0536KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG METHYL HÓA TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỌC VÙNG PROMOTER CỦA GEN GS7P1 TRÊN MỘT SỐ LOẠI UNG THƯ

B TR GIÁO D C VÀ ÀO T O NG IH CM TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P TÀI: KH O SÁT TÌNH TR NG METHYL HÓA T I CÁC O CpG THU C VÙNG PROMOTER C A GEN GSTP1 TRÊN M T S LO I UNG TH KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH-SINH H C PHÂN T Gi ng viên h ng d n: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao Sinh viên th c hi n: MSSV: Khóa h c: c Thu n Võ Th Ngh a 1053010489 2010 - 2014 Tp H Chí Minh, tháng n m 2014 Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n L IC M có đ N c báo cáo khóa lu n nƠy đơy lƠ k t qu c a m t th i gian dài tìm hi u th c hi n đ tài, nh ng n l c c a b n thân s giúp đ , h ng d n c a th y góp m t ph n r t l n đ em có th hoƠn thƠnh đ tài L i đ u tiên em xin chân thành c m n Cô_PGS.TS Lê Huy n Ái Thúy lƠ ng đ ng tên h cô đƣ h i đƣ ng d n em k khóa lu n tôt nghi p này, em xin chân thành c m n ng d n, góp Ủ đ em có th hoàn thành t t báo cáo Em c ng xin chơn thƠnh c m n Th y_ThS Lao c Thu n m t ng i th y, ng i anh ln t n tình quan tơm vƠ giúp đ em th i gian qua, trình s a báo cáo c ng nh trình th c nghi m ng th i em c ng xin c m n b n phịng thí nghi m Sinh H c Phân T c ng nh t t c b n, em khóa 2011 nhóm nghiên c u khoa h c khoa Công Ngh Sinh H c tr ng i H c M Thành Ph H Chí Minh đƣ giúp đ em q trình làm khóa lu n c ng nh chia s nh ng khó kh n su t trình v a qua Cu i cùng, xin g i l i c m n đ n gia đình đƣ lƠ ch d a tinh th n, ti p thêm cho ngu n đ ng l c r t l n nh ng lúc khó kh n lƠm đ tài khóa lu n t t nghi p Tuy nhiên, h n ch v ki n th c c ng nh th i gian nên báo cáo khóa lu n t t nghi p không tránh kh i nh ng thi u sót Vì v y, em r t mong nh n đ c s đóng góp ý ki n quý báu c a q Th y, Cơ đ em có th hoàn thi n h n nh ng hi u bi t v chuyên đ M t l n n a xin chân thành c m n m i ng i Kính chúc m i ng i th t nhi u s c kh e, ni m vui, thành công cu c s ng công vi c! TP H CHệ MINH, ngƠy 22 tháng n m 2014 SV Võ Th Ngh a SV: Võ Th Ngh a i Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n M CL C DANH M C HÌNH v DANH M C B NG vii DANH M C CH VI T T T ix PH N T NG QUAN V UNG TH 1.1 T NG QUAN V UNG TH 1.1.1 Tình hình ung th th gi i 1.1.2 Tình hình ung th Vi t Nam 1.2 T NG QUAN V D U CH NG SINH H C (Biomarkers) 1.3 EPIGENETICS 1.3.1 Khái ni m epigenetics 1.3.2 o CpG 10 1.3.3 Khái ni m methyl hóa DNA 11 1.3.4 C ch gơy ung th s methyl hóa DNA 13 1.4 T NG QUAN V GEN GSTP1 15 1.4.1 GST (glutathione S-transferases) 15 1.4.2 Gen GSTP1 (Glutathione S Tranferase P1) 15 1.4.3 C ch ho t đ ng c a GSTP1 16 1.5 Các ph ng pháp phát hi n s methyl hóa DNA 19 1.5.1 Ph ng pháp bi n đ i BSP (Bisulfide sequencing PCR) 19 1.5.2 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP) 19 PH N V T LI U VÀ PH SV: Võ Th Ngh a NG PHÁP NGHIÊN C U ii Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n 2.1 V T LI U 20 2.1.1 Khai thác c s d li u 20 2.1.2 Kh o sát in vitro 21 