác phân cắt và có

chứa các chaperone có hoạt tính trong nội bào, ví dụ như AprE của B subtilis (Harwood & Cranenburgh, 2008) Propeptide của subtilisin ở B amyloliquefacien chứa 77 axit amin trong khi đó protease của B subtilis (natto) có chứa 164 axit

Đoạn propeptide ngắn là các đoạn có ít hơn 60 axit amin, được phân cắt bởi

một protein chưa rõ chức năng (Kakeshita et al., 2012) và chúng có mặt trong một

số ít protein tiết ra ngoài môi trường như propeptide của α-amylase ở B subtilis (AmyE), β-lactamase ở B licheniformis (16 aa) Không có protease đặc hiệu cho sự

phân cắt các propeptides ngắn mà thay vào đó chúng có thể được phân cắt bởi một

số protease không đặc hiệu được tiết ra bởi chi Bacillus Rất ít dữ liệu đưa ra về

chức năng của các propeptides ngắn và có thể chúng không đóng một vai trò hoạt

động trong quá trình tiết Trong thực tế, tất cả các protease ngoại bào của Bacillus

được tổng hợp như preproenzymes có chứa cả một SP và một propeptide (Simonen

& Palva, 1993)

1.1.4 Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P

1.1.4.1 Peptidase phân cắt tín hiệu loại I trong Gram âm

Đặc trưng nhất của peptidase loại I trong E coli được gọi là các leader peptidase (Lep) Gen mã hóa cho SPase là gen lepB là một protein dài 323 axit amin

(35,9 kDa) với 2 vùng N (4 -28 và 58 - 76) gần với vùng tế bào chất nhỏ (axit amin

29 -57) và đứng trước vùng xúc tác C ( gồm các a.a 77- 323) Gen LepB chỉ có mặt trong E coli và cần thiết cho sự sinh trưởng và biến đổi của tế bào Sự có mặt của

SPase loại I trong nhiễm sắc thể (NST) đặc trưng cho một số vi khuẩn Gram âm

như: E coli, Haemophilus influenzae, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacte sphaeroides, Salmonella typhimurium và Yersinia pestis Có một số loài vi khuẩn Gram âm có 2 loại SPase như Pseudomonas aeruginosa, và có 3 loại SPase như Bradyrhizobium japonicum (van Roosmalen et al., 2004)

1.1.4.2 Enzyme peptidase loại I trong Bacillus và vi khuẩn Gram dương

Trong vi khuẩn Gram dương, thông thường SPase loại I được phổ biến trong

hệ thống tiết protein (Tjalsma et al., 2000) và ngày nay có rất nhiều SPase loại I được phân lập trong vi khuẩn Gram dương Đã có những phân tích về chức năng và

đặc tính sinh hóa của SPase loại I của các vi khuẩn Gram dương trong B subtilis, B cereus, B anthracis, B amyloliquefaciens, S lividans, S pneumoniae B

anthracis có chứa 6 và B subtilis có chứa 5 gen mã hóa cho SPase loại I trên NST Gen mã hóa cho SPase trong B subtilis đã được giải mã bao gồm: SipS, SipT,

SipU, SipV và SipW (van Wely et al., 2001; Fu et al., 2007; Harwood & Cranenburgh, 2008; Tjalsma et al., 1997; Song et al., 2015) Tjalsma và cộng sự đã

chứng minh SipS và SipT là hai gen quan trọng nhất trong SPase của B subtilis

trong khi SipU, SipV và SipW ít có vai trò hơn trong quá trình tiết protein (Tjalsma

et al., 1997) Trong các vi khuẩn gram dương bao gồm: Streptomyces lividans, S coelicolor, C perfringens có 4 gen mã hóa cho SPase loại I được tìm thấy bao gồm: SipW, SipX, SipY, SipZ và SipS, SipT, SipV và SipW trong B amyloliquefaciens (van Roosmalen et al., 2004) Trong L plantarum, L monocytogenes và Staphylococcus epidermidis có ba gen mã hóa cho SPase Trong khi đó, B halodurans, S aureus (spsA và spsB) và S carnosus (sipA và sipB) có hai gen mã hóa cho SPase., Streptococcus pneumoniae, S mitis, L lactis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis và Aquifex aeolicus chỉ có một gen mã hóa cho

