Khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các gene brca1 p16ink4a rassfia cyclin d2 và gstp1 trên các bệnh nhân bị ung thư vú

Y BAN NHÂN DÂN TP HCM KHOA H C VÀ CÔNG NGH GIÁO D C & ÀO T O I H C M TP HCM BÁO CÁO NGHI M THU KH O SÁT M C METHYL HÓA T I CÁC O CpG THU C VÙNG PROMOTER C A CÁC GEN BRCA1, p16INK4 , RASSF1A, CYCLIN D2 VÀ GSTP1 TRÊN CÁC B NH NHÂN B UNG TH VÚ Ch nhi m tài: PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy TS.BS oàn Th Ph ng Th o THÀNH PH H CHÍ MINH THÁNG 1/2014 i CL C Tóm t t n i dung nghiên c u Danh sách ch vi t t t Danh sách b ng Danh sách hình ng quy t tốn ng d trù kinh phí giai n II Ph n m u Ph n báo cáo tv n I T ng quan 1.1 T ng quan v epigenetics 1.2 T ng quan v gen RASSF1A, BRCA1, cyclin D2, GSTP1 p16INK4a 1.2.1 Gen RASSF1A 1.2.2 Gen BRCA1 1.2.3 Gen cyclin D2 1.2.4 Gen GSTP1 1.2.5 Gen p16INK4a 1.3 Các ph ng pháp phát hi n s methyl hóa DNA 1.3.1 Ph ng pháp Methylation-Specific PCR (MSP) 1.3.2 Ph ng pháp Q-MSP 1.3.3 Ph ng pháp BSP II N i dung ph ng pháp III K t qu th o lu n 3.1 N i dung - L y m u nghiên c u 3.2 N i dung - Kh o sát c m mô b nh h c 3.3 N i dung - Th c hi n k thu t hoá mô mi n d ch v i hai th th p53 HER2/neu 3.4 N i dung 4- Kh o sát in silico o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 3.5 N i dung - Kh o sát c m methyl hoá t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16 INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 ng Methylation-specific-PCR 3.6 N i dung - Kh o sát c m methyl hoá t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 ng gi i trình t s n ph m Methylation-specific-PCR 3.7 N i dung – X lý s li u IV K t lu n ngh Trang ii iii iv v vii viii 10 14 14 16 19 21 23 35 36 36 37 38 54 55 55 57 58 71 82 83 99 ii TÓM T T N I DUNG NGHIÊN C U Ung th vú m t c n b nh ph bi n nguyên nhân gây ch t hàng m c b nh th gi i B nh v n ang có xu h bi t n ng gia t ng th gi i, ph c c ang phát tri n ó có Vi t Nam Nghiên c u s d ng k thu t Methylation-specific PCR (MSP) nh u kh o sát m c methyl hóa 200 m u mơ c sinh thi t t b nh nhân ung th vú 20 m u mơ vú lành tính thu th p b nh vi n ih cYD c thành ph H Chí Minh Các gen BRCA1 (gen s a ch a DNA), p16INK4a Cyclin D2 (nhóm gen c), RASSF1A (gen è nén u) u hòa chu trình t bào), GSTP1 (gen gi i c ch n ki m tra t n s methyl hóa t qu cho th y t l methyl hóa c a gen BRCA1 cao nh t chi m 85% Ti p theo gen Cyclin D2, p16INK4a, GSTP1 RASSF1A có t l methyl hóa l n t 57.5, 48.5, 46.5 40% Tính ch t methyl hóa n m gen kh o sát m c tr ng c a b nh ung th vú, u c c ánh giá làm t ng nguy c d n n nh Kh n ng phát hi n s methyl hóa m u b nh ng sàng l c m t lúc n m gen b i bao ph i Vi t Nam r t cao t 100% s m u kh o sát SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Breast cancer is the common cause of death among women in most countries worldwide, with rapidly increases in the developing countries, including Vietnam The best opportunity for improving the survival is thought to be had an early detection through the promising biomarker: DNA hypermethylation In present study, with the aim towards using the hypermethylation at CpG islands of promoter of candidate genes as the biomarker for Vietnamese population, sensitive methyl specific PCR (MSP) was