2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 23 2.2.1 Khai thác c s d li u 23 2.2.2 Kh o sát in silico 23 2.3 KH O SÁT IN VITRO 24 2.3.1 Tách chi t DNA 24 2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph 26 2.3.3 Bi n đ i bisulfide DNA 26 2.3.4 Ph n ng MSP 27 2.3.5 i n di gel agarose 29 PH N K T QU VÀ TH O LU N 3.1 KHAI THÁC D LI U 30 3.1.1 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 ung th vú 31 3.1.2 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 ung th c t cung 34 3.1.3 Th ng kê s li u t n s Methyl hóa c a GSTP1 ung th n ti nli t 36 3.2 K T QU KH O SÁT IN SILICO 40 3.2.1 Trình t nhân t phiên mã c a gen 40 3.2.2 ánh giá thông s v t lý m i 43 3.3 K T QU TH C NGHI M 49 3.3.1 K t qu tách chi t DNA 40 3.3.2 K t qu ph n ng MSP m u DNA b nh ph m ung th vú 50 SV: Võ Th Ngh a iii Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 3.4 M C GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n LIÊN QUAN TÍNH CH T METHYL HĨA T I VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 V I NHÓM TU I/ TU I C A CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ 54 3.5 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I GIAI O N B NH C A CÁC B NH NHÂN UNG TH 3.6 KH O SÁT M C NGUY C T LIÊN QUAN (T SU T CHÊNH - ODD RATIO - OR VÀ NG HịA V I UNG TH VÚ 54 I - RELATIVE RISK - RR) GI A TệNH CH T METHYL VÚ 55 PH N K T LU N VÀ NGH 4.1 K T LU N 54 4.2 NGH 58 TÀI LI U THAM KH O 59 PH L C 67 SV: Võ Th Ngh a iv Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n DANH M C HỊNH Hình 1.1 T l m c b nh t l t vong toàn th gi i n m 2012 Hình 1.2 T l m c b nh t vong ung th c a Vi t Nam n m 2012 Hình 1.3 Methyl hóa DNA đ c nghiên c u r ng rƣi nh m t d u ch ng sinh h c Hình 1.4 S methyl hóa c a cytosine t o thành 5-methylcytosine 10 Hình 1.5 S b sung nhóm -CH3 vào v trí 5’c a cytosine nh enzyme DNMTs 12 Hình 1.6 Mơ hình s bi n đ i gen b i methyl hóa DNA t o kh i u 13 Hình 1.7 C ch gơy ung th c a DNA methylation 14 Hình 1.8 V trí gen GSTP1 NST s 11 16 Hình 1.9 Ch c n ng c a protein GSTP1 t bào 17 Hình 1.10 Mơ hình mơ t t đ ng tác c a GSTP1-JNK GSTP1- TRAF2 ng di u ch nh tín hi u JNK TNF- 18 Hình 1.11 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1 qua lo i m u ung th vú khác 34 Hình 1.12 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1 qua lo i m u ung th c t cung khác 36 Hình 1.13 Bi u đ t n s methyl hóa c a GSTP1qua lo i m u ung th n ti n li t khác 39 Hình 1.14 V trí gen GSTP1 nhi m s c th s 11[92] 40 Hình 1.15 Các đ o CpG vùng promoter gen GSTP1 41 Hình 1.16 S phân b c a m t s y u t phiên mã gen GSTP1 42 SV: Võ Th Ngh a v Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n Hình 1.17 C u trúc gen GSTP1 43 Hình 1.18 V trí b t c p c a m i methyl lên gen GSTP1 46 Hình 1.19 K t qu Annhyb m i methyl GSTP1 vùng trình t kh o sát 46 Hình 1.20 K t qu n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F G-M-R 50 Hình 1.21 K t qu n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F G-M-R 51 Hình 1.22 K t qu gi i trình t s n ph m MSP c a gen GSTP1 52 SV: Võ Th Ngh a