áng chú Ủ lƠ protein GSTP1 tham gia vƠo vi c xúc tác cho s g n c a glutathione tripeptide (ch t ch ng oxy hóa) v i m t lo t ch t l c đi n t bao g m c genotoxin, ch t gơy ung th vƠ các ch t hóa tr li u t đó giúp các t bào tránh kh i nh ng tác nhân là các g c oxy hóa này [6]. Khi có s methyl hóa quá m c t i các đ o CpG trên vùng promoter c a gen thì s bi u hi n c a gen s b c ch .
1.4.3 C ch ho t đ ng c a GSTP1
Nh đƣ trình bƠy trên GSTP1 đóng m t vai trò quan tr ng trong nhi u ho t
đ ng c a c th v i nhi u ch c n ng khác nhau, trong đó GSTP1 n i b t v i vi c tham gia vào ph n ng stress và quá trình apoptosis c ng nh trong s t ng sinh c a t bào [21].
SV: Võ Th Ngh a 17 Hình 1.9 Ch c n ng c a protein GSTP1 trong t bƠo [48]
Ho t đ ng c a protein GSTP1 bao g m tham gia xúc tác cho s k t h p c a glutathione (GSH) - m t ch t ch ng oxy hóa trong t bƠo đ ng v t, n m và vi khu n v i nh ng g c oxy hóa nh các ph c h p ái l c đi n t , các ch t gơy ung th vƠ m t s ch t ngo i sinh khác t đó ng n ch n s ti p xúc c a các g c oxy hóa này đ i v i các t bƠo trong c th . Ngoài ho t đ ng xúc tác cho s g n c a glutathionine (GSH) v i các g c oxy hóa, protein GSTP1 cịn đ c bi t đ n v i vai trò là m t phi enzyme. V i vai trò là m t phi enzyme, ho t đ ng c a protein GSTP1 là g n v i C-Jun N- terminal kinase (JNK) thu c h protein kinase và TRAF2 (TNF receptor- associated factor 2) đ hình thành ph c h p GSTP1/JNK [25, 35, 43, 48]. Ph c h p này s kích ho t vƠ đáp ng v i các kích thích hay stress c a t bào ch ng h n nh đáp ng v i các y u t tia c c tím hay nhi t đ , t đó làm kích ho t q trình apoptosis. Bên c nh
đó, ph c h p c a protein GSTP1/JNK cịn kích ho t y u t phiên mã AP-1 đ kích ho t q trình phiên mã bi u hi n ch c n ng c a gen. Nh v y v i vai trò c a m t phi
SV: Võ Th Ngh a 18
enzyme, GSTP1 đóng vai trị quan tr ng trong d n truy n tín hi u t bào, k t qu c a ho t đ ng này nh m quy đnh m t con đ ng ki m soát s t ng sinh vƠ s ch t c a t bào b ng con đ ng apoptosis [33, 40, 42,68].
Vi c methyl hóa quá m c x y ra trên vùng promoter c a GSTP1 s lƠm ng n c n s g n c a các y u t phiên mã lên vùng promoter c a gen, đ ng th i enzyme RNA polymerase II khơng cịn kh n ng t ng tác v i vùng promoter. K t qu là làm c ch quá trình phiên mã gây gi m sút ho t đ ng và m t ki m soát các con đ ng ch c n ng
c a gen. Do đó lƠm gián đo n ho c d ng c ch s a ch a DNA, lúc này nh ng t n
th ng DNA s tích l y d n trong khi t bào v n đi vƠo quá trình sao chép vƠ phơn
bào b t k các đ t bi n hay sai h ng DNA gây ra nhi u quá trình b t l i cho c th mà nghiêm tr ng nh t là d n đ n ung th [32, 33, 36, 49].
Hình 1.10 Mơ hình mơ t t ng tác c a GSTP1-JNK và GSTP1- TRAF2 trong con
SV: Võ Th Ngh a 19
1.5 CÁC PH NG PHÁP PHÁT HI N S METHYL HÓA DNA
1.5.1 Ph ng pháp bi n đ i BSP (Bisulfide sequencing PCR)
BSP là m t ph n ng PCR di n ra qua hai b c: b c đ u tiên là s bi n đ i sodium bisulfide DNA.Ti p sau đó lƠ th c hi n ph n ng PCR khu ch đ i trình t
DNA đƣ đ c bi n đ i b i các m i đ c hi u. S n ph m PCR có th đ c s d ng theo
ba h ng sau: gi i trình t sau khi t o dịng, gi i trình t tr c ti p ho c k t h p v i các enzyme c t gi i h n nh y v i hi n t ng methyl hóa đ ki m tra s methyl hóa c a các v trí CpG đ c bi t [73].