SPase (van Roosmalen et al., 2004)

1.1.4.3 Lipoprotein peptidase

Các tín hiệu peptidase lipoprotein (Tín hiệu peptidase II) ở E coli là một

protein nhỏ có kích thước khoảng 18-kDa nằm trong CM Loại II SPase có thể được chia làm hai loại Major SPase bao gồm SipS(S), SipT(T) và Sip(P) rất cần thiết cho quá trình biến đổi tế bào Các minor SPase bao gồm SipU(U), SipV(V) và SipW(W) SipP mã hóa cho gen sinh plasmid pTA1015 và pTA1040 có mặt trong

B subtilis nato Tất cả các SPase còn lại nằm trên NST SipW là loại SPase chỉ có

trên mạng lưới nội chất, có tương đồng cao với SPase của eucaryote và vi khuẩn cổ SipP của procaryote có thụ thể gắn trên màng ở đầu N trong khi đó SipW lại có thụ

thể gắn trên đầu C B subtilis chỉ có một gen lspA mã hóa cho SPase loại II với 4

thụ thể trên màng cần thiết cho quá trình phân cắt của 114 lipoproten (Tjalsma et al., 2004; Rey et al., 2004) Tín hiệu peptidase lipoprotein của vi khuẩn gram dương

được phát hiện ở S aureus và SPase II của loài này có sự tương đồng thấp với

peptidase lipoprotein của vi khuẩn gram âm đã công bố (Dalbey & Von Heijne, 2002; Fu et al., 2007)

1.2 HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT

1.2.1 Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme

Các loài thuộc chi Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật

quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của nhóm này bao trùm hàng loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, đến sinh học phân tử, y - duợc học chữa các bệnh hiểm nghèo, chế phẩm

xử lý ô nhiễm môi truờng, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu Chính vì lẽ đó nên

đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chi Bacillus này cũng như mở rộng

ứng dụng của chúng đối với đời sống con nguời Từ đầu những năm 60 một số loài

Bacillus đã được sử dụng và cải tiến để lên men sản xuất các enzyme thủy phân

tương ứng Năm 2004, thị trường enzyme công nghiệp trên thế giới ước tính là 1,6

tỷ đô la Mỹ và có xu hướng ngày càng tăng Khoảng 50 - 60% các enzyme thương

mại được sản xuất bởi các loài thuộc Bacillus Hai trong số các enzyme chiếm vị trí

quan trọng nhất là protease kiềm (subtilisins) được sử dụng trong chất tẩy rửa gia dụng và amylase được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp có nguồn gốc từ chi

này Các enzyme được sản xuất bởi B subtilis và B licheniformis được sử dụng

rộng rãi làm chất phụ gia trong các chất tẩy rửa (bột giặt) Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 Đến năm 1963, Novo A/S đã giới thiệu acalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ

B licheniformis Đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus (Reddy et al., 2003; Maarel et al., 2002; Alkando & Ibrahim, 2011) và chủ yếu là từ B subtilis

Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp chất tẩy rửa Trong đó, hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Intematinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzyme protease từ loài này (Gupta et al., 2008)

Bảng 1.3 Một số chất có nguồn gốc vi khuẩn và ứng dụng của chúng

Sản phẩm Ứng dụng Nguồn tách chiết Vi khuẩn chủ

B.lichenifomis

B.subtilis/ lichenifomis

Glucose isomerase Chế biến tinh bột B coaluglans B coaluglans

Levansucrase Xúc tác hoạt động

Hydrolase/trasferlase B circulans B circulans

Basic peptides Kháng sinh B reviBacillus brevis B reviBacillus

brevis

endotoxin Thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis B thuringiensis

Purine nucleotides Dƣợc phẩm, nâng cao

B pumilus

B subtilis, B pumilus

Streptavidin Protein liên kết biotin Streptomyces B subtilis

(Nguồn: Brockmeier, 2006)

1.2.2 Hệ thống biểu hiện ở Bacillus

Đây là chi được sử dụng chủ yếu để thu nhận các enzyme như protease (cho công nghiệp giặt tẩy), amylase (cho công nghiệp tinh bột, chế biến bánh…) Một số

