BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HÓA BẤT THƯỜNG TRÊN GEN BRCA1 VÀ P16INK4A TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ VÚ Ở VIỆT NAM: PHÂN T
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HÓA BẤT THƯỜNG
TRÊN GEN BRCA1 VÀ P16INK4A TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ
VÚ Ở VIỆT NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT
THỰC NGHIỆM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ HOÀNG TRINH MSSV: 1553010224
KHÓA: 2015
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HÓA BẤT THƯỜNG
TRÊN GEN BRCA1 VÀ P16INK4A TRÊN BỘ MẪU UNG THƯ
VÚ Ở VIỆT NAM: PHÂN TÍCH TỔNG HỢP & KHẢO SÁT
THỰC NGHIỆM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
CBHD: PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY
ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG SVTH: NGUYỄN THỊ HOÀNG TRINH MSSV: 1553010224
KHÓA: 2015
GVHD ký xác nhận
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019
Trang 31
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin kính gửi đến tất cả Quý Thầy Cô đang dạy, làm việc tại khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và Quý Thầy
Cô chuyên ngành Công nghệ Sinh học Y dược đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua
Đặc biệt, em xin cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và ThS Trương Kim Phượng đã hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo em không chỉ những kiến thức chuyên môn mà còn tinh thần nghiên cứu nghiêm túc và làm việc hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện thực tập tốt nghiệp Do trình độ chuyên môn cũng như kinh nghiệm thực tiễn của em còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp từ Thầy Cô để em có
cơ hội nâng cao kiến thức chuyên môn và hoàn thiện bản thân
Xin gửi lời cảm ơn đến các anh (chị), bạn bè đã luôn theo sát, giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm cho em
Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ đã nuôi dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hôm nay
Em xin kính chúc Quý Thầy (Cô), gia đình và bạn bè thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống
Xin Chân Thành Cảm Ơn!
Bình Dương, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Hoàng Trinh
Trang 4i
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
BRCA1 Breast cancer type 1
DCIS Ductal carcinoma in situ
IDC Infiltrating ductal carcinoma
LCIS Lobular carcinoma in situ
NCBI National Center for Biotechnology Information
Nested-MSP Nested Methylation – specific PCR
P16 INK4a Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A
QMSP Quantiative Methylation specific Polymerase chain reation RT-PCR Real time _ Polymerase Chain Reaction
Trang 5ii
DANH MỤC BẢNG
Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested-MSP nhằm xác định tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu 12 Bảng III 1 Đặc điểm bộ dữ liệu ung thư vú trong phân tích tổng hợp tính chất
methyl hóa gen BRCA1 19
Bảng III 2 Đặc điểm của bộ dữ liệu 11 công bố ca chứng về tính chất methyl hóa
trên vùng promoter gen p16 INK4a 23 Bảng III 3 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) phản ánh sự tương quan giữa tính chất
methyl hóa gen BRCA1và p16 INK4a và bệnh ung thư vú 31
Bảng III 4 Chỉ số tỷ suất chênh (OR) về tính chất methyl hóa gen BRCA1và
p16 INK4a trên bệnh ung thư vú (tiếp theo) 32 Bảng IV 1 Thông tin bộ mồi khảo sát tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu 36 Bảng IV 2 Thông số vật lý của bộ mồi đặc hiệu trên vùng promoter gen mục tiêu 37 Bảng IV 3 Vị trí bắt cặp của bộ mồi Nested-MSP xác định tính chất methyl hóa trên trình tự promoter gen BRCA1và P16 INK4a 38
Bảng IV 4 Tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 trên một số mẫu
Trang 6iii
DANH MỤC HÌNH
Hình I 1 Vị trí gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể số 17 3
Hình I 2 Ví trí gen p16 INK4a trên nhiễm sắc thể số 9 (NCBI) 3 Hình II 1 Sơ đồ quy trình Nested-MSP phân tích tính chất methyl hóa vùng
promoter gen mục tiêu 8
Hình II 2 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP 12
Hình III 1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp trên gen BRCA1 và p16 INK4a 14 Hình III 2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất
methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18
nghiên cứu ca chứng 20 Hình III 3 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl
hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu
ca chứng 21 Hình III 4 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của
bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen BRCA1
22 Hình III 5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ
dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 22
Hình III 6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tính chất
methyl hóa trên gen p16 INK4a trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu ca chứng 24 Hình III 7 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tính chất methyl
hóa trên gen p16 INK4a trên bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu
ca chứng 25 Hình III 8 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của
bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen p16 INK4a 26
Trang 7iv
Hình III 9 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ
dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tính chất methyl hóa trên gen p16 INK4a 26
Hình IV 1 Vùng promoter trên gen BRCA1 33
Hình IV 2 Vị trí hoạt động của cặp mồi nested-MSP trên gen BRCA1 34
Hình IV 3 Vùng promoter trên gen p16 INK4a 34
Hình IV 4 Vị trí hoạt động của cặp mồi nested-MSP trên gen p16 INK4a 35
Hình IV 5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP trên gen BRCA1 trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú 40
Hình IV 6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Nested-MSP trên gen p16 INK4a trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú 44
Trang 8v
PHỤ LỤC Phụ lục 1 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi BRCA1 _F, BRCA1 _R với trình tự promoter gen BRCA1 bằng phần mềm Annhyb 57
Phụ lục 2 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi BRCA1 _MF, BRCA1 _MR với trình tự promoter gen BRCA1 bằng phần mềm Annhyb 57
Phụ lục 3 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi BRCA1_UF, BRCA1_UR với trình tự promoter gen BRCA1 bằng phần mềm Annhyb 58
Phụ lục 4 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi P16INK4A _F, P16INK4A _R với trình tự promoter gen P16 INK4a bằng phần mềm Annhyb 58 Phụ lục 5 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi P16INK4A _MF, P16INK4A _MR với trình tự promoter gen p16 INK4a bằng phần mềm Annhyb 59 Phụ lục 6 Kết quả phân tích sự bắt cặp của cặp mồi P16INK4A _UF, P16INK4A _UR với trình tự promoter gen p16 INK4a bằng phần mềm Annhyb 59
Trang 9vi
MỤC LỤC
I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1
I.1 Ung thư vú 1
I.2 Epigenetics 2
I.3 Sự methyl hóa DNA (DNA Methylation) 2
I.4 Đảo CpG 2
I.5 Dấu chứng sinh học (Biomarker) 3
I.6 Tổng quan gen 3
I.6.1 Gen BRCA1(Breast cancer type 1) 3
I.6.2 Gen p16 INK4a (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) 3
I.7 Tình hình nghiên cứu tính chất methyl hóa gen BRCA1 và p16 INK4a trên bệnh ung thư vú 4
I.8 Phương pháp phân tích tổng hợp 5
I.9 Phương pháp MSP và Nested - MSP liên quan tính chất methyl hóa DNA 6
II VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP 7
II.1 Vật liệu 7
II.2 Phương pháp nghiên cứu 7
III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 14
III.1.Kết quả khai thác dữ liệu và phân tích tổng hợp về sự 14
III.2.Kết quả phân tích tổng hợp 15
IV KHẢO SÁT TRÊN MÁY TÍNH 33
IV.1.Dữ liệu vùng gen mục tiêu BRCA1 và p16 INK4a 33
IV.2 Khảo sát bộ mồi trong quy trình MSP 37
IV.3 Kết quả thực nghiệm khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức vùng promoter gen BRCA1 và gen p16 INK4a trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú 39
V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 47
V.1 Kết luận 47
V.2 Đề nghị 48
VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
Trang 10vii
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo số liệu thống kê của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization – WHO, 2018), ung thư vú đứng vị trí thứ hai trong danh sách bệnh lý ung thư gây tử vong ở phụ nữ Hàng năm, trên thế giới có khoảng 2,1 triệu trường hợp ung thư vú mới được chẩn đoán và vào năm 2018 có khoảng 670.000 trường hợp tử vong do mắc ung thư vú
(Ghonche et al., 2016; WHO, 2018) Tổ chức y tế thế giới ghi nhận Việt Nam có
khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện vào năm 2018 (WHO, 2018) Cho đến nay, có nhiều công trình nghiên cứu ghi nhận tính chất methyl hóa vượt mức
trên gen BRCA1, p16 INK4a là dấu chứng sinh tiềm năng, ứng dụng trong tiên lượng và
chẩn đoán sớm đối với bệnh lý ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư đại thực tràng, ung thư vú và ung thư vòm họng, ( Tuo et al., 2018; Sobanski et al., 2018; Guo et al., 2017; Li et al., 2015; Cavanagh et al., 2015; Hutajulu et al., 2011; Jing et al., 2010) Cụ thể, hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường xảy ra trên vùng
promoter gen người đã và đang được triển khai ở nhiều quốc gia Điển hình là hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa bất thường xảy ra trên vùng promoter gen kiểmsoát
cơ chế sinh ung
Gen BRCA1 (Breast cancer type 1) là gen ức chế khối u, nằm trên nhiễm sắc thể 17q21.31, gồm 24 exon (NCBI, gencard) BRCA1 đóng vai trò trong quá trình sửa chữa DNA, tái tổ hợp, kiểm soát chu kỳ tế bào và phiên mã (Zhang et al., 2015)
Công trình nghiên cứu của Yadav và cộng sự (2018) xác định tần số methyl hóa bất
thường trên gen BRCA1 là 55% trên tổng 60 mẫu bệnh phẩm ung thư vú Công trình
nghiên cứu của Li và cộng sự (2015) phân tích tính chất methyl hóa trên gen BRCA1
bằng phương pháp MSP (Methylation-specific PCR) Kết quả nghiên cứu xác định tần
số methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 là 49% trong 80 mẫu bệnh phẩm ung thư vú Gen p16 INK4a (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A, CDKN2A) là một gen ức chế khối
u, nằm trên nhiễm sắc thể 9p21.3, gồm 8 exon (NCBI, gencard) Gen p16 INK4a
(CDKN2A) mã hóa protein p16INK4a tham gia vào cơ chế kiểm soát chu trình tế bào, tại
