KHẢO SÁT TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN p76/XK“2 TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC VÙNG PROMOTER TRÊN MỘT SÓ BỆNH UNG THƯ

T NG QUAN V UN G TH

Khái ni m ung th

Ung thư được định nghĩa theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) là một thuật ngữ chung cho một nhóm lớn các bệnh có thể ảnh hưởng đến bất kỳ phần nào của cơ thể Một đặc trưng của ung thư là sự tăng trưởng nhanh chóng của các tế bào một cách bất thường Các tế bào này phát triển không kiểm soát được, hình thành các khối u ác tính và xâm nhập vào các bộ phận gần hoặc xa của cơ thể thông qua hệ thống mạch máu Ung thư phát sinh từ một tế bào đơn lẻ Việc chuyển đổi từ một tế bào bình thường thành tế bào khối u là một quá trình nhiều giai đoạn, thường liên quan đến một số biến đổi di truyền trong một tế bào nhất định.

Tình tr ng ung th trên th gi i vƠ Vi t Nam

Theo thống kê GLOBOCAN năm 2012, trên toàn cầu có khoảng 14,1 triệu ca mắc bệnh ung thư, trong đó có 8,2 triệu ca tử vong và 32,6 triệu người sống sót sau 5 năm chẩn đoán ung thư.

Các b nh ung th ph bi n trên th gi i: [78]

Ph i (1,8tri u ng i, chi m kho ng 13,0%)

Vú (1,7tri u ng i, chi m kho ng 11,λ%) i tr c trƠng (1,4 tri u ng i, chi m kho ng λ,7%)

Lý Th Tuy t Ng c Trang 5

Hình 1.1 T l m c b nh vƠ t l t vong trên toƠn th gi i [78]

Theo T ch c Y t Th gi i (WHO) vƠ B Y t Vi t Nam, ung th hi n nay đang lƠ nguyên nhơn th 2 gơy t vong Vi t Nam M i n m Vi t Nam có kho ng 150.000

- 200.000 ng i m c b nh ung th m i vƠ kho ng 75.000 - 100.000 ng i t vong

1.2.2.1 Tình tr ng ung th vú

Theo th ng kê c a T Ch c Y T Th Gi i (WHO), ung th vú (Breast cancer) lƠ nguyên nhơn hƠng đ u gơy t l t vong cao nh t ph n trên th gi i, theo

Globocan (2012), trên th gi i có kho ng 522.000 ph n b t vong trong 1,7 tri u t ng s ph n m c b nh ung vú, đ c bi t gia t ng nhanh chóng các n c phát tri n, trong đó bao g m Vi t Nam [53]

Ung thư vú đã trở thành một vấn đề sức khỏe nghiêm trọng tại Việt Nam, với tỷ lệ mắc bệnh gia tăng đáng kể Cụ thể, tỷ lệ ung thư vú ở phụ nữ đã tăng từ 13,8% trên 100.000 phụ nữ vào năm 2000 lên 28,1% vào năm 2010 Đến năm 2010, Việt Nam ghi nhận khoảng 12.533 ca mắc ung thư vú.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 6

Hình 1.2 T l m c b nh ung th vú trên toƠn th gi i [53]

1.2.2.2 Tình tr ng ung th c t cung

Ung thư cổ tử cung (ung thư cổ tử cung) là loại ung thư phổ biến thứ ba trong số các loại ung thư ở phụ nữ trên toàn thế giới, với hơn 500.000 trường hợp mới được phát hiện mỗi năm và khoảng 250.000 ca tử vong.

Hi n nay, ung th c t cung (UTCTC) lƠ lo i ung th ph bi n t i Vi t Nam

Hình 1.3 T l m c b nh ung th c t cung trên toƠn th gi i [52]

Lý Th Tuy t Ng c Trang 7

T ng quan ung th vú

1.2.3.1 Khái ni m ung th vú

Ung th vú lƠ m t kh i u ác tính b t đ u trong các t bƠo vú Kh i u ác tính lƠ m t nhóm các t bƠo ung phát tri n x m l n (invasive) xung quanh mô vú hay di c n

(metastasize) đ n c quan khác c a c th B nh ung th vú x y ra ch y u ph n [84]

Hình 1.4 Mô t ung th vú [92]

1.2.3.2 Các y u t nguy c ung th vú: [84]

Gi i tínhμ ung th vú n gi i cao g p kho ng 10 l n so v i nam gi i.