ưu điểm của việc sử dụng hệ thống biểu hiện của Bacillus trong sản xuất protein tái

tổ hợp: các loài thuộc chi này có hệ thống di truyền đặc trưng, có khả năng biến nạp cao, tốc độ sinh trưởng mạnh, không có lipopolysacharide chứa bên ngoài màng,

trao đổi chất mạnh mẽ, bộ gen của vi khuẩn B subtilis và B licheniformis đã được

giải trình tự và chúng được biết không sinh ra các nội hoặc ngoại độc tố được FDA công nhận là an toàn Các protein của các loài này lại được tiết vào môi trường lên men làm cho quá trình thu nhận dễ dàng, thu hồi sản phẩm hiệu quả và giảm chi phí

sản xuất Chủng chủ cho biểu hiện thường thuộc các loài B megaterium, B subtilis,

B licheniformis, B brevis Sản phẩm protein tái tổ hợp ở B subtilis thu được lên tới 25g/l B licheniformis là chủng chủ biểu hiện tốt nhất interleukin-3 khi được so sánh với sự biểu hiện protein này trong E coli, S cerevisiae, Kluyveromyces lactis

và tế bào động vật có vú C127 (Vitikainen, 2004; van Dijl et al., 2002) Các protein

tái tổ biểu hiện thành công trong Bacillus bao gồm interleukin-3EGF, esterase (của Pseudomonas), xylanase, naproxen esterase, amylase và rất nhiều loại protease khác

(Demain & Vaishnav, 2009)

1.2.3 Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis

Hệ gen của B subtilis bao gồm khoảng 4.2 Mb và số lượng các cặp base của loài này có hơi khác nhau B subtilis subsp subtilis RO-NN-1 là 4,011,949 bp trong khi đó B subtilis subsp BSn5 và TU-B-10T

chứa 4,207,222 bp (Earl et al., 2012) Trong đó có tới 87% gen mã hóa cho 4100 ORF (Wipat & Harwood, 1999) Các protein của các ORF này đã được 25 phòng thí nghiệm của các nước thuộc Cộng đồng châu Âu và Nhật Bản phân tích chức năng trong đó có tới 40% ORF chưa xác

định được vai trò nào đối với chính B subtilis Với đặc điểm này, nhiều gen của các

vi sinh vật khác được phiên mã và dịch mã ở B subtilis Vì vậy, chúng được sử

dụng rộng rãi làm chủng chủ để biểu hiện gen trong công nghệ DNA tái tổ hợp

1.2.4 Hệ biểu hiện ở E coli và vi sinh vật khác

1.2.4.1 Hệ biểu hiện ở E coli

E coli là chủng chủ được sử dụng sớm nhất và rộng rãi nhất trong công nghệ

sản xuất các protein tái tổ hợp Những tiến bộ ngày nay về hiểu biết di truyền trong

quá trình phiên mã, dịch mã và quá trình gấp cuộn protein trong E coli cùng với các

công cụ cải thiện di truyền đưa loài này có nhiều thuận lợi và ưu thế hơn so với hệ biểu hiện protein phức tạp trong eukaryote (Terpe, 2006) Hệ thống này có sự biểu hiện nhanh, hiệu suất thu hồi cao, dễ dàng nuôi cấy và biến đổi gen, giá thành rẻ và thu hồi sinh khối nhanh nhưng có nhiều nhược điểm: khi protein tái tổ hợp có các liên kết disulfide rất khó biểu hiện, sinh các protein không glycosyl, sinh protein cùng với nội độc tố, hình thành acetate gây độc tế bào (điều này có thể tránh được bằng cách kiểm soát mức độ oxy), protein sản xuất ở trong tế bào thường ở dạng thể vùi và để có hoạt tính cần tái gấp cuộn protein Hiệu suất thu hồi có thể đạt tới 5.5g/l α – interferone trong dịch nuôi cấy (Demain & Vaishnav, 2009) Để tăng hiệu

suất thu hồi sản phẩm, cần phải có một hệ thống promoter mạnh (có các gen lac, tac, trc) Hệ thống biểu hiện trong E coli đã được sử dụng nhằm thu các protein lạ:

phoA (alkaline phosphatase) với hàm lượng protein đạt 5.2 g/l trong periplasm, LFT (levanfructotransferase) với hàm lượng đạt 4 g/l trong môi trường, hGCSF (human granulocyte colony-stimulatory factor) với hàm lượng 3.2 g/l trong periplasm; IGF-