giai đoạn chuyển từ pha G1 đến pha S (Liggett et al., 1998) P16INK4a liên kết với CDK4/6, tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein
retinoblastoma (pRb) và dẫn đến bất hoạt chức năng pRb (Liggett et al., 1998; Rayess
Trang 11viii
et al., 2012) Công trình nghiên cứu của Wu và cộng sự (2016), Lee và cộng sự (2012)
sử dụng phương pháp MSP để xác định tính chất methyl hóa bất thường trên gen
p16 INK4a trên bộ mẫu ung thư vú Các kết quả nghiên cứu này ghi nhận tần số methyl
hóa trên gen p16 INK4a lần lượt 34,5% trên tổng 200 mẫu bệnh phẩm và 40% trên tổng
70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú
Kế thừa kết quả nghiên cứu của Thầy Cô Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh về hướng nghiên cứu tính chất methyl
hóa trên các gen có vai trò đè nén u đối với bệnh ung thư vú, (Truong et al., 2014;
Truong et al., 2015), chúng tôi thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát
tính chất methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 và p16 INK4a trên bộ mẫu ung thư
vú ở Việt Nam: phân tí ch tổng hợp & khảo sát thực nghiệm”
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hoá bất thường trên vùng promoter gen
BRCA1 và p16 INK4a ở bệnh ung thư vú trên thế giới và tại Việt Nam, tập trung vào nội dung phân tích tổng hợp và khảo sát thực nghiệm bằng phương pháp MSP với một số mẫu mô vú của người Việt Nam
Nội dung nghiên cứu
− Phân tích tổng hợp: xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa vượt mức
trên vùng promoter gen BRCA1 và p16 INK4a và bệnh ung thư vú, dựa vào phương pháp xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio)
− Khảo sát trên máy tính: cập nhật thông tin dữ liệu khảo sát bộ mồi phù hợp với quy trình Nested - MSP xác định tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1
và p16 INK4a đối với một số mẫu bệnh phẩm ung thư vú
− Khảo sát thực nghiệm: thực hiện quy trình Nested - MSP để xác định tính chất
methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 và p16 INK4a đối với một số mẫu bệnh phẩm (mẫu mô vú) của người Việt Nam
Trang 121
I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
I.1 Ung thư vú
Ung thư vú là ung thư đứng vị trí thứ hai trong nhóm bệnh lý ung thư thường gặp và
gây tử vong cao đối với phụ nữ (WHO, 2018; Bray et al., 2018) Theo báo cáo của
Ghonche và cộng sự (2016) và số liệu của Tổ chức y tế thế giới (2018), tổng số trường hợp mắc ung thư vú được chẩn đoán là 2,1 triệu người và tổng số trường hợp bị tử vong do mắc bệnh ung thư vú là 670.000 người Tính riêng ở Việt Nam, năm 2018 có khoảng 15.229 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện (WHO, 2018)
Ung thư vú khởi phát từ sự tăng trưởng mất kiểm soát của tế bào biểu mô thuộc ống dẫn
sữa hoặc các thùy tuyến vú (Reilly et al., 2007) Có nhiều yếu tố dẫn đến ung thư vú,
bao gồm những biến đổi bất thường về di truyền (đột biến, “epigenetics”), rối loạn về nội tiết tố hoặc do các thói quen tiêu cực trong đời sống: uống rượu, chế độ ăn uống mất cân bằng dinh dưỡng, sử dụng thực phẩm nhiều chất béo, ít vận động
(Damdamudi et al., 2018)
Hiện nay, các dạng ung thư vú bao gồm ung thư vú không xâm lấn (non-invasive breast cancer), ung thư vú xâm lấn (invasive breast cancer), ung thư tiểu thùy tại chỗ (LCIS-lobular carcinoma in situ), ung thư ống dẫn sữa tại chỗ (DCIS-Ductal carcinoma in situ), ung thư ống dẫn sữa xâm lấn (IDC-Infiltrating ductal carcinoma), ung thư biểu mô dạng tủy (medullary carcinoma), ung thư biểu mô dạng nhày (mutinous carcinoma), ung thư biểu mô dạng ống (Tubular carcinoma), ung thư vú dạng viêm (Inflammatory breast cancer), bệnh paget núm vú (Paget’s disease of the
nipple), bướu diệp thể vú (Phylloides tumor) (Sharma et al., 2010) Trong đó, ung thư
ống dẫn sữa tại chỗ (DCIS-Ductal carcinoma in situ) và ung thư tiểu thùy tại chỗ
(LCIS-lobular carcinoma in situ) là các dạng ung thư vú thường gặp (Reilly et al.,
2007)
Một số dạng bệnh lý khác xảy ra ở tuyến vú ở dạng lành tính nhưng là yếu tố nguy cơ dẫn đến sự khởi phát và diễn tiến ung thư vú, gồm có: tật thiếu núm vú, phì đại tuyến vú, áp xe vú, lao tuyến vú, hoại tử mỡ và các dạng bệnh lý liên quan
đến sự loạn sản các tế bào trong tuyến ống dẫn sữa hoặc nang vú: xơ nang tuyến vú,
nang vú; u nhú trong ống dẫn sữa; giãn ống tuyến sữa, u xơ tuyến, u mỡ,
Trang 13đến các thế hệ tế bào con (Bob Weinhold et al., 2006) bao gồm: sự methyl hóa DNA
(DNA methylation), in dấu gen, biến đổi histone Các cơ chế này liên quan đến sự bất hoạt hoặc kích hoạt sự phiên mã gen chức năng hoặc phong bế sự sinh tổng hợp protein…(Tchurikov., 2005)
I.3 Sự methyl hóa DNA (DNA Methylation)
Sự methyl hóa DNA thuộc nhóm cơ chế epigenetics, là quá trình gắn bổ sung một nhóm methyl (CH3) vào vị trí C5 của cytosine tạo thành 5-methylcytosine Sự methyl hóa DNA thường xảy ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter các gen trong bộ gen tế
bào động vật và trong tế bào người, làm ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen (Moore et al., 2013; Virani et al., 2012; Jin et al., 2011) Hơn sự methyl hóa DNA diễn ra tại các cặp
dinucleotide CpG trong tế bào sinh dưỡng và có thể xảy ra trong tế bào gốc
