Đánh giá tính chất methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 và p16INK4a: Phân tích tổng hợp trên mẫu ung thư vú tại Việt Nam

Kết quả khai thác dữ liệu và phân tí ch tổng hợp về tí nh chất methyl hóa trên vùng promoter gen BRCA1 và p16 INK4a

(1) Bộ dữ liệu gen BRCA1 gồm 18 công bố khoa học ca chứng (Case control) về tính chất methyl hóa gen BRCA1 trên bệnh ung thư vú (bảng III.1). Các bộ dữ liệu này được chọn lọc theo các tiêu chí trích xuất dữ liệu và đưa vào phân tích tổng hợp theo mô hình phân tích ảnh hưởng cố định hay bất biến (Fixed, F) hoặc mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random, R) với khoảng tin cậy 95%CI trong phân tích tổng hợp (CI >= 1 và/hoặc xấp xỉ 1).

Kết quả phân tí ch tổng hợp

Sự thay đổi có chiều hướng tăng của độ chênh giữa kết quả nghiên cứu trong chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này so với công bố của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) có thể được lý giải do chúng tôi trích xuất dữ liệu và sàng lọc (loại trừ) các công bố khoa học bộc lộ độ chênh (OR) có khoảng tin cậy (CI: < 1), dẫn đến số lượng công bố ca chứng trong nội dung nghiên cứu này ít hơn so với thời điểm nhóm tác giả Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) công bố. Tuy nhiên, kết quả phân tích trong chuyên đề khóa luận này hoàn toàn đồng thuận với kết quả nghiờn cứu của Le Huyen Ai Thuy et al., (2017) và làm rừ mối tương quan giữa giữa tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 và bệnh lý ung thư vú trên thế giới. Tóm lại, phương pháp xác định chỉ số tỷ suất chênh (OR) và chỉ số nguy cơ (RR) tổng số phản ánh sự tương quan chặt giữa tính chất methyl hóa gen BRCA1, p16INK4a và bệnh ung thư vú với độ chênh giữa bộ mẫu ung thư vú và bộ mẫu lành lần lượt là OR.

Các dữ liệu này có thể phản ánh chi tiết về sự gắn chặt giữa tính chất methyl hóa trên các gen mục tiêu này và sự hình thành và diễn tiến của bệnh ung thư vú, từ đó làm cơ sở khoa học ủng hộ phát triển hướng nghiên cứu chọn lọc dấu chứng sinh học. Kết quả phân tích chỉ số tỷ suất chênh (OR) xác định mối tương quan tính chất methyl hóa gen BRCA1 và p16INK4a đối với bệnh ung thư vú xét trên các phân hạng: phương pháp phân tích tính chất methyl hóa; loại mẫu bệnh phẩm; chủng tộc/quần thể người bệnh;.được trình bày ở Bảng III.4. Các kết quả này cho thấy các loại mẫu mô và mẫu máu phù hợp trong hướng nghiên cứu về tính chất methyl hóa trên gen mục tiêu cũng như có thể hướng đến thiết lập quy trình tiên lượng, chẩn đoán theo dạng xâm lấn sử dụng mẫu mô hoặc dạng không xâm lấn (mẫu máu ngoại vi) đối với bệnh lý ung thư vú.

Các kết quả cho thấy phương pháp MSP được sử dụng phổ biến và phù hợp trong hướng nghiên cứu xác định tính chất methyl hóa gen BRCA1, p16INK4a hướng đến thiết lập quy trình tiên lương, chẩn đoán theo phương pháp MSP đối với bệnh lý ung thư vú. Các kết quả phân tích ghi nhận giá trị OR thể hiện độ chênh OR trong khoảng 1-2 nhưng không có ý nghĩa đối với thống kê (P>0,05) về tính chất methyl hóa trên gen BRCA1, p16INK4a xuất hiện ở bộ mẫu bệnh ung thư vú giữa các nhóm so sánh trên một số phân hạng đặc điểm bệnh học ung thư vú: giữa độ tuổi muộn so với độ tuổi sớm, giai đoạn bệnh muộn (III và IV) so với giai đoạn bệnh sớm (I và II); phân độ mô học cao so với phân độ mô học thấp, biểu hiện có và không có u lympho đối với nhóm người bệnh ung thư vú. Nói cách khác, chúng tôi cần phải khai thác, đào xới chi tiết đối với các dữ liệu để vào phõn tớch tổng hợp cũng như cỏc nội dung khảo sỏt thực nghiệm để làm rừ hơn mối tương quan giữa sự methyl hóa bất thường trên các gen mục tiêu và cơ chế - diễn tiến bệnh ung thư vú.

Dữ liệu vùng gen mục tiêu BRCA1 và p16 INK4a

Chú thích: Vị trí bắt cặp của cặp mồi methyl; Vị trí bắt cặp của cặp mồi unmethyl;. Trình tự nucleotide màu đỏ: Vị trí bắt cặp cặp mồi ngoài phản ứng Nested-MSP. 4 Vị trí hoạt động của cặp mồi nested-MSP trên gen p16INK4a Chú thích: Vị trí bắt cặp của cặp mồi methyl; Vị trí bắt cặp của cặp mồi.