1 (insulin-like growth factor) với hàm lượng 2.5 g/l trong periplasm; cholera toxin

B với nồng độ 1 g/l trong môi trường (Mergulhão et al., 2005)

1.2.4.2 Hệ thống biểu hiện của vi sinh vật khác

Vi khuẩn Gram âm Ralstonia eutropha được sử dụng làm vật chủ trong công

nghệ DNA tái tổ hợp (Demain & Vaishnav, 2009; Terpe, 2006) Hệ thống biểu hiện

của loài này có nhiều ưu điểm hơn E coli Hệ thống Pfenex của Pseudomonas fluorescens có thể thu được 4 g/l TNF-α Staphylococcus carnosus có khả năng sinh tổng hợp khoảng 2 g/l protein của động vật có vú trong khi ở Streptomyces lividans

thì lượng tổng hợp này là 0.2 g/l (Demain & Vaishnav, 2009)

1.3 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis

Có năm yếu tố được biết đến có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện và tiết của

một protein lạ trong hệ thống biểu hiện của B subtilis (Hình 1.3) bao gồm: quá trình

phiên mã, sự gấp cuộn của protein, quá trình vận chuyển protein qua màng, quá trình phân cắt các peptide tín hiệu và proteolysis (sự phân hủy của protease)

Hình 1 3 Các yếu tố liên quan đến biểu hiện gen ở B subtilis

(Nguồn: Li et al., 2004) Thông qua sự hiểu biết về các yếu tố này, các nhà nghiên cứu có thể tăng

cường mức độ biểu hiện protein trong hệ thống biểu hiện ở B subtilis Để đạt được

hiệu suất tổng hợp protein cao nói chung và α-amylase nói riêng ở chủng B subtilis

tái tổ hợp, các biện pháp cơ bản sau được sử dụng như: dùng các promoter mạnh, chọn trình tự SP phù hợp cho khả năng tiết enzyme, nâng cao biểu hiện bằng việc

sủ dụng chủng chủ đã được cải biến di truyền (cắt bỏ các gen gây ảnh hưởng đến biểu hiện), tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy

1.3.1 Lựa chọn promoter

Promoter của vi khuẩn nằm ngay trước vị trí khởi đầu phiên mã và chứa hai đoạn ngắn tương đối bảo thủ, mỗi đoạn gồm 6 nucleotide cách vị trí khởi đầu khoảng 35 bp (trình tự TTGACA) và 10 bp (trình tự TATAAT) Một promoter mạnh là promoter phải có khả năng làm tăng cường mức độ biểu hiện gen Promoter

dùng cho hệ biểu hiện ở B subtilis bao gồm:

- Pspac promoter: được tạo thành từ đoạn đầu 5’ từ phage SPOI ở B subtilis

và đầu 3’ của lacZ promoter từ E coli và được cảm ứng bởi IPTG (1 ÷ 10 mM)

(Vavrová et al., 2010)

- Promoter XylR của B subtilis (Ming et al., 2010) và B megaterium

(Naturwissenschaften, 2007, 2010) cảm ứng bằng xylose dùng điều hòa biểu hiện

gen trong B subtilis cũng như E coli

- Promoter của sacB cảm ứng bằng sucrose (1 ÷ 30 mM) Rất nhiều hệ biểu hiện được thiết kế trên cơ sở của promoter sacB (Heng et al., 2005a)

- Promoter cảm ứng bằng phosphat (Qi et al., 1997)

- Promoter cảm ứng bằng citrate (Vavrová et al., 2010)