(ESCs-embryonic stem cells) (Jin et al., 2011)
Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi enzyme DNA methyltransferases (DNMTs), giúp chuyển nhóm methyl từ S - adenyl methionine (SAM) vào vị trí carbon thứ năm
của cytosine tạo thành 5-methylcytosine (5mC) (Moore et al., 2013)
Sự methyl hóa DNA giữ vai trò kiểm soát sự biểu hiện gen và cấu trúc nhiễm sắc thể trong các tế bào Eukaryote (AKM., 2016) Sự methyl hóa DNA bất thường có thể là nguyên nhân dẫn đến các bệnh lý ung thư, mặc dù không liên quan đến đột biến trên
gen hoặc thiếu hụt enzyme DNMT (Jin et al., 2011) Sự methyl hóa DNA bất thường
gồm có giảm methyl hóa (hypomethylation DNA) và tăng methyl hóa (hypermethylation DNA) xảy ra trải dài trên toàn bộ nhiễm sắc thể hoặc chỉ xuất hiện
cục bộ trên vùng đảo CpG (CGIs-CpG island) (Jin et al., 2011)
I.4 Đảo CpG
Đảo CpG là vùng trình tự DNA có chiều dài từ 300 đến 3000 bp, với tỷ lệ dinucleotide
CpG lớn hơn 50% và có thể tỷ lệ CpG/GpC lớn hơn 0,6 (Long et al., 2017) Trên bộ
gen người, ước tính có khoảng 29.000 đảo CpG và phân bố không đều, thường tập
Trang 143
trung trên vùng promoter gen giữ nhà (housekeeping gene) hoặc một số gen giữ vai trò điều hòa hoạt động tế bào (Goldman., 2001; Bird., 2002)
I.5 Dấu chứng sinh học (Biomarker)
Dấu chứng sinh học là các dạng phân tử sinh học hiện diện trong máu, chất dịch cơ thể, hoặc trong mô biểu thị tình trạng bình thường hay bất thường của tế bào hoặc mô ở cấp độ gen, protemic, metabolomic, liên quan đến một số dạng bệnh lý ung thư,…
(NCI-National Cancer Institute; Henry et al., 2012) Hiện nay, dấu chứng sinh học
được ứng dụng trong tiên lượng, chẩn đoán ung thư và đánh giá đáp ứng điều trị, theo
dõi tiến triển của các bệnh lý ung thư (Henry et al., 2012)
I.6 Tổng quan gen
I.6.1 Gen BRCA1(Breast cancer type 1)
Hì nh I 1 Vị trí gen BRCA1 trên nhiễm sắc thể số 17
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/672)
Gen BRCA1 (Breast cancer type 1) là một gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể 17q21.31, gồm 24 exon (NCBI, gencard) BRCA1 đóng vai trò trong quá trình sửa chữa DNA, tái tổ hợp, kiểm soát chu kỳ tế bào và phiên mã (Zhang et al., 2015)
I.6.2 Gen p16INK4a(Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)
Hì nh I 2 Ví trí gen p16 INK4a trên nhiễm sắc thể số 9 (NCBI)
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1029)
Trang 154
Gen p16 INK4a còn được gọi là CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), là gen ức chế khối u nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9p21.3), gồm 8 exon Gen p16 INK4a
(CDKN2A) mã hóa protein p16INK4a (CDKN2A) tham gia vào cơ chế kiểm soát chu
trình tế bào, tại giai đoạn chuyển từ pha G1 đến pha S (Liggett et al., 1998) P16INK4a liên kết với CDK4/6, tạo thành phức hợp xúc tác dẫn đến sự phosphoryl hóa protein
retinoblastoma (pRb) và dẫn đến bất hoạt chức năng pRb (Liggett et al., 1998; Rayess
et al., 2012) Hệ quả là giải phóng E2F và kích hoạt sự phiên mã gen, tham gia kiểm soát chu trình tế bào theo hướng dẫn đến tiến trình G1sang S (Liggett et al., 1998; Nielsen et al., 1998) Do đó, sự bất hoạt chức năng của gen p16 INK4a hoặc biểu hiện quá
mức của CDK4 có thể thúc đẩy quá trình hình thành khối u (Nielsen et al., 1998)
I.7 Tì nh hì nh nghiên cứu tí nh chất methyl hóa gen BRCA1 và p16INK4a
trên bệnh ung thư vú
Cho đến nay, có nhiều công bố khoa học về hướng nghiên cứu tính chất methyl hóa
trên gen BRCA1 và p16 INK4a đối với bệnh lý ung thư vú ở nhiều quốc gia trên thế giới
Đa số các công trình nghiên cứu này đều ứng dụng phương pháp MSP để xác định tần
số methyl hóa bất thường trên gen mục tiêu
− Xét trên gen BRCA1:
Công bố của Wu và cộng sự (2016) cho thấy tần số methyl hóa trên gen BRCA1là 24%
trên 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Trung Quốc Tiếp đến, công bố khoa học của
Hassan và cộng sự (2017); Yadav và cộng sự (2018) ghi nhận tần số methyl hóa trên
gen BRCA1lần lượt là 55% và 68% trên 60 và 75 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Ấn Độ
− Xét trên gen p16 INK4a :
Công bố khoa học của Cavusoglu và cộng sự (2010) cho thấy tần số methyl hóa trên
gen p16 INK4a là 24,16% trên 62 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Thổ Nhĩ Kỳ Tiếp theo,
nghiên cứu của Lee và cộng sự (2012) ghi nhận tần số methyl hóa trên gen p16 INK4a là 34,5 % trên 200 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Hàn Quốc Song song với việc phân tích
trên gen BRCA1, công bố khoa học của Wu và cộng sự (2016) xác định tần số methyl hóa trên gen p16 INK4a là 40% trong 70 mẫu bệnh phẩm ung thư vú ở Trung Quốc
Một số dữ liệu khoa học nêu trên cho thấy xu hướng nghiên cứu về tính chất methyl
Trang 165
hóa trên nhóm gen ức chế sinh ung (tumour suppressor gene), gen điều hòa chu trình
tế bào (cell cycle regutation gene) đã và đang được phát triển Hướng nghiên cứu này
có thể chuyên sâu vào việc xác định dấu chứng sinh học tiềm năng và thiết lập các công cụ sinh học phân tử phù hợp, hiệu quả trong tiên lượng, chẩn đoán sớm các bệnh
lý ung thư, cụ thể là ung thư vú Điều quan trọng hơn nữa, tính không đồng nhất (tính