1.5.2 Ph ng pháp Methylation Specific PCR (MSP)
MSP là m t k thu t PCR m i có đ nh y phát hi n đ n 0,1%, đ c s d ng đ đánh giá nhanh chóng tình tr ng methyl hóa c a h u h t các v trí CpG bên trong đ o CpG, do Herman và c ng s đ ara vƠo n m 1996 [22]. Trình t DNA đích tr c khi th c hi n ph n ng MSP ph i đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, khi m u DNA đ c bi n đ i bisulfide thì nh ng Cytosine khơng b methyl hóa trên đo n trình t s đ c bi n đ i thành Uracil (CU). Sau khi đ c bi n đ i v i sodium bisulfide, m u DNA s đ c khu ch đ i v i hai c p m i methyl và không methyl đ c thi t k đ phân bi t gi a nh ng alen b methyl hóa và nh ng alen khơng b methyl hóa, c ng nh đ phân bi t v i nh ng DNA đƣ bi n đ i bisulfide v i nh ng DNA ch a bi n đ i bisulfide [18]. đ t đ c nh ng m c tiêu này thì trình t m i cho ph n ng MSP th ng đ c thi t k ch a nhi u Cytosine và có các c p CpG n m g n v trí 3’ c a các base [33].
PH N 2.
V T LI U VÀ PH NG
SV: Võ Th Ngh a 20
2.1 V T LI U
2.1.1 Khai thác c s d li u
2.1.1.1 Kh o sát in silico
có đ c nh ng thơng tin đáng tin c y, nhóm nghiên c u chúng tôi đƣ ti n
hƠnh khai thác c s d li u trên PubMed b ng nh ng t khóa khác nhau nh :
Epigenetics, DNA methylation, GSTP1, Methyl-specific PCR, Breast cancer, Cervical cancer, Prostate cancer.
Nh ng bƠi báo đ c ch n l c đ th ng kê s li u đ c d a trên m c đ tin c y c a t p chí đ ng t i có mã tiêu chu n qu c t ISSN (International Standard Serial Number) và nh ng bài báo nghiên c u ung th vú, ung th c t cung vƠ ung th
tuy n ti n li t c a gen kh o sát GSTP1.
Trình t m i đ khu ch đ i gen GSTP1 đ c tham kh o tr c ti p trong các bài báo nghiên c u v m c đ methyl hóa trong ung th vú vƠ ung th c t cung c a nhóm nghiên c u tr c đơy c a phòng sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM [3].
2.1.1.2 Các cơng c và ch ng trình s d ng trong kh o sát in silico
PubMed: M t c s d li u trích d n và tóm t t cho v n h c y sinh h c t MEDLINE và khoa h c đ i s ng thêm t p chí. Liên k t đ c cung c p khi có phiên b n toƠn v n c a các bài vi t có s n thơng qua PubMed Central (M t kho l u tr k thu t s c a y sinh h c toƠn v n vƠ đ i s ng v n h c khoa h c t p chí, bao g m c y h c lâm sàng và y t công c ng.) ho c các trang web khác. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/all/).
TFSearch (Transcription For Search): LƠ ch ng trình tr c tuy n đ c Yutaka
Akiyama ( i h c Kyoto) l p trình nh m giúp xác đ nh v trí nh n bi t c a các nhân t phiên mã trên vùng promoter c a gen.
SV: Võ Th Ngh a 21 Clustal: Là dãy các phiên b n ph n m n phân tích k t qu thí nghi m v c u trúc c a chu i DNA hay protein, b ng cách so sánh đ ng th i gi a t t c các chu i trình t ,
đ tìm ki m phát hi n ra nh ng đ c đi m đ ng nh t đ c đi m g n g i hay phơn ly gi a chúng.
Andhyb: Ki m tra v trí b t c p c a m i, m u dị vƠ kích th c s n ph m.
IDT (Integrated DNA Technologies): IDT analyzer
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác đ nh các thông s quan tr ng c a m i nh kích th c, thành ph n GC, nhi t đ lai, kh n ng t o hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,....