- Promoter cảm ứng tự động bao gồm các promoter cảm ứng trực tiếp mức

độ biểu hiện thấp trong pha lag và pha log và có mức độ biểu hiện cao hơn khi ở

pha nghỉ (stationary) như: aprE (Nijland & Kuipers, 2008) và gsiB (Eymann &

Hecker, 2001; Petersohn et al., 1999) Hệ thống promoter cảm ứng tự động không được dùng trong nghiên cứu cơ bản nhưng lại được dùng trong công nghiệp bởi chúng không yêu cầu chất cảm ứng Hiện nay mới phát triển thêm hệ thống cảm ứng mới rẻ hơn, an toàn hơn cho hệ thống promoter cảm ứng của công nghiệp là

- Hệ biểu hiện với vector phage như phage 105 và pBSX (ở B subtilis 168)

Hệ biểu hiện này được cảm ứng bởi nhiệt độ và được sử dụng để điều hòa biểu hiện gen rất tốt

- Promoter Pgrac với kích thước khoảng 182 bp của vector pHT43 cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus ở mức độ cao trong tế bào chất Promoter

này được xây dựng dựa trên promoter mạnh phụ thuộc σA

của operon groESL từ B subtilis dung hợp với yếu tố điều hòa lac operator (lacO) từ E coli và cảm ứng bằng IPTG của lac operator Sử dụng promoter này cho hiệu quả biểu hiện rất cao (Phan

et al., 2012; Huỳnh Kiều Thanh và cs., 2014)

Ngoài các promoter được mô tả ở trên, trong công nghiệp người ta đã thiết

kế các promoter đặc biệt cho năng suất protein ngoại bào tới 20 g/l, nhưng vì lí do thương mại mà trình tự được giữ bí mật Trong nhiều trường hợp các promoter của

chủng chủ như spoVG (promoter điều hòa sự hình thành bào tử ở Bacillus),

promoter của gen α-amylase (pAmy), promoter của gen protease… được sử dụng để biểu hiện gen α-amylase tạo sự đồng nhất giữa RNA-polymerase của chủng chủ với promoter ở vectơ tái tổ hợp (Li et al., 2004)

1.3.2 Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis

Vector biểu hiện có thể được thiết kế để tối đa hóa quá trình khởi đầu dịch

mã như có mang một trình tự RBS bảo thủ, một mã bộ ba khởi đầu ATG ở vị trí tối

ưu (cách 8 bp) về phía sau của RBS, một gene chọn lọc (thường là kháng một kháng sinh nào đó), một promoter mạnh, sau vị trí đưa gene vào là hai hay ba trình tự kết thúc phiên mã mạnh để ngăn việc phiên mã các gene khác trong plasmid Một số

plasmid nội sinh được phát hiện có mặt trong Bacillus Tuy nhiên, khi sử dụng các

plasmid này không thể lựa chọn trực tiếp các khuẩn lạc đã được biến nạp trong một

số loài thuộc chi này và không kiểm soát được chức năng của tế bào chủ bởi cấu trúc của các plasmid này chưa được làm rõ Vị vậy, các plasmid ngoại lai được sử

dụng biểu hiện trong Bacillus là pUB110, pE194, pC194, pBSMuL, pAL vector, vector cảm ứng lạnh, pHT (pHT01, pHT43), vector tích hợp NST của B subtilis

1.3.3 Chọn trình tự peptide tín hiệu

Các nghiên cứu tác động đến quá trình vận chuyển protein qua màng, đặc biệt là yếu tố SP được quan tâm hơn cả Cũng theo hướng này, Eggert và cộng sự đã đưa ra chỉ ra rằng mức độ tiết protein tái tổ hợp quan tâm phụ thuộc vào loại SP mà gen đó được gắn (Eggert et al., 2003) Sàng lọc SP để đánh giá khả năng tiết enzyme bằng cách gắn các SP quan tâm với một gen đích là đoạn gen mã hóa cho protein trưởng thành của một đối tượng enzyme quan tâm là phương pháp hữu hiệu trong sàng lọc tăng cường hoạt tính của chủng tái tổ hợp Từ đó đánh giá khả năng tiết enzyme và có thể thấy được tầm quan trọng của SP trong quá trình tiết (Brockmeier, 2006; Ying et al., 2012; Fan et al., 2011) Hiện nay, có rất nhiều các công trình nghiên cứu của các tác giả khắp nơi trên thế giới về ảnh hưởng của SP lên khả năng tiết enzyme (Itoh et al., 1990; Yarimizu et al., 2015; Nakamura & Takase, 1990; Pechsrichuang et al., 2016; Jonet et al., 2012; Borchert & Nagarajan, 1991a; Chen & Nagarajan, 1994; Brockmeier, 2006; Sakakibara et al., 1993; Song

et al., 2015; Low et al., 2013; Saengkerdsub et al., 2013; Goethe-universita, 1996)