Dựa vào công cụ LASAGNA, chúng tôi xác định được vùng promoter gen BRCA1 mang một số nhân tố phiên mã : CACCC-binding factor, FOXJ2 ,. Sử dụng công cụ LASAGNA, chúng tôi ghi nhận một số vị trí nhân tố phiên mã: CACCC-binding factor, FOXJ2,. Tóm lại, dựa vào các dữ liệu về vị trí đảo CpG trên vùng trình tự gen mục tiêu: BRCA1 và p16INK4a được trình bày ở trên, chúng tôi định hướng được vùng trình tự mục tiêu.

Khảo sát bộ mồi trong quy trì nh Nested - MSP

Tiếp theo, chúng tôi dựa trên phần mềm IDT Analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer) để kiểm tra thông số vật lý của các cặp mồi: chiều dài, nhiệt độ nóng chảy, %GC và mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin, self-dimer, hetero-dimer. (1) : mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc hairpin (kcal.mole). (2) : mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer (kcal/mole) (3) : mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole).

Song song, chúng tôi khảo sát vị trí bắt cặp, tính đặc hiệu của các bộ mồi trên vùng trình tự mục tiêu bằng công cụ Annhyb và công cụ Blast (Phụ lục). BRCA1_UR khuếch đại đặc hiệu trạng thái allen có hoặc không bị methyl hóa. & P16INK4A _UR khuếch đại đặc hiệu trạng thái allen có hoặc không bị methyl hóa của vùng trình tự promoter gen P16INK4a.

3 Vị trí bắt cặp của bộ mồi Nested-MSP xác định tính chất methyl hóa trên trình tự promoter gen BRCA1và P16INK4a.

Kết quả thực nghiệm khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức vùng promoter gen BRCA1 và gen p16 INK4a trên mẫu bệnh phẩm ung thư vú

Sự hiện diện hai băng sản phẩm PCR đồng thời (143 bp và 68 bp) là điểm lưu ý về thông số thành phần phản ứng Nested-MSP trong các nội dung nghiên cứu tiếp theo (về sau), cụ thể là lượng sản phẩm PCR khuếch đại bởi cặp mồi BRCA1_F, BRCA1_R đưa vào phản ứng MSP lần lượt với cặp mồi BRCA1-MF, BRCA1-MR và BRCA1-UF, BRCA1-UR. Chú thích: (%*) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa hoặc không bị methyl hóa trên từng phân hạng so với tổng số mẫu của phân hạng; (%**) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa từng phân hạng so với tổng số mẫu bị methyl hóa hoặc xác định theo số lượng mẫu không bị methyl hóa từng phân hạng so với tổng số mẫu không bị methyl hóa. Trong đó, xét ở phân hạng Her2/Neu âm và “Triple Negative: ER (âm) – PR (âm) – Her (âm)” đều có tần số methyl hóa là 100%, đây là dữ kiện có thể biểu thị tính chất methyl hóa bất thường trên gen BRCA1 xuất hiện ở các ca bệnh ung thư khó đáp ứng điều trị liệu pháp hoóc môn và liệu pháp tấn công Her2.

Đồng thời, dựa vào thông tin mẫu bệnh phẩm, chuyên đề khóa luận tiến hành phân tích tần số methyl hóa trên vùng promoter gen p16INK4a theo một số phân hạng tương ứng với nội dung phân tích tổng hợp, gồm có: độ tuổi sớm (<50 tuổi) và độ tuổi muộn (≥50), sự biểu hiện ER, PR, HER2/NEU: âm và dương; sự biểu hiện “Triple-negative của ER, PR, HER2/NEU”. Trong đó, xét ở phân hạng “Triple Negative: ER (âm) – PR (âm) – Her (âm)” đều có tần số methyl hóa là 100%, đây là dữ kiện có thể biểu thị tính chất methyl hóa bất thường trên gen p16INK4a xuất hiện ở các ca bệnh ung thư khó đáp ứng điều trị liệu pháp hoóc môn và liệu pháp tấn công Her2. Chú thích: (%*) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa hoặc không bị methyl hóa trên từng phân hạng so với tổng số mẫu của phân hạng; (%**) được xác định theo số lượng mẫu methyl hóa từng phân hạng so với tổng số mẫu bị methyl hóa hoặc xác định theo số lượng mẫu không bị methyl hóa từng phân hạng so với tổng số mẫu không bị methyl hóa.

Tổng kết nội dung khảo sát thực nghiệm với quy trình Nested-MSP trên cỡ mẫu nhỏ (tổng số bệnh phẩm xét trên từng gen mục tiêu) ghi nhận tần số xuất hiện tính chất methyl hóa trên gen BRCA1 và p16INK4a lần lượt là 92,9% và 87,5% trên bộ mẫu ung thư vú ở Việt Nam.