carried out to analyze the hypermethylation status of the panel of five genes including BRCA1, p16INK4 , GSTP1, RASSF1A and Cyclin D2 in 220 samples including 200 breast cancer specimens and 20 normal breast tissues from another disease (not breast cancer) which were obtained Ho Chi Minh City Medical Hospital, Vietnam The results indicated that the hypermethylation of one or more genes occurred in all total of 200 tumor specimens (100% diagnostic coverage), considered to be a specific characteristic of Vietnamese breast cancer patients, with the frequencies for methylation of each genes were 85, 57.5, 48.5, 46.5 and 40% for BRCA1, p16 INK4 , GSTP1, RASSF1A and CyclinD2 gene, respectively iii DANH SÁCH CÁC CH 5’UTR 3’UTR A bp BRCA1 C CDKN2A DNA DNMT dNTP G GSTP1 IDT M mRNA MSP NCBI PCR RASSF1A T Taq Tm U UV VI T T T 5‘ Untranslated Region 3‘ Untranslated Region Adenine Base pair Breast cancer susceptibility Cytosine Cyclin-Dependent Kinase inhibitor 2A Deoxyribonucleic acid DNA methyltransferase Deoxynucleoside triphosphate Guanine Glutathione S-transferase Pi-1 Integrated DNA Technology (công ty IDT) Methylated messenger Ribonucleic acid Methylation specific PCR National Center for Biotechnology Information Polymerase chain reaction Ras association domain family isoform A Thymine Thermus aquaticus Melting temperature Unmethylated Ultraviolet iv DANH SÁCH B NG ng 1.1 Danh sách ch n l c biomarker ti m n ng cho ung th B ng 1.2 Khái quát nghiên c u v n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 p16INK4a ng 2.1 Phân mơ b nh h c ng 2.2 Quy trình nhu m HMMD máy BenchMark XT B ng 2.3 Thông s c p m i b t gen BRCA1 B ng 2.4 Thành ph n ph n ng PCR ng 2.5 Chu kì nhi t c a ph n ng PCR B ng 2.6 Chu trình nhi t bi n i bisulfite c a Epitech bisulfite Kit B ng 2.7 Thành ph n ph n ng Q-MSP ng 2.8 Chu trình nhi t ph n ng Q-MSP ng 2.9 Chu kì nhi t c a ph n ng MSP B ng 2.10 Di n gi i ý ngh a c a t su t chênh (odd ratio – OR) nguy c t ng i (Relative risk – RR)* ng 3.1 Giai n ung th vú B ng 3.2 Phân lo i mô h c ng 3.3 Phân mơ h c B ng 3.4 Tình tr ng HER2/new ng 3.5 Tình tr ng p53 B ng 3.6 Trình t m i thông s v t lý B ng 3.7 N ng ch t l ng DNA tách chi t ng 3.8 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen v i ung th vú ng 3.9 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen BRCA1 v i y u t c n lâm sàng c m gi i ph u b nh b nh nhân ung th vú ng 3.10 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen Cyclin D2 i y u t c n lâm sàng c m gi i ph u b nh b nh nhân ung th vú ng 3.11 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen GSTP1 i y u t c n lâm sàng c m gi i ph u b nh b nh nhân ung th vú ng 3.12 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen p16INK4 v i y u t c n lâm sàng c m gi i ph u b nh b nh nhân ung th vú ng 3.13 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen RASSF1A i y u t c n lâm sàng c m gi i ph u b nh b nh nhân ung th vú ng 3.14 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen BRCA1 v i tình tr ng bi u hi n Her2/neu p53 b nh nhân ung th vú lành tính ng 3.15 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen Cyclin D2 i tình tr ng bi u hi n Her2/neu p53 b nh nhân ung th vú lành tính B ng 3.16 M i t