1.3.4 Đột biến peptide tín hiệu

Enzyme là chất xúc tác sinh học cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau: hóa chất nông nghiệp, chất tẩy rửa, tinh bột, hàng dệt, chăm sóc cá nhân, bột giấy

và giấy, chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc Dựa trên việc ứng dụng của các enzyme trong quy trình công nghiệp khác nhau, rất nhiều cải tiến trong sản xuất thu hồi hồi enzyme đã được thực hiện nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình, tính kinh

tế và tính khả thi Để thực hiện được điều này các enzyme trong công nghiệp cần phải có một số cải biến nhằm đáp ứng được nhu cầu về số lượng, tính chất của enzyme Một số phương pháp có thể được cải thiện nhằm tăng lượng enzyme thu hồi như: tạo enzyme tái tổ hợp, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy hoặc có thể can thiệp vào quá trình vận chuyển protein bằng cách tác động vào một số yếu tố tham gia trong con đường tiết của enzyme quan tâm Yêu cầu việc cải thiện tính chất của enzyme trong công nghiệp như: Độ đặc hiệu bề mặt, mức biểu hiện, tính hòa tan,

tính ổn định, độ hoạt động, tính chọn lọc, hoặc độ bền nhiệt, sự dung nạp đối với các dung môi hữu cơ… Dựa trên trình tự gen, trình tự axit amin của một enzyme nhiều phương pháp được áp dụng nhằm cải thiện các đặc tính khác nhau của các enzyme mục tiêu bằng cách tạo ra các đột biến trình tự DNA mã hóa cho enzyme

đó Các phương pháp có thể được áp dụng như đột biến điểm và đột biến ngẫu nhiên… Đột biến thêm / bớt hoặc thay thế các axit amin cụ thể Đột biến ngẫu nhiên là một đột biến được tạo dọc theo chiều dài gen ở vị trí bất kỳ nhờ ep – PCR hay error prone PCR (Rabbani et al., 2011)

Đối với các trình tự SP đã biết, có thể nghiên cứu sử dụng đột biến định hướng để có thể đánh giá tác động hay ảnh hưởng đến quá trình tiết của một enzyme (Borchert & Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al., 2010b, Ismail et al., 2011; Han et al., 2017 ) Các SP tiết trong Sec/P luôn có cấu trúc 3 vùng với các chức năng khác nhau được biết đến với độ dài đoạn SP của gen

α–amylase từ chi Bacillus bao gồm khoảng 25 - 40 aa Những đột biến tạo thành

được thiết kế dựa trên SP ban đầu đồng thời có thế áp dụng các phương pháp như: đột biến điểm (SDM – site directed mutagenenesis) hay sử dụng error prone PCR, đột biến thêm đoạn, đột biến mất đoạn hoặc có thể tạo đột biến bằng các con đường tổng hợp hóa học nhằm thay thế vị trí mong muốn trước khi ghép trở lại gen Phương pháp gây đột biến ở mức bão hòa là một phương pháp được sử dụng rất nhiều và là công cụ hữu hiệu để có thể thực hiện được mục đích này bằng việc thay thế các axit amin thông qua PCR Quá trình tiết tự nhiên của sản phẩm trong chủng chủ là không cao, do đó, việc biểu hiện ở mức cao các enzyme công nghiệp mong muốn có thể dẫn tới lỗi trong sự gấp cuộn các protein (Schallmey et al., 2004) và có thể gây lỗi trong sự biểu hiện từ đó không thu được các protein mong muốn (Harwood & Cranenburgh, 2008) Nhằm mục đích đánh giá tác động cũng như vai trò của các vùng trên SP đối với quá trình tiết enzyme quan tâm (Borchert & Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993; Caspers et al., 2010b) và để tăng cường khả năng tiết enzyme ngoại bào, đoạn SP của gen thường được gây đột biến bằng cách thêm đoạn vào vị trí nào đó hoặc thay đổi các axit amin nhằm biến đổi điện

tích trên đoạn SP ở vùng này (Suominen et al., 1990; Itoh et al., 1990; Southgate et al., 1993; Yamabhai et al., 2008)