biến thiên) về tần số methyl hóa trên gen BRCA1, p16 INK4a đối với bệnh ung thư vú ở các quần thể bệnh nhân khác nhau Đây là cơ sở khoa học để chúng tôi thực hiện nội dung phân tích tổng hợp và quy trình thực nghiệm để cập nhật dữ liệu phản ánh sự
tương quan giữa tính chất methyl hóa trên gen BRCA1, p16 INK4a và bệnh lý ung thư vú trên thế giới và ở Việt Nam
I.8 Phương pháp phân tích tổng hợp
Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) được thực hiện chủ yếu dựa vào phương pháp thống kê, liên quan đến các nghiên cứu thực chứng và nghiên cứu dịch tễ học Phân tích tổng hợp giúp xác định, đánh giá một cách hệ thống về sự biểu thị một biến số/chỉ
số dựa trên các kết quả nghiên cứu khác nhau, độc lập của các công bố khoa học
(Mead et al., 1995) Phân tích tổng hợp (Meta-analysis) được xem là “studying the studies” (Mead et al., 1995), do đó bước tiên quyết là trích xuất dữ liệu dựa trên các
tiêu chuẩn, điều kiện định sẵn và phải đảm bảo kết quả chính xác với độ tin cậy cao (Confidence Interval: 95%CI) so với phương pháp phân tích, đánh giá dữ liệu truyền
thống (Haidich et al., 2010) Trong quá trình phân tích tổng hợp, một số bước cơ bản
cần được thực hiện như sau:
− Đặt nghi vấn (câu hỏi, từ khóa) giúp giải quyết các vấn đề phân tích tổng hợp (dựa theo PICO_Participant-Intervention-Comparator-Outcomes);
− Tìm kiếm công bố khoa học dựa trên các cơ sở dữ liệu: Pubmed/Medline,
Google Scholar, ;
− Đọc tóm tắt và tiêu đề của các công bố khoa học;
− Chọn lọc và trích xuất dữ liệu của các công bố khoa học dựa trên nội dung toàn văn;
− Xác định tính chất bất đồng nhất (I2 – Index of heterogeneity) của bộ dữ liệu;
Trang 176
− Đánh giá biến số dựa vào phương pháp thống kê với chỉ số tỷ suất chênh Odds ratio (OR), sử dụng mô hình ảnh hưởng bất biến “Fixed effects model” hoặc mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên “Random effects model” và xây dựng đồ thị “Forest plot”;
− Xác định tính thiên vị với đồ thị “Funnel plot”;
− Tiến hành chia nhóm phân tích và kiểm tra kết quả phân tích tổng hợp
I.9 Phương pháp MSP và Nested MSP liên quan tính chất methyl hóa DNA
− Phương pháp Methylation specific PCR (MSP)
Phương pháp Methylation – specific PCR (MSP) là phương pháp phân tích tính chất methyl hóa DNA trên đảo CpG, dựa trên nguyên tắc của PCR (Polymerase chain
reaction) được thực hiện đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả (Derks et al., 2004; Garibyan et al., 2013) Nguyên tắc của MSP tiến hành với hai cặp mồi đươc thiết kế đặc hiệu khuếch đại trình tự DNA đã được biến đổi bisulfite (Herman et al., 1996; Derks et al., 2004) Một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA không bị methyl
hóa và một cặp mồi methyl hóa khuếch đại đặc hiệu với trình tự DNA bị methyl hóa
(Derks et al., 2004)
− Phương pháp Nested Methylation specific PCR (Nested-MSP)
Phương pháp Nested-MSP được cải tiến từ phương pháp MSP, cho phép tăng độ nhạy
và độ đặc hiệu so với phản ứng MSP (Rahman et al., 2013) Nguyên tắc của phương
pháp Nested-MSP dựa vào ba cặp mồi được thiết kế đặc hiệu khuếch đại trình tự DNA
đã được biến đổi bisulfite (Rahman et al., 2013) Trong phản ứng thứ nhất, cặp mồi
thứ nhất khuếch đại trình tự gen mục tiêu (vùng promoter chứa đảo CpG) nhưng không phân biệt trạng thái bị methyl hóa hoặc không bị methyl hóa Trong hai phản ứng tiếp theo sử dụng sản phẩm của phản ứng thứ nhất, phản ứng thứ hai sử dụng một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA không bị methyl hóa, phản ứng thứ ba sử
dụng một cặp mồi khuếch đại đặc hiệu trình tự DNA bị methyl hóa (Rahman et al.,
2013)
Trang 18II.2 Phương pháp nghiên cứu
II.2.1 Khai thác dữ liệu và phân tí ch tổng hợp
Chúng tôi tập trung thực hiện các nội dung nghiên cứu như sau:
(1) Tìm kiếm, thu thập dữ liệu khoa học (Bài báo khoa học) trên nguồn cơ sở dữ liệu của PubMed hoặc PubMed Central (National Center for Biotechnology
Information–NCBI), Google,…với một số từ khóa: BRCA1, p16 INK4a, DNA methylation, breast cancer,…
(2) Thực hiện các bước cơ bản trong quy trình phân tích tổng hợp đã đề cập ở nội dung 1.7 Trong bước trích xuất dữ liệu, chúng tôi tập trung các tiêu chí nhằm khai thác thông tin về tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen mục tiêu
BRCA1, p16 INK4a trên bộ mẫu ung thư vú/bộ mẫu lành trên thế giới; phương
pháp sinh học phân tử (MSP, MS-HRM,…) phù hợp để xác định sự methyl hóa
của gen BRCA1, p16 INK4a trên quần thể người bệnh ung thư vú, cụ thể như sau:
- Gen mục tiêu: BRCA1, p16 INK4a
- Số lượng mẫu bệnh phẩm; Số lượng mẫu đối chứng;
- Số mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu đối chứng xuất hiện sự methyl hóa gen mục tiêu;
- Tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu: BRCA1, p16 INK4a
- Chỉ số biểu thị mức độ nguy cơ (Hazard ratio - HR), tỷ suất chênh (Odds ratio - OR),… với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - Cis);
Trang 198
- Phương pháp nghiên cứu: MSP, MS-HRM,…;
- Thông tin mẫu bệnh phẩm: loại mẫu (blood, tissue,…);
- Thông tin bệnh nhân: độ tuổi, quốc tịch - chủng tộc;
- Đặc điểm bệnh học ung thư vú: giai đoạn bệnh (stage), phân độ mô học (grade), kích thước khối u (tumor size),…