2.1.2. Kh o sát In vitro
2.1.2.1 V t li u
V t li u là 10 m u mô đúc paraffin b nh ph m ung th vú đ c cung c p b i b môn gi i ph u b nh thu c i h c Y D c TP.HCM. 2.1.2.2 D ng c và hóa ch t D ng c và hóa ch t tách chi t Phenol Merck Chloroform Merck SDS 10 % Bio Rad NaCl 5 M Tris HCl 1 M (pH=8)
EDTA 0.5 M (pH=8) Bio Rad
NH4OAc 5 M
Ethanol 100 % Vi t Á Ethanol 70 % Vi t Á
SV: Võ Th Ngh a 22 Proteinase K Fermentas
Máy ly tâm l nh Hettich
D ng c và hóa ch t cho ph n ng MSP
Máy PCR Bio Rad Master mix Bio Rad
M i IDT
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đo quang ph
Máy đo quang ph : Bio Rad
N c c t 2 l n
D ng c và hóa ch t đi n di
Máy đi n di BioRad Gel agarose BioRad
TE 1X BioRad
Ethidium Bromide BioRad Loading dye BioRad
SV: Võ Th Ngh a 23
2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Khai thác c s d li u
Ti n hành khai thác d li u trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), s d ng công c Pubmed v i các t khóa epigenetics, DNA methylation, breast cancer, cervical cancer, Prostate cancer nh m thu th p thông tin, d li u bao g m nh ng thông tin t ng quan v t n s methyl hóa c a ung th vú, ung th c t cung, ung th tuy n ti n li t, epigenetics, methyl hóa DNA, thu th p trình t c a gen GSTP1 thông qua mã s accession number NC_000011.10 c a nhi m s c th 11.
2.2.2 Kh o sát in silico
2.2.2.1 Th ng kê t n s methyl hóa
Th ng kê trung bình có tr ng s : Trung bình có tr ng s là giá tr trung bình có ph n ánh t m quan tr ng c a các ph n t (hay giá tr quan sát) trong t p h p đó. M i m t giá tr quan sát s đ c g n m t tr ng s nh m lo i b các y u t có th nh
h ng đ n k t qu th ng kê nh ph ng pháp ti n hành th c nghi m khác nhau, ngu n g c m u b nh nhân khác nhau, s l ng m u khác nhau hay th i gian khác nhau.
Sau khi đƣ thu th p các s li u v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 trên hai lo i
ung th lƠ ung th vú,ung th c t cung vƠ ung th tuy n ti n li t chúng tôi ti n hành th ng kê trung bình có tr ng s và v bi u đ v t n s methyl hóa c a gen GSTP1 qua các lo i m u khác nhau (bao g m m u mô đúc parafin, m u huy t thanh, m u máu và m u n c ti u).
SV: Võ Th Ngh a 24 2.2.2.2 Thu nh n trình t gen, xác đ nh c u trúc gen và đ o CpG
Trong ti n trình kh o sát in silico, b c đ u tiên chúng tôi ti n hành thu nh n trình t gen GSTP1 t ngân hàng gen b ng mã s truy c p là NC_000011.10 k t h p v i ch ng trình Ensemble đ l y đúng trình t vùng promoter c a gen GSTP1.
Sau đó chúng tơi ti n hƠnh xác đ nh các vùng ch c n ng quan tr ng c a gen nh :
promoter, 5’UTR, exon 1, v trí g n c a các nhân t phiên mã b ng ch ng trình
TFsearch, xác đ nh các đ o CpG b ng Methprimer. 2.2.2.3 ánh giá m i
i v i đo n m i cho ph n ng MS-PCR chúng tôi đƣ tham kh o t m t s bài báo th c nghi m trên ngân hàng d li u NCBI c ng nh k th a m i methyl và
unmethyl đƣ đ c thi t k và th nghi m cho MSP trên gen GSTP1 t nhóm nghiên c u t i phịng thí nghi m sinh h c phân t tr ng đ i h c M Tp.HCM nh ng n m tr c [3]. Sau đó chúng tơi ti n hành kh o sát đánh giá các thông s v t lý trên IDT nh m xác đnh m t s thông s quan tr ng nh : kích th c m i, % GC, nhi t đ lai, kh n ng t o các c u trúc hairpin loop, heterodimer. Kh n ng b t c p b sung, v trí b t c p vƠ kích th c s n ph m t o thành c a m i đ c ki m tra b ng ph n m n Annhyb-4.944, phiên b n 2011. 2.3 KH O SÁT IN VITRO 2.3.1 Tách chi t DNA 2.3.1.1 Nguyên t c Ph ng pháp đ c s d ng đ tách chi t DNA là ph ng pháp
phenol/chloroform. Do đ c thù c a ngu n m u đ c b o qu n trong paraffin nên chúng tôi đƣ s d ng xylene đ x lỦ paraffin tr c khi ti n hành tách chi t DNA.