Theo Brockmeier và các nghiên cứu của các tác giả khác có thể sử dụng peptide tự nhiên, thông qua quá trình nghiên cứu gây đột biến tạo ra các peptide tín hiệu mạnh tăng cường tiết enzyme Tăng tiết enzyme quan tâm thì có thể làm tăng lượng enzyme thu hồi, vì vậy, phương pháp chiếm ưu thế và sử dụng rộng rãi hiện nay để tăng hoạt tính enzyme đó là can thiệp vào quá trình tiết enzyme Ở đây cho thấy rõ tầm quan trọng của các nhân tố tiết mà SP lại là nhân tố chính (Brockmeier

et al., 2006b; Caspers et al., 2010a; Brockmeier et al., 2006a,c; Caspers et al., 2010b) Với các đột biến mong muốn bao gồm: đột biến thay đổi điện tích đầu N bằng việc bổ sung một axit amin tích điện âm hoặc không mang điện tích; đột biến làm tăng hoặc giảm tính kỵ nước của vùng H, rút ngắn cấu trúc vùng H làm chậm động học của quá trình; đột biến trên vùng C hay thay đổi axit amin tại vị trí nhận biết phân cắt của SP nhằm tăng cường khả năng tiết enzyme mong muốn

Mặc dù vùng N không đóng vai trò quan trọng cho quá trình tiết như vùng H, nhưng khi SP có chứa 1 vùng N –acidic, protein sẽ được tiết chậm hơn Xem xét các tác động của biến đổi điện tích đầu N, có thể kết luận rằng sự hiện diện của các điện tích dương điển hình không hoàn toàn cần thiết để quá trình tiết xảy ra mặc dù các điện tích dương thấp hoặc bằng không dẫn đến làm giảm bài tiết protein Điều này phù hợp với các công bố trước đó cho các sinh vật khác như nghiên cứu của

Gennity và cs ở E coli (Gennity et al., 1990) và công bố của Chen và Nagarajan ở Bacillus (Chen & Nagarajan, 1994) Loại SP duy nhất hoàn toàn đòi hỏi một điện

tích dương (mặc dù có thể làm giảm hoạt tính) để trực tiếp tiết là SP tiết

levansucrase trong Bacillus (Borchert & Nagarajan, 1991a) Trong nghiên cứu đột

biến ở vùng H, việc thêm một axit amin không tích điện, phân cực trong vùng này hoặc rút ngắn các axit amin luôn có ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tiết Điều này chỉ ra rằng, cần phải duy trì một chuỗi các axit amin kỵ nước liên tục ở mức độ nhất định và không bị gián đoạn trong các SP Từ thí nghiệm của các tác giả đã công bố với các SP khác nhau, Page và cộng sự đã đưa ra kết luận về sự tương quan giữa

chiều dài của lõi kỵ nước và mức tiết xylanase trong S lividans (Pagé et al., 1996) Izard và Kendall đã đưa ra đánh giá về SP của E coli, tính kỵ nước của các đột biến

tại lõi kỵ nước có thể làm rối loạn quá trình vận chuyển các chuỗi polypeptide làm cho chúng không xảy ra hoặc sự tương tác quan trọng trong quá trình vận chuyển không được hoàn thành (Izard et al., 1996) Hiệu quả của việc tạo các các đột biến ở cấp độ phiên mã có vẻ là một chủ đề gây tranh cãi Đột biến SP có ảnh hưởng mức

độ phiên mã của mRNA và hiệu suất dịch mã ở cả E coli và Bacillus (Nakamura et

al., 1989; Gennity et al., 1990; Itoh et al., 1990) Vùng đầu C là nhân tố quan trọng trong quá trình, nó được sử dụng để nghiên cứu đột biến trình tự SP làm tăng tổng hợp enzyme Các phương pháp đột biến SP được sử dụng có thể là đột biến ngẫu nhiên hoặc đột biến điểm (Borchert & Nagarajan, 1991a; Chen & Nagarajan, 1994; Monroy-Lagos et al., 2006) Tác giả Borchert và Nagarajan (Borchert and