vi Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n DANH M C B NG B ng 1.1 T ng k t tình tr ng ung th th gi i 2012 B ng 1.2 Trình t m i methyl s d ng cho MSP 28 B ng 1.3 Chu trình nhi t cho ph n ng MSP v i GSTP1 28 B ng 1.4 T n s Methyl hóa c a gen GSTP1 m u ung th vú 31 B ng 1.5 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a GSTP1 ung th vú 33 B ng 1.6 Th ng kê t n s Methyl hóa c a gen GSTP1 m u ung th c t cung 34 B ng 1.7 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c aGSTP1 ung th c t cung 35 B ng 1.8 Th ng kê t n s Methyl hóa c a gen GSTP1 m u ung th n ti n li t 36 B ng 1.9 Th ng kê t n s methyl hóa trung bình có tr ng s c aGSTP1 ung th n ti n li t 38 B ng 1.10 Trình t m i methyl tham kh o t nghiên c u tr c c a phịng thí nghi m sinh h c phân t 45 B ng 1.11 Thông s v t lý c a m imethyl k th a t i phịng thí nghi m sinh h c phân t đ i h c M TP.HCM 45 B ng 1.12 M i tham kh o t báo th ng kê 47 B ng 1.13 Thông s đánh giá m i theo IDT 48 B ng 1.14 N ng đ ch t l SV: Võ Th Ngh a ng DNA tách chi t 49 vii Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n B ng 1.15 T ng k t k t qu methyl hóa c a GSTP1 10 m u ung th vú 53 B ng 1.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i ung th vú 57 SV: Võ Th Ngh a viii Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n DANH M C CH VI T T T CpG: Cytosine phospho guanine DNMTs: DNA methyltransferase DNMT1: DNA methyltransferase DNMT3A: DNA methyltransferase 3A DNMT3B: DNA methyltransferase 3B IDT: Integrated DNA technology JNK: C-Jun N-terminal kinase GSH: glutathionine HDAC (Histone deacetylase ) MSP: Methylation Specific PCR PCR: Polymerase Chain Reaction SAM: S-adenosylmethionine UTR: Untranslated Region UV: Ultraviolet WHO: World Health Organization MBD: Methylation-binding protein TRDs: Transcription re-pression domains SV: Võ Th Ngh a ix Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 3.5 M C GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I GIAI CÁC B NH NHÂN UNG TH O N B NH C A VÚ K t lu n methyl Giai đo n b nh T l D Âm ng (33,3 %) (0%) (20%) 2 (33,3 %) (25%) (30 %) (0%) (25%) (10 %) (0%) (25%) (10 %) N (33,3%) (25%) (30%) (60%) (40%) 10 (100%) Chi-squared 4.444 DF Significance P = 0.3492 i v i y u t giai đo n ung th : s li u đ Chi ậ squared c th ng kê b ng phép th ng kê cho th y tình tr ng methyl hóa có s phân b r i rác đo n t giai đo n đ n giai đo n 4, tình tr ng methyl c ng đ giai c tìm th y m u lành Tuy nhiên, k t qu methyl hóa ch a cho th y tính ch t methyl hóa t i v trí CpG thu c vùng promoter gen GSTP1 đ c kh o sát nghiên c u có liên quan v i giai đo n b nh ( p= 0,3492) SV: Võ Th Ngh a 55 Báo Cáo Khóa Lu n T t Nghi p N m h c: 2010 - 2014 GVHD: PGS TS Lê Huy n Ái Thúy ThS Lao c Thu n 3.6 KH O SÁT M C LIÊN QUAN (T SU T CHÊNH - ODD RATIO - OR VÀ NGUY C T NG I - RELATIVE RISK RR) GI A TệNH CH T METHYL HịA V I UNG TH VÚ B ng 1.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i ung th vú GSTP1 v i ung th vú Lo i m u Không methyl Methyl M u lành M u ung th (60%) (40%) T su t chênh (OR) Ti s nguy c