Hình 1 .22 Kt qu g ii trình ts n p hm MSP ca gen GSTP1
B ng 1.10 Trình t mi methyl tham kh ot nghiên cu tr c ca phịng thí ngh im sinh
Gen Kí hi u m i Trình t m i (5’-3’)
GSTP1
G1-M-F CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
G1-M-R CCAACGAAAACCTCGCGACCTCCG
B ng 1.11 Thông s v t lỦ c a m i methyl k th a t i phịngthí nghi m sinh h c phơn t đ i h c M TP.HCM [3] Gen Trình t m i (5’-3’) L Tm( o C) (1) (2) (3) %GC P (bp) GSTP1 G1-M-F 22 59,1 -0,33 -10,36 -10,36 61,5 199 G1-M-R 24 64 -1.62 -13,51 -10,36 62,5
Trong đó, Tm lƠ nhi t đ nóng ch y c a m i, (1) là m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc hairpin loop, (2) là m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc homodimer, và (3) là m c n ng l ng liên k t t do cho kh n ng hình thƠnh c u trúc heterodimer, P lƠ kích th c s n ph m, F-m i xuôi, R-m i ng c.
T k t qu thu đ c b ng 1.11 chúng tôi nh n th y: thông s chi u dài c a m i là phù h p cho m t ph n ng PCR (M i xuôi methyl G1-M-F dài 22 bp; m i ng c methyl G1-M-R dài 24 bp), thông s %GC và Tm c a m i ch a th t s t i u (M i G1-M-F và G1-M-R có % GC l n l t lƠ 61,5, 62,5 v t ra ngoài gi i h n cho phép). V thông s delta G, chúng tôi nh n th y các thông s nƠy đa ph n l n h n giá tr âm 9 kcal/mol. Chúng tôi s đ c bi t chú Ủ đ n chúng trong quá trình th c nghi m.
SV: Võ Th Ngh a 46 Hình 1.18 V trí b t c p c a m i methyl lên gen GSTP1
V trí b t c p c a m i là vùng mƠu xanh đ c ký hi u trên hình 1.18, vùng màu
đ là exon 1. Trình t khu ch đ i đ c chính lƠ đo n n m gi a hai m i.
SV: Võ Th Ngh a 47 V trí b t c p c a m i đ c xác đnh b ng Annhyb (hình 11.19) cho th y m i khu ch đ i đo n trình t thu c vùng đ o CpG th 2 n m trên vùng promoter c a GSTP1 v i kích th c khu ch đ i đ c c a trình t là 199bp. Tóm l i t các k t qu kh o sát thông s v t lý c a m i cùng v i k t qu thu đ c khi cho m i b t c p v i trình t đích trên Annhyb chúng tơi quy t đnh s b m i nƠy đ a vƠo th c nghi m đ
kh o sát t n s methyl hóa t i các đ o CpG c a GSTP1.
B ng 1.12M i tham kh o t các bƠi báo th ng kê
Lo i ung th Bài báo tham
kh o Trình t m i (5’3’)
Ung th vú [12]
M-F TTC GGG GTG TAG CGC TCG TC
M-R GCC CCA ATA CTA AAT CAC GAC G
U-F GAT GTT TGG GGT GTA GTG GTT GTT
U-R CCA CCC CAA TAC TAA ATC ACA ACA
Ung th c t cung [8] M-F TTCGGGGTGTAGCGGTCGTC M-R GCCCCAATACTAAATCACGACG U-F GATGTTTGGGGTGTAGTGGTTGTT U-R CCACCCCAATACTAAATCACAACA
B ng 1.12 lƠ b ng trình t m i cho MSP tham kh o t các bƠi báo th ng kê c a các tác gi (Ana Paula Sarreta Terra, 2007) và (Anubha Saxena, 2012).
SV: Võ Th Ngh a 48
B ng 1.13Thông s đánh giá m i theo IDT
Gen Lo i ung th Trình t m i (5’-3’) L Tm ( oC) (1) (2) (3) %GC P (bp) GSTP1 Ung th vú G1-M-F 20 62 0,13 -13,09 -9,21 65 91 G1-M-R 22 55,8 1,51 -3,61 50 G1-U-F 24 57,6 1,55 -1,47 -16,4 45,8 97 G1-U-R 24 55,1 1,51 -1,47 41,7 Ung th c t cung G1-M-F 20 61,8 -0,16 -3,61 -9,21 65 91 G1-M-R 22 55,8 1,51 -3,61 50 G1-U-F 24 57,6 1,55 -1,47 -16,4 45,8 97 G1-U-R 24 55,1 1,51 -1,47 41,7
B ng 1.12, 1.13 là trình t và các thông s v t lý c a m i tham kh o trong các bài báo nghiên c u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i ung th lƠ ung th vú vƠ ung th c t cung. Các trình t m i đ c đánh giá trên IDT, nhìn chung các
thông s c a m i đ u n m trong gi i h n cho phép c a m i, nh ng c ng t ng t nh
b m i cho MSP k th a t nghiên c u tr c c a phịng thí nghi m sinh h c phân t
n ng l ng liên k t t do hình thành c u trúc heterodimer c a m i xi methyl hóa thì
v t ra ngồi gi i h n cho phép c a m i (-13,09).