Nagarajan., 1991) sử dụng levansucrase của B amyloliquefacien như một protein

mô hình nhằm nghiên cứu cấu trúc và chức năng của 3 vùng trong cấu trúc của SP

trong Bacillus (Borchert and Nagarajan, 1991a; Simonen & Palva, 1993)

1.3.5 Sử dụng chủng chủ đã được cải biến di truyền

Một nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện protein trong chủng chủ được phát hiện nữa chính là do quá trình biểu hiện một lượng lớn protease của

chính loài này vì thế chủng B.subtilis WB600 (cắt bỏ 6 gen ), B subtilis WB700 (cắt bỏ 7 gen mã hóa protease), B subtilis W800 (cắt bỏ 8 gen mã hóa protease)…

được sử dụng làm tăng hiệu suất biểu hiện Các nghiên cứu gần đây cho thấy không chỉ các protease được tiết mới ảnh hưởng đến khả năng tiết enzyme của các chủng tái tổ hợp mà còn có một protease liên kết màng như CWBP52 và CWBP53 là sản phẩm của gen wprA Mặc dù 2 protein này không thể hiện hoạt tính serin protease

nhưng khi bất hoạt gen wprA của chủng B.subtilis WB800 lại cho thấy tăng tiết

protein WprA có thể phân hủy protein biểu hiện bao gồm cả staphylokinase và amylase (Lee et al., 2000; Stephenson et al., 1998)

α-1.4 ALPHA AMYLASE

Alpha-Amylase (Endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase - EC3.2.1.1) xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết α-1,4 glycoside trong phân tử tinh bột Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân cắt là các đoạn oligosacharide với liên kết α–glucoside như: glucose, maltose, maltotriose và dextrin Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase vì vậy α -amylase giữ vai trò quan trọng nhất cho sự khởi đầu của quá trình thủy phân (Zhang et al., 2017; Ray, 2015; KiroMojsov, 2012) Với vai trò to lớn của enzyme này, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm các α-amylase như tạo những chủng tái tổ hợp mới mang các gen α amylase mới thu được từ việc sàng lọc thư viện metagenomic ở các vùng cực hạn vi khuẩn không thể nuôi cấy (Schmeisser et al., 2007; Vester et al., 2014; Sathya & Mahejibin, 2014)

1.4.1 Cấu trúc của α – amylase

Alpha-amylase là enzyme có chứa ion Ca2+ và có cấu trúc đa vùng với 3 vùng chính A, B, C Trong đó, vùng A giữ vai trò trung tâm chứa siêu cấu trúc (β/α)8 điển hình hoặc vùng xúc tác TIM (triose phosphate isomerase) với một cấu trúc cuộn đa đối xứng của 8 chuỗi β bao quanh bởi 8 vòng xoắn, một dạng cấu trúc được biết đến trong ít nhất là ở 9 họ của enzyme glycosyl hydrolase (Rivera et al., 2003) Mặc dù có sự đa dạng về hoạt động xúc tác nhưng vị trí hoạt động luôn được định vị ở vị trí đầu cuối Cacbon Vùng B và C thông thường ở vị trí đối diện của cấu trúc này Vòng liên kết của xoắn liền kề mang axit amin ở vị trí hoạt động Thông thường vùng B được hình thành giữa vùng cấu trúc nhô ra giữa sợi bậc ba và xoắn bậc 3 của TIM barrel, được nằm giữa hai vùng A - C và được liên kết với vùng A bằng liên kết disulphide (Henrissat & Bairoch, 1993; Ramachandran, 2005) Vùng C có cấu trúc gấp nếp β liên kết với các vùng A bởi một chuỗi đơn polypeptide và tham gia vào sự ổn định cấu trúc cho vùng TIM bằng việc bảo vệ vùng A khỏi dung môi Vị trí tâm hoạt động của α -amylase nằm ở giữa carboxyl cuối của 2 vùng A và B Canxi (Ca2 +) nằm giữa vùng A và B và có thể đảm bảo