II.2.2 Khảo sát trên máy tí nh
Chúng tôi tập trung thu thập trình tự gen BRCA1 và p16 INK4a , promoter, vị trí các đảo
CpG , trên các công trình nghiên cứu trên thế giới: châu Á, châu Âu, châu Phi,…và Việt Nam Đồng thời, chúng tôi dựa vào một số công cụ tin sinh học để cập nhật, tái kiểm tra các thông số của bộ mồi phù hợp với phương pháp Nested-MSP hoặc MSP
nhằm phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1, p16 INK4a đối với
bệnh ung thư vú
II.2.3 Khảo sát thực nghiệm
Các phương pháp chính được sử dụng trong quá trình khảo sát thực nghiệm nhằm
phân tích tính chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1, p16 INK4a đối với bệnh
ung thư vú được mô tả ở hình
Hì nh II 1 Sơ đồ quy trì nh Nested-MSP phân tí ch tí nh chất methyl hóa vùng
promoter gen mục tiêu
Trang 209
II.2.3.1 Tách chiết DNA bộ gen
Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA bộ gen người
từ các mẫu bệnh phẩm (mô đúc paraffin) Trong đó, paraffin được loại bỏ bằng xylen, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase K Sau đó, protein sẽ được biến tính và bị loại bỏ bằng phenol/chloroform DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối và trữ lạnh
Thiết bị: Máy ly tâm lạnh, máy vortex
Hóa chất: Phenol, Chloroform, SDS 10%, NaCl 5M, Tris HCl 10mM (pH=8,2),
EDTA 1M (pH=8), Amonium acetate, Ethanol 100%, Ethanol 70%, Ethanol 50%,
Protein K, Xylene
Các bước tiến hành:
- Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào eppendorf loại 1,5 ml
- Bổ sung 1ml dung dịch xylen, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol tuyệt đối, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol 70%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi
- Bổ sung 1ml dung dịch ethanol 50%, lắc đều sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 2 phút Sau đó thu cặn, bỏ dịch nổi Để khô trong 30 phút
- Bổ sung một thể tích phù hợp hỗn hợp dung dịch ly giải tế bào (NaCl 5M, Tris-HCl 1M (pH=8), dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), SDS 10%, nước cất hai lần vô trùng và 10 µl proteinase K (nồng độ 20 ng/ml) Trộn đều hỗn hợp, ủ
560C trong 24-48 giờ
- Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol:chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch
- Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được, trộn nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 3 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch
Trang 2110
- Bổ sung một lượng ammonium acetate (NH4OAc) 5M và một lượng ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 0,2: 2,5 thể tích so với thể tích dịch nổi Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C Loại bỏ phần dịch nổi, thu tủa
- Bổ sung một thể tích ethanol 70% trữ lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C Thu tủa, loại bỏ dịch nổi (dung dịch ethanol) Để khô trong 30 phút
- Hòa tan kết tủa DNA trong 30-50µl nước cất hai lần vô trùng Bảo quản DNA ở 40C đến -200C
II.2.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ
Nguyên tắc:
- Hàm lượng, nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng
ở bước sóng 260 nm, thông qua độ hấp thụ (Absorbance) A260= OD = 50
µg/ml DNA sợi đôi (Barbas et al., 2007)
- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280, dung dịch DNA sạch, không nhiễm protein thường có tỷ lệ A260/A280 =1,8-2 (Gallagher., 2011) Công thức xác định nồng độ DNA:C (µg/ml) = 50 x A260 x d
Chú thí ch: A 260 : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm; A 280 : độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm; d: độ pha loãng.
Thiết bị-Hóa chất: Máy đo quang phổ, cuvette, nước cất hai lần
II.2.3.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit EZ DNA Methylation-Gold
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị dung dịch biến đổi EZ1: bổ sung 900 µl dung dịch nước cất 2 lần,
300 µl dung dịch EZ2 và 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagent, trộn đều trong 10 phút
- Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagent (EZ1) vào 20 µl dung dịch DNA đã hút vào eppendorf 250 µl, trộn đều Sau đó đưa vào chu trình luân nhiệt như sau: 980C: 10 phút, 640C: 2,5 giờ, 40C: ∞
- Bổ sung 600 µl EZ4 vào cột Zymo-spinTMIC (C1), sau đó thêm dung dịch DNA (đã chạy chu trình nhiệt) vào cột C1, đảo trộn thật đều Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm
Trang 2211
- Bổ sung 100 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt
độ phòng Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm
- Bổ sung 200 µl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phòng 15-20 phút, ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 30 giây Đổ bỏ dung dịch sau ly tâm
- Bổ sung 200 µl EZ5 vào cột C1, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt
Phương pháp Nested-MSP, gồm ba phản ứng PCR riêng biệt:
- Phản ứng thứ nhất: phản ứng khuếch đại phổ quát vùng trình tự mục tiêu bao quanh các vị trí “hot spot” Sản phẩm PCR này là DNA bản mẫu cho hai phản ứng PCR riêng biệtcủa phương pháp Nested-MSP:
(i) Phản ứng đặc hiệu cho allele methyl hóa (phản ứng methyl hóa): tiến hành với một cặpmồi chuyên biệt cho DNA bị methyl hóa (M)