ng quan gi a l methyl hóa t i vùng promoter c a gen p16INK4 v i tình tr ng bi u hi n Her2/neu p53 b nh nhân ung th vú lành tính ng 3.17 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen GSTP1 i tình tr ng bi u hi n Her2/neu p53 b nh nhân ung th vú lành tính ng 3.18 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter c a gen RASSF1A i tình tr ng bi u hi n Her2/neu p53 b nh nhân ung th vú lành tính ng 3.19 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen BRCA1 i ung th vú ng 3.20 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen Cyclin D2 i ung th vú ng 3.21 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen GSTP1 i ung th vú Trang 13 25 40 42 47 47 47 48 49 50 50 53 56 56 57 58 58 69 72 83 84 85 86 87 88 90 91 92 93 94 94 95 96 v ng 3.22 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16INK4a i ung th vú B ng 3.22 M c liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen RASSF1A ng 3.24 Các m u có l n l t không, m t, hai, ba, b n gen b methyl hóa b m u nh ph m ung vú 96 97 42 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 b sung nhóm –CH3 vào v trí 5’ c a cytosine nh DNMTs Hình 1.2 Tóm t t vai trị sinh h c c a RASSF1A Hình 1.3 Các vùng ch c n ng c a BRCA1 Hình 1.4 phosphoyl hóa Rb gi i phóng E2F Hình 1.5 T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 p16INK4a ung th vú Hình 1.6: T n s methyl hóa c a n m gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 p16INK4a t bào bình th ng Hình 1.7: T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a gen RASSF1A, GSTP1, BRCA1, cyclin D2 p16INK4a ung th vú nói chung phân chia theo giai n b nh Hình 1.8 X lý sodium bisulfite s chuy n i cytosine thành ur Hình 3.1 Hình nh vi th lo i carcinơm xâm l n Hình 3.2 Hình nh bi u hi n th th HER2/neu Hình 3.3 Hình nh p53 Hình 3.4 nh v gen RASSF1A nhi m s c th s Hình 3.5 u trúc gen RASSF1A Hình 3.6 Trình t gen RASSF1A s phân b c a m t s nhân t phiên mã Hình 3.7 nh v gen BRCA1 nhi m s c th s 17 Hình 3.8 u trúc gen BRCA1 Hình 3.9 Trình t gen BRCA1 s phân b c a m t s nhân t phiên mã Hình 3.10 nh v gen Cyclin D2 nhi m s c th s 12 Hình 3.11 u trúc gen Cyclin D2 Hình 3.12 Trình t gen Cyclin D2 s phân b c a m t s nhân t phiên mã Hình 3.13 nh v gen GSTP1 nhi m s c th s 11 Hình 3.14 u trúc gen GSTP1 Hình 3.15 Trình t gen GSTP1 s phân b c a m t s nhân t phiên mã Hình 3.16 nh v gen p16INK4a nhi m s c th s Hình 3.17 u trúc gen p16INK4a Hình 3.18 Trình t gen p16INK4a s phân b c a m t s nhân t phiên mã Hình 3.19: t qu ki m tra c hi u m i methyl/BRCA1 (WT3) b ng Methblast Hình 3.20a th bi u di n k t qu kh o sát m i methyl WT7, c tr ng cho gen GSTP1 DNA ch ng Hình 3.20b th bi u di n k t qu phân tích nhi t nóng ch y c a s n ph m MSP gi a m i methyl WT7 DNA ch ng Hình 3.21a th bi u di n k t qu kh o sát m i unmethyl WT8, c tr ng cho gen GSTP1 DNA ch ng Hình 3.21b th bi u di n k t qu phân tích nhi t nóng ch y c a s n ph m MSP gi a m i unmethyl WT8 DNA ch ng Hình 3.22 K t qu n di s n ph m MSP nh m kh o sát nhi t lai t i u c a c p m i 10 15 17 20 26 27 29 36 55 57 58 59 59 60 60 61 61 62 62 63 63 64 64 65 65 66 68 74 75 75 76 77 vi WT9 Hình 3.23 K t qu n di s n ph m MSP v i c p m i methyl c hi u cho gen BRCA1, p16INK4a , RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 27 m u b nh ph m ung th vú Hình 3.24 t qu gi i trình t s n ph m MSP gen RASSF1A Hình 3.25 K t qu n di s n ph m MSP gen BRCA1 Hình 3.26 K t qu gi i trình t s n ph m MSP gen BRCA 78 79 80 82 vii NG QUY T TOÁN tài: Kh o sát m c methyl hóa t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, RASSF1A, cyclin D2, GSTP1 p16 INK4a b nh nhân b ung th vú Ch nhi m: TS Lê Huy n Ái Thúy & ThS BS oàn Th Ph ng Th o quan ch trì: H M TP HCM Th i gian ng ký h p ng: 24 tháng (t tháng 12/20120 n tháng 12/2012) Th i gian th c hi n giai n I: t tháng 12/2010 n tháng 12/2011 ng kinh phí c t: 600.000.000 VN Kinh phí c p giai n I: 350.000.000 VN theo TB s : 233/H -SKHCN ngày 07/12/2010 VT:1000 TT i dung Kinh phí n m 2011 Trong ó Ngân sách Ngu n khác I Kinh phí c p n m: 350.000 350.000 II Kinh phí quy t tốn n m Cơng ch t xám 350.000 24.000 350.000 24.000 Cơng th khốn 90.488,065 90.488,065 Nguyên, nhiên v t li u, d ng c , ph tùng, VPP,… 206.539, 935 206.539, 935 Thi t b 0 Xét t, giám 5.281 5.281 nh, nghi m thu i ngh , h i th o 5.691 5.691 ánh máy tài li u 0 Giao thông liên l c Chi phí III IV Ti t ki m 5% Kinh phí n p tr ngân sách u hành 18.000 18.000 0 viii NG S TT D NG KINH PHÍ GIAI i dung Kinh phí n m 2011 N II Trong ó Ngân sách Ngu n khác I Kinh phí c p n m th II: 190.000 190.000 II Kinh phí quy t tốn n m II Công ch t xám 190.000 12.000 190.000 12.000 Công thuê khoán 80.000 80.000 Nguyên, nhiên v t li u, d ng c , ph tùng, VPP,… 83.000 83.000 Thi t b 0 Xét t, giám 0 nh, nghi m thu i ngh , h i th o 0 ánh máy tài li u 0 Giao thông liên l c Chi phí III IV Ti t ki m 5% Kinh phí n p tr ngân sách u hành 15.000 15.000 0 PH N M Tên tài: Kh o sát m c U methyl hóa t i o cpg thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4 , RASSF1A, CYCLIN D2 GSTP1 b nh nhân b ung th vú Ch nhi m tài: PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy & TS BS oàn Th Ph ng Th o quan ch trì: H M TP HCM Th i gian th c hi n: 24 tháng (t tháng 12/2010 Kinh phí c t: 600.000.000 VN Kinh phí ã c p: 540.000.000 VN n tháng 6/2013) theo TB s : 233/H -SKHCN ngày 07/12/2010 c tiêu: Tìm hi u s methyl hóa t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4A, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 b nh nhân b ung th vú ng i Vi t Nam nh m ánh giá tiên li u, xác nh ph ng pháp u tr i dung: - L y m u nghiên c u, thu th p d li u v c - Kh o sát c, v trí u, mô vú xâm l n mô vú c m mơ b nh h c: kích th m: tu i, gi i tính ung th t i ch , hóa mô mi n d ch - Kh o sát in silico o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1, nh n di n di n vùng trình t - Kh o sát c o có th xem “hot-spot”, nh n thi t k m i m methyl hoá t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16 INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 ng PCR bao g m: + Thi t l p quy trình tách chi t DNA thích h p t sinh thi t mô + Thi t l p quy trình x lý DNA b ng sodium bisulfite + Thi t l p quy trình tinh s ch DNA sau x lý sodium bisulfite + Thi t l p quy trình methylation-specific PCR (MSP) nh m phát hi n s methyl hóa t i vùng promoter gen + Kh o sát c m methyl hoá t i o CpG thu c vùng promoter c a gen BRCA1, p16INK4a, RASSF1A, cyclin D2 GSTP1 ng MSP 130 Codes X Codes Y Codes Y NHÓM (