T k t qu thu đ c b ng 1.13 chúng tôi nh n th y: thông s chi u dài c a m i là phù h p cho m t ph n ng PCR, thông s % GC và Tm c a m i ch a th t s t i u
SV: Võ Th Ngh a 49 V thông s delta G, chúng tôi nh n th y các thông s nƠy đa ph n l n h n giá tr âm 9 kcal/mol.
Vi c thu th p các trình t m i cho ph n ng MSP khu ch đ i vùng promoter c a GSTP1, đ ng th i chúng tôi c ng tham kh o m i t nghiên c u tr c đơy c a phịng thí nghi m sinh h c phân t nh m m c đích tìm ra nh ng c p m i phù h p nh t cho ph n ng khu ch đ i MSP (tr c tiên là các thông s v t lý c a m i). T s so sánh gi a 2 h m i trên chúng tôi nh n th y r ng c hai h m i nƠy đ u có nh ng thơng s
ch a th t s phù h p cho ph n ng MSP: ví d nh Tm hay % GC. Vì v y nên chúng tôi quy t đ nh s d ng h m i k th a t i phịng thí nghi m sinh h c phân t nh m ti t ki m chi phí th c nghi m.
3.3 K T QU TH C NGHI M
3.3.1 K t qu tách chi t DNA
đánh giá ch t l ng các m u b nh ph m ung th vú đ c tách chi t b ng ph ng
pháp phenol/chloroform, chúng tôi ti n hƠnh đo OD các m u DNA đƣ tách chi t, k t qu th hi n b ng 1.14.
B ng 1.14N ng đ vƠ ch t l ng DNA tách chi t
M u A260nm H s pha loãng A260nm /A280nm N ng đ (ng/µl) M u A260nm H s pha lỗng A260nm /A280nm N ng đ (ng/µl) 1 0,020 80 0,8630 0,9849 6 0,081 80 0,063 4,0440 2 0,020 80 1,2450 0,9849 7 0,017 80 0,017 0,8374 3 0,116 80 1,2901 5,8141 8 0,038 80 0,029 1,8810 4 0,031 80 0,9496 1,5655 9 0,047 80 0,033 2,3262
SV: Võ Th Ngh a 50 5 0,062 80 1,2901 3,1145 10 0,010 80 0,012 0,4958
V i k t qu đo OD thu đ c trên cho th y ch t l ng DNA tách chi t ch a t t, m u DNA còn nhi m protein th hi n qua thông s A260nm/A280nm th p và n ng đ DNA thu đ c ch a cao.
3.3.2 K t qu ph n ng MSP trên các m u DNA b nh ph m ung th vú
M u b nh ph m ung th vú sau khi đ c tách chi t và bi n đ i bisulfide, chúng tôi th c hi n ph n ng MSP đ kh o sát m c đ methyl hóa c a các m u DNA b nh ph m v i c p m i đ c hi u cho GSTP1. Ph n ng MSP v i m i methyl đ c hi u cho GSTP1 đ c th c hi n trên 10 m u b nh ph m ung th vú. K t qu thu đ c đ c th hi n trên hình 1.19 và 1.20.
Hình 1.20 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R Hình 1.20 là k t qu đi n di c a 5 m u b nh ph m ung th vú 1, 2, 3, 4, 5 và Hình 1.20 là k t qu đi n di c a 5 m u b nh ph m ung th vú 1, 2, 3, 4, 5 và m u âm. Theo k t qu trên hình 1.20, s n ph m khu ch đ i MSP c a các m u 2, 3, 4, 5 t o thƠnh có kích th c nh mong đ i lƠ 199 bp. i u này ch ng t các m u nƠy đƣ b
SV: Võ Th Ngh a 51 methyl hóa. Ch ng âm khơng xu t hi n v ch s n ph m cho th y các v ch s n ph m
trên đơy xu t hi n là lo i tr kh n ng b nhi m DNA t bên ngồi.
Hình 1.21 K t qu đi n di s n ph m MSP v i c p m i methyl G1-M-F và G-M-R
T ng t nh v y, hình 1.21 là k t qu đi n di c a 5 m u b nh ph m DNA ung
th vú 6, 7, 8, 9, 10 và m u âm. K t qu trên hình cho th y MSP âm tính v i t t c các m u, nh đi n di khơng cho th y có xu t hi n v ch s n ph m. i u này cho th y các m u trên là khơng b methyl hóa.