(ii) Phản ứng đặc hiệu cho allele không methyl hóa (phản ứng không methyl hóa): tiến hành với một cặp mồi chuyên biệt cho DNAkhông bị methyl hóa (U)
Thiết bị-Hóa chất: Máy PCR, master mix 2X, mẫu DNA, mồi, nước cất hai lần
Các bước tiến hành:
Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 50μl với bộ mồi Nested MSP nhằm khuếch đại vùng trình tự promoter gen mục tiêu Thành phần và phản ứng PCR thể hiện trong Bảng II.1
Trang 2312
Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi Nested-MSP nhằm xác định
tí nh chất methyl hóa trên gen mục tiêu
Chú thí ch: X: thể tí ch DNA phù hợp; Y = 50-(25+0,5+0,5+X)
Hì nh II 2 Chu trì nh luân nhiệt cho phản ứng Nested-MSP
Chú thí ch: Ta: nhiệt độ lai tối ưu; x: số chu trì nh luân nhiệt; NC: Số chu trì nh luân nhiệt (Numbers of Cycle)
II.2.3.5 Phương pháp điện di
Nguyên tắc:
Nucleic acid là các phân tử tích điện âm, do đó có khả năng di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc, sự tích điện của phân tử DNA Các phân tử nucleic acid hiện diện trong bản gel agarose
sẽ được ghi lại dưới tia tử ngoại (UV) nhờ chất nhuộm GelRed Kích thước của các phân tử DNA nucleic acid được xác định dựa vào kích thước đã biết trước của thang
chuẩn (Lee et al., 2012)
Thiết bị-Hoá chất: Buồng điện di, khuôn gel, hệ thống đọc gel (Gel Doc, Biorad) ,
Agarose; dung dịch TAE (1X); dung dịch nạp mẫu (6X GelRedTM loading buffer with
Trang 2514
III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
III.1 Kết quả khai thác dữ liệu và phân tí ch tổng hợp về tí nh chất methyl hóa
trên vùng promoter gen BRCA1 và p16 INK4a
Dựa vào các cơ sở dữ liệu của National Center for Biotechnology Information – NCBI (PubMed, PubMed Central,…), Google scholar, Google,…và sử dụng các từ khóa:
BRCA1, p16 INK4a, DNA methylation, breast cancer,…được cập nhật đến tháng 4 năm
2019, chúng tôi thực hiện việc thu thập và chọn lọc bộ dữ liệu công trình nghiên cứu
liên quan đến tính chất methyl hóa vùng promoter gen BRCA1 và p16 INK4a (tính chất
methyl hóa trên gen BRCA1, p16 INK4a) theo tiến trình được mô tả ở hình III.1
Hì nh III 1 Quy trình chọn lọc bài báo trong phân tích tổng hợp
trên gen BRCA1 và p16 INK4a
Trang 2615
Chú thích:
Cập nhật đến tháng 4/2019, chúng tôi thu thập các bộ dữ liệu:
(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 gồm 18 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên bệnh ung thư vú (bảng III.1)
(2) Bộ dữ liệu gen p16 INK4a gồm 11 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính
chất methyl hóa gen p16 INK4a trên bệnh ung thư vú (bảng III.2)
Các bộ dữ liệu này được chọn lọc theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu và đưa vào phân tích tổng hợp theo mô hình phân tích ảnh hưởng cố định hay bất biến (Fixed, F) hoặc
mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random, R) với khoảng tin cậy 95%CI trong phân tích tổng hợp (CI >= 1 và/hoặc xấp xỉ 1)
III.2 Kết quả phân tí ch tổng hợp
Hai bộ dữ liệu được đưa vào vào phân tích tổng hợp với theo chỉ số tỷ suất chênh (OR)
và chỉ số nguy cơ (RR) nhằm xác định sự tương quan giữa tính chất methyl hóa trên
gen BRCA1 và p16 INK4a và bệnh lý ung thư vú, gồm có:
(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 (bảng III.1) có tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1540 mẫu
(76 mẫu máu, 1464 mẫu mô), tổng số mẫu lành là 907 mẫu (169 mẫu máu, 738 mẫu mô)
(2) Bộ dữ liệu gen p16 INK4a (bảng III.2) có tổng số mẫu bệnh ung thư vú là 1067 mẫu (134 mẫu máu, 933 mẫu mô), tổng số mẫu lành là 761 mẫu (263 mẫu máu, 498 mẫu mô)
Dựa vào chỉ số bất đồng nhất (I2, Index of heterogeneity) của các bộ dữ liệu nêu trên, quá trình phân tích tổng hợp chọn lọc mô hình phân tích ảnh hưởng phù hợp:
(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 đưa vào phân tích chỉ số OR, RR lần lượt thể hiện giá trị I2
= 76,36% (18 công bố khoa học) và I2= 72,77% (18 công bố khoa học), do đó áp dụng mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) với khoảng tin cậy 95% CI Kết quả thể hiện ở hình III.2, hình III.3
Tổng số công bố khoa học
Bộ dữ liệu gen BRCA1 37 6 31 5 26 2 24 5 18
Bộ dữ liệu gen p16 INK4a 30 6 24 5 19 3 16 5 11
Trang 2716
(2) Bộ dữ liệu gen p16 INK4a đưa vào phân tích chỉ số OR, RR lần lượt thể hiện giá trị I2
= 66,74 (11 công bố khoa học) và I2= 90,13% (11 công bố khoa học), do đó áp dụng mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model - R) với khoảng tin cậy 95% CI Kết quả thể hiện ở hình III.4, hình III.5
III.2.1 Chỉ số OR và RR tổng số phản ánh sự tương quan giữa tí nh chất
methyl hóa trên gen BRCA1 và p16 INK4a
❖ Xét tính chất methyl hóa trên gen BRCA1
Đối với bộ dữ liệu thứ nhất (18 công bố khoa học ca chứng), cập nhật đến tháng 4 năm
2019, kết quả phân tích ghi nhận chỉ số tỷ suất chênh (OR) tổng số: OR = 8,979 (95%CI = 4,359 - 18,497; P < 0,0001; mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R); phản ánh
độ chênh có ý nghĩa thống kê về sự xuất hiện tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên
nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 8,979 lần Để tiến hành được nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tham khảo và kế thừa kết quả nghiên cứu của các