SV: Võ Th Ngh a 25 h p s c nhi t. Sau đó protein s đ c bi n tính b ng phenol/chloroform và b lo i b . DNA b gen s đ c t a v i ethanol l nh.
2.3.1.2 Các b c ti n hành
B c 1: Ti n hành c t nh m u b nh ph m cho vào ng eppendorf lo i 1,5 ml, thêm 1ml xylene, vortex 1 phút, ly tơm 13000 vòng/phút trong 2 phút. Sau ly tơm đ b ph n d ch n i (l p l i 3 l n).
B c 2: Thêm 1ml Ethanol 100 %, vortex 2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau ly tơm đ b ph n d ch n i, s l n l p l i ph thu c vào s l n x lý v i xylene.
B c 3: Làm khô m u: làm khô t nhiên ho c dùng máy s y trong 30 phút.
B c 4: Thêm 700 µl dung d ch lysis buffer, 55oC t 2-4 ngày.
B c 5: Cho 700 µl dung d ch phenol/chloroform (t l 1:1). Ly tâm 1000 vòng/trong 3 phút. Sau ly tâm dung d ch trong eppendorf tách thành 3 l p, trong đó DNA n m l p trên cùng. Hút l y l p d ch DNA v i th tích kho ng 500-600 µl. L p l i b c này 2 l n.
B c 6: Cho 500 µl chloroform. em ly tơm 10000 vòng/phút trong 3 phút. Dung d ch
sau ly tơm đ c phân tách v i ph n d ch n i phía trên ch a DNA. Dùng pipet hút 300µl l p d ch ch a DNA, có th hút nhi u h n nh ng c n l u Ủ tránh ch m vào l p dch phía d i.
B c 7: Thêm 60 µl (0,2V d ch DNA) NH4OAc 5M cho ti p vào 750 µl (2,5V d ch DNA) ethanol 100%. Tr n đ u đ nhi t đ -20oC trong 1 gi . Sau đó ly tơm l nh 10 phút 4oC . sau khi ly tâm DNA t a l i đáy eppendorf, đ b phân dch thu đ c DNA k t t a.
B c 8: thêm 500 µl ethanol 70%, ly tâm l nh 13000 vòng/phút trong 5 phút 4oC. b ph n dch thu đ c DNA.
SV: Võ Th Ngh a 26
B c 9: DNA sau khi thu s đ c làm khô t nhiên ho c s y khơ.
B c 10: Thêm 30-50 µl n c.
2.3.2 Ki m tra ch t l ng DNA thu nh n b ng ph ng pháp đo quang ph
2.3.2.1 Nguyên t c
HƠm l ng DNA có th xác đ nh đ c nh s h p thu m nh ánh sáng b c sóng 260 nm. Giá tr m t đ quang OD260nm (Optical Density 260 nm) c a các m u
DNA cho phép xác đnh n ng đ DNA trong dung d ch (v i A260nm= 1OD = 50 µg/ml DNA s i đôi). tinh s ch c a DNA đ c đánh giá qua t l A260/A280. Có th xem DNA thu nh n đƣ tinh s ch khi giá tr nƠy dao đ ng t 1,8 ậ 2,0 [1].
2.3.2.2 Các b c ti n hành
DNA sau khi tách chi t đ c pha loãng 6 l n b ng n c c t vơ trùng. Sau đó
chuy n t t c dung dch vƠo cuvette vƠ đo n ng đ DNA b c sóng 260 nm. tinh s ch c a dung dch đ c xác đnh b ng OD260/OD280.
2.3.3 Bi n đ i bisulfide DNA
S d ng b kít Epitect Kit (Qiagen, Cat.No59104) đ th c hi n bi n đ i bisulfide m u DNA tách chi t.
B c 1: Chu n b ch t bi n đ i EZ1 (CT conversion reagent): tr n đ u 900 µl dung d ch n c c t 2 l n vƠ 300 µl dung d ch EZ2 (M-Dilution bufer), 50 µl dung d ch EZ3
(M-Dissolving buffer) vƠo ng EZ1, tr n đ u trong 10 phút.
B c 2: B sung 130 µl dung d ch EZ1 và 20 µl dung d ch DNA vƠo eppendorf 250 µl, tr n đ u.
B c 3: X lỦ dung d ch DNA theo chu trình nhi t:
98oC/10 phút
SV: Võ Th Ngh a 27
64oC/60 phút
64oC/30 phút
B c 4: Sau đó, b sung 600 µl EZ4 (M-binding buffer) vƠ dung d ch DNA đ c x