Nhìn chung, tuy có s xu t hi n c a các v ch s n ph m nh ng các v ch s n ph m lƠ ch a rõ rƠng. i u này có th là do ch t l ng c a DNA tách chi t lƠ ch a t t, n ng đ DNA th p c ng nh b đ t gãy hay b m t trong quá trình b o qu n d n đ n hi u su t b t c p th p, vì th l ng DNA khu ch đ i ch a đ đ cho k t qu đi n di rõ ràng.
SV: Võ Th Ngh a 52 Hình 1.22 K t qu gi i trình t s n ph m MSP c a gen GSTP1
(a)Là vùng trình t GSTP1 ch a bi n đ i bisulfide (b)Là vùng trình t GSTP1 đã bi n đ i bisulfide
Trình t g ch d i, in đ m: trình t g n c a m i xuôi methyl G1-M-F. Các cytosine không thu c đ o CG đ c tô màu vàng. CG đ c tơ màu xanh.
(c)Là trình t thu đ c t gi i trình t v i c p m i xuôi methyl G1-M-F. Vùng 1: vùng g n c a m i ng c methyl; vùng 2: v trí c a 6 CG n m trong vùng kh o sát; vùng 3:
v trí c a 3 CG n m trong vùng kh o sát.
Phân tích k t qu gi i trình t c a m i xuôi methyl t s n ph m MSP v i m i methyl hóa c a GSTP1 trên cho th y, vùng cu i c a trình t này xu t hi n chính xác t ng nucleotide c a m i ng c methyl (vùng 1, hình 1.22). Hình nƠy c ng cho th y c 4 v trí CpG trên m i ng c methyl đ u b methyl hóa.
SV: Võ Th Ngh a 53 Bên c nh đó, vùng trình t n m gi a hai m i cho k t qu trùng kh p , 6 v trí CG trong vùng 2 và 3 v trí CG trong vùng 3 đ u b methyl hóa ( hình 1.22, vùng 2 và 3). T k t qu trên cho th y r ng vùng trình t DNA đ c kh o sát dƠi 199 bp đƣ b methyl hóa hoƠn toƠn. Các đnh tín hi u hu nh quang t ng đ i cao và rõ ràng, h u h t là có duy nh t m t đnh tín hi u (hình 1.22(c)).
ng th i k t qu gi i trình t trên cịn cho th y quá trình bi n đ i DNA b ng sodium bisulfide th c hi n tr c đó đƣ thành cơng. Các cytosine không n m trong c p
dinicleotide CpG đ u đ c chuy n thành uracil.
B ng 1.15T ng k t k t qu methyl hóa c a GSTP1 trên 10 m u ung th vú
M u GSTP1 M u GSTP1 1 - 6 - 2 + 7 - 3 + 8 - 4 + 9 - 5 + 10 -
Nh v y, v i nh ng k t qu in silico và in vitro thu đ c chúng tôi m t l n n a kh ng đnh tính khoa h c c a b m i đ c s d ng cho MSP nh m đánh giá tình tr ng
methyl hóa đ i di n cho vùng promoter c a gen GSTP1 trên ung th vú. Tuy v y, vì th i gian có h n và nh ng g p khó kh n trong q trình xin m u ung th tuy n ti n li t nên chúng tôi v n ch a ti n hành th c nghi m đ c trên ung th c t cung vƠ ung th
SV: Võ Th Ngh a 54
3.4 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I
VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I NHịM TU I/ TU I C A CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ Phân nhóm tu i K t lu n methyl T l Âm D ng N1 (<40) 3 (50,0 %) 1 (25,0 %) 4 (40%) N2 (40-50) 2 (33,3 %) 1 (25,0 %) 3 (30 %) N3 (>50) 1 (16,7 %) 2 (50,0 %) 3 (30 %) 6 (60%) 4 (40%) 10 (100 %) Chi ậ squared 1,319 DF 2 Significance P = 0,5241
B ng phép th ng kê Chi ậ squared, chúng tôi đƣ kh o sát đ c m c đ liên quan c a tính ch t methyl hóa c a vùng promoter c a GSTP1 v i nhóm tu i c a các b nh nhơn ung th vú (b ng ph l c). Qua giá tr P thu đ c 0,5241 (p> 0,05), đi u này cho th y m c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter trên GSTP1 v i nhóm tu i không đ t Ủ ngh a th ng kê.
SV: Võ Th Ngh a 55
3.5 M C LIÊN QUAN TệNH CH T METHYL HịA T I
VỐNG PROMOTER GEN GSTP1 V I GIAI O N B NH C A
CÁC B NH NHÂN UNG TH VÚ Giai đo n b nh K t lu n methyl T l Âm D ng 1 2 (33,3 %) 0 (0%) 2 (20%) 2 2 (33,3 %) 1 (25%) 3 (30 %) 3 0 (0%) 1 (25%) 1 (10 %) 4 0 (0%) 1 (25%) 1 (10 %) N 2 (33,3%) 1 (25%) 3 (30%) 6 (60%) 4 (40%) 10 (100%) Chi-squared 4.444 DF 4 Significance P = 0.3492
i v i y u t giai đo n ung th : s li u đ c th ng kê b ng phép th ng kê Chi ậ squared trên cho th y tình tr ng methyl hóa có s phân b r i rác các giai
đo n t giai đo n 2 đ n giai đo n 4, tình tr ng methyl c ng đ c tìm th y trong các m u lành. Tuy nhiên, k t qu methyl hóa ch a cho th y tính ch t methyl hóa t i các v trí CpG thu c vùng promoter gen GSTP1 đ c kh o sát trong nghiên c u có liên quan v i giai đo n b nh ( p= 0,3492).
SV: Võ Th Ngh a 56
3.6 KH O SÁT M C LIÊN QUAN (T SU T CHÊNH - ODD
RATIO - OR VÀ NGUY C T NG I - RELATIVE RISK -
RR) GI A TệNH CH T METHYL HịA V I UNG TH VÚ
B ng 1.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i ung th vú
GSTP1 v i ung th vú
Lo i m u Không methyl Methyl Giá tr p*
M u lành 2 1 M u ung th 4 3 6 (60%) 4 (40%) <0,05 T su t chênh (OR) 1,50 <0,05 Ti s nguy c 1,33 <0,05
K t qu th ng kê cho th y t su t trên OR=1,50, có ngh a lƠ nhóm b methyl hóa vùng promoter c a gen GSTP1 v i y u t nguy c , t l ung th vú cao g p 1,5 l n so v i nhóm khơng b methyl hóa, s chênh l ch nƠy lƠ đáng tin c y (P<0,05).
T s nguy c RR=1,33 có ngh a lƠ nguy c b nh ung th vú nhóm b methyl hóa vùng promoter c a gen GSTP1 cao g p 1,33 l n so v i nhóm khơng b methyl hóa, s khác bi t nƠy lƠ có Ủ ngh a th ng kê (p <0,05)
PH N 4.
SV: Võ Th Ngh a 57
4.1 K T LU N
Qua quá trình th c hi n đ tài, chúng tôi rút ra m t s k t lu n sau:
M t l n n a kh o sát l i t n s methyl hóa c a GSTP1 trên ung th vú sau khi k
th a k t qu c a nh ng nghiên c u tr c v t n s methyl hóa c a GSTP1 trên lo i
ung th nƠy.
B c đ u tìm hi u v t n s methyl hóa c a GSTP1 trên ung th tuy n ti n li t thông qua các bài báo nghiên c u trên th gi i. K t qu cho th y ti m n ng r t l n đ
GSTP1 tr thành d u ch ng sinh h c trong vi c phát hi n ung th tuy n ti n li t.
ƣ thƠnh công trong vi c th c hi n ph n ng MSP kh o sát m c đ methyl hóa c a GSTP1 trên 10 m u b nh ph m ung th vú v i t l methyl hóa là 4/10 m u.
Nh ng d li u v methyl hóa c a GSTP1 trên 3 lo i ung th : ung th vú, ung th
c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t thu nh n đ c là r t có giá tr trong vi c tích l y đ hình thành m t c s d li u nh m h ng t i vi c s d ng hi n t ng methyl hóa
nh m t d u ch ng sinh h c ti m n ng trong ch n đoán, tiên l ng vƠ đi u tr 3 lo i
ung th trên mƠ nh t lƠ đ i v i ung th tuy n ti n li t khi mà t n s methyl hóa c a GSTP1 trên gen nƠy khá cao (43,3%) c ng nh s l ng nghiên c u v methyl hóa c a gen nƠy trên ung th tuy n ti n li t lƠ t ng đ i nhi u.
Hi n t ng methyl hóa t i vùng promoter c a GSTP1 v i y u t nguy c lƠm t ng kh n ng m c b nh ung th vú cao g p 1,50 (OR=1,50, p<0,05) so v i nhóm khơng b methyl hóa. ng th i, nguy c m c b nh ung th vú nhóm b methyl hóa vùng promoter c a GSTP1 c ng cao g p 1,33 l n so v i nhóm khơng b methyl hóa (RR=1,33, p<0,05).
SV: Võ Th Ngh a 58