Tu iμ nh ng ph n l n tu i g p nguy c cao.

Y u t di truy nμ nh ng đ bi n thông tin di truy n (gen) lƠm t ng nguy c , nh ng ng i ph n có ti n s gia đìnhm c b nh có nguy c m c b nh cao.

R i lo n n i ti t t ch y u n ng đ estrogen b t th ng trong chu k kinh nguy t hay các ph n mƣn kinh (sau tu i 55) th ng t l m c b nh cao.

Ti p xúc v i các ch t đ c nh tia phóng x uranium, endocrine disruptor, thu c tr sơuầ

1.2.3.3 Phân lo i ung th vú

Theo t ch c Y t Th gi i (WHO) vƠo n m 2011, phơn lo i ung th vú bao g mμ

Lý Th Tuy t Ng c Trang 8

Ung th vú t i ch (Carcinoma in situ)μ ung th ng t i ch , ung th ti u ti u thùy t i ch

Ung th vú x m l n (vasive)μ ung th ti u thùy xơm l n, ung th ng tuy n vú xơm l n, không đ c hi u.

Ung th ng tuy n vú xơm l n d ng đ c hi u.

1.2.3.4.Các giai đo n ung th vú [86][85]

Phơn lo i ung th vú theo giai đo n ung th vú d a trên gi i ph u h c c quan vú, bao g m b n giai đo nμ

Giai đo n 0 lƠ giai đo n ung th t i ch (carcinoma in situ)

Giai đo n ung th t i ch ng d n (DCIS - Ductal carcinoma in situ) đ c tìm th y các t bƠo b t th ng trong ng v i đi u ki n không xơm l n

Giai đo n ung th t i ch các thùy (Lobular carcinoma in situ - LCIS) xu t hi n các t bƠo b t th ng các ti u thùy không b xơm l n.

Giai đoạn Iμ là giai đoạn đầu tiên trong quá trình phát triển của các tế bào ung thư, bao gồm hai giai đoạn IA và IB Trong giai đoạn IA, kích thước khối u nhỏ hơn 2 cm và các tế bào ung thư không chèn ép các tế bào xung quanh.

Giai đo n IBμ các t bƠo ung th có kích th c nh kho ng 0,2 mm đ c tìm th y h ch lympho.

Giai đo n II bao g m hai giai đo n IIA vƠ IIBμ

Giai đo n IIAμ Kh i u có kích th c l n 2 cm vƠ nh h n 5 cm, n mg n h ch lympho nách tuy nhiên không chèn ép h ch lympho.

Giai đo n IIBμ Kh i u có kích th c l n h n 0,2 mm vƠ nh h n 2 cm đ c tìm th y g n h ch lympho không có d u hi u đè nén hay xơm l n.

Giai đo n III bao g m IIIA, IIIB, IIIC:

Giai đo n IIIAμ các kh i u có kích th c l n h n 5 cm, xung quanh các h t lympho

Giai đo n IIIBμ kh i u có nhi u kích th c, chèn ép thƠnh ng c ho c lƠm s ng t y, l loét.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 9

Giai đo n IIICμ kh i u đa d ng v kích th c, chèn ép da vú d n đ n s ng đau vƠ gơy loét.

Giai đoạn IV của bệnh ung thư là giai đoạn cuối, khi các tế bào ung thư di căn qua máu đến các cơ quan khác trong cơ thể Điều này gây chèn ép lên các cơ quan như phổi, gan và thận, dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng.

1.2.3.4 Ph ngphápphát hi n và đi u tr [82][83]

Ph ngphápphát hi n và ch n đoán

Ch n đoán lơm sƠngμ vùng vú có kh i u th ng không đau, l loét, xu t hi n h ch nách,ầ

Ch n đoán b nh lỦμ Siêu ơm, ch p X - quang tuy n vú (nh nh), ch c hút t bƠo b ng kim nh (FNA), sinh thi t mô, ch p c ng h ng t (MRI), PET - CTScanầ i u tr

Ph u thu t (Surgery)μ ph ng pháp c t b các t bƠo ung th , bao g m ph ng pháp c t b toƠn b tuy n vú (mastectomy) hay ch c t b kh i u ph n vú (lumpectomy)

Ph ng pháp x tr (Radiation therapy)μ ph ng pháp s d ng n ng l ng m t s tia đ gi t t bƠo vƠ kìm hƣm s t ng sinh c a t bƠo ung th

Hóa tr (Chemotherapy)μ Ph ng