giảng viên hướng dẫn, cụ thể là công bố khoa học của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017)
Đối với bộ dữ liệu khoa học gồm 24 công bố khoa học được nhóm tác giả Le Huyen
Ai Thuy và cộng sự đưa vào phân tích tổng hợp, độ chênh có ý nghĩa thống kê về sự
xuất hiện tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với
nhóm mẫu lành là OR = 4,312 (95%CI = 2,395 - 7,765, P < 0,0001; mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R)
Sự thay đổi có chiều hướng tăng của độ chênh giữa kết quả nghiên cứu trong chuyên
đề khóa luận tốt nghiệp này so với công bố của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) có thể
được lý giải do chúng tôi trích xuất dữ liệu và sàng lọc (loại trừ) các công bố khoa học bộc lộ độ chênh (OR) có khoảng tin cậy (CI: < 1), dẫn đến số lượng công bố ca chứng trong nội dung nghiên cứu này ít hơn so với thời điểm nhóm tác giả Le Huyen Ai
Thuy et al., (2017) công bố
Tuy nhiên, kết quả phân tích trong chuyên đề khóa luận này hoàn toàn đồng thuận với
kết quả nghiên cứu của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) và làm rõ mối tương quan giữa giữa tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 và bệnh lý ung thư vú trên thế giới Mặc dù tần số methyl hóa trên gen BRCA1 được ghi nhận khác nhau trong các công
Trang 2817
trình nghiên cứu trên thế giới, tuy vậy, chỉ số tỷ suất chênh về sự xuất hiện tính chất
methyl hóa trên gen BRCA1 trên các tế bào ung thư cao gấp 4,312 - 8,979 so với tế bào
lành
Song song, dựa vào bộ dữ liệu thứ nhất (18 công bố khoa học ca chứng), chúng tôi xác định chỉ số nguy cơ (RR) tổng số: RR = 4,973 (CI%= 2,523 – 9,802, P < 0,0001; mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R) phản ánh nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao gấp 4.973 lần khi tế bào có sự xuất hiện tính chất methyl hóa bất thường trên vùng promoter gen
BRCA1
❖ Xét tính chất methyl hóa trên gen p16 INK4a
Trên tổng số 11 công bố ca chứng thuộc bộ dữ liệu gen p16 INK4a, kết quả phân tích ghi nhận giá trị chỉ số OR tổng số: OR = 12,925 (CI%= 4,585 – 36,429, P < 0,0001; mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên - R) phản ánh độ chênh về sự xuất hiện tính chất methyl
hóa trên vùng promoter gen p16 INK4a trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 12,925 lần Đồng thời, bộ dữ liệu gen p16 INK4a biểu thị giá trị chỉ số (RR) tổng số: RR = 8,92 (CI%= 2,203 – 36,1101; P = 0,002, mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên-R) Giá trị RR phản ánh nguy cơ về sự xuất hiện tính chất methyl hóa trên vùng promoter
gen p16 INK4a trên nhóm mẫu bệnh ung thư vú so với nhóm mẫu lành là 8,92 lần
Tóm lại, phương pháp xác định chỉ số tỷ suất chênh (OR) và chỉ số nguy cơ (RR) tổng
số phản ánh sự tương quan chặt giữa tính chất methyl hóa gen BRCA1, p16 INK4a và bệnh ung thư vú với độ chênh giữa bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành lần lượt là OR
= 8,979 lần và OR = 12,925 lần và nguy cơ mắc bệnh ung thư khi có sự xuất hiện tính
chất methyl hóa gen BRCA1, p16 INK4a lần lượt là RR = 4,973 lần và RR =8,92 lần Hơn nữa, xét tính thiên vị của các bộ dữ liệu đưa vào phân tích được hiển thị theo đồ thị Funnel plot (Hình III.4, Hình III.9), chuyên đề khóa luận tiếp tục thực hiện khảo sát giá trị OR trên một số phân hạng đặc trưng cho các dạng công bố khoa học ca chứng (loại mẫu bệnh phẩm, chủng tộc/quần thể người bệnh ung thư vú, phương pháp phân tích tính chất methyl hóa trên DNA, ) và một số đặc điểm bệnh học ung thư vú (độ tuổi, ) Các dữ liệu này có thể phản ánh chi tiết về sự gắn chặt giữa tính chất methyl hóa trên các gen mục tiêu này và sự hình thành và diễn tiến của bệnh ung thư vú, từ đó làm cơ sở khoa học ủng hộ phát triển hướng nghiên cứu chọn lọc dấu chứng sinh học
Trang 2918
tiềm năng ứng dụng tiên lượng, chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú ở thế giới và ở Việt Nam
Trang 30Mẫu bệnh ung thư vú Mẫu lành
Mẫu methyl hóa
Tổng mẫu
Mẫu methyl hóa
Tổng mẫu
Trang 3120
Hì nh III 2 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tí nh chất methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu
ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu ca chứng
Trang 3221
Hì nh III 3 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số nguy cơ (RR) của tí nh chất methyl hóa trên gen BRCA1 trên bộ mẫu ung
thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 18 nghiên cứu ca chứng
Trang 3322
Hì nh III 4 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số tỷ suất chênh (OR) của bộ dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tí nh chất methyl hóa trên gen
BRCA1
Hì nh III 5 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị chỉ số nguy cơ (RR) của bộ
dữ liệu 18 công bố khoa học ca chứng về tí nh chất methyl hóa trên gen BRCA1
Trang 34Loại mẫu bệnh
Mẫu bệnh ung thư
vú Mẫu lành Mẫu
methyl hóa
Tổng mẫu
Mẫu methyl hóa
Tổng mẫu
Trang 3524
Hì nh III 6 Đồ thị “Forest plot” phản ánh chỉ số tỷ suất chênh(OR) của tí nh chất methyl hóa trên gen p16 INK4a trên bộ mẫu
ung thư vú và bộ mẫu lành, thuộc 11 nghiên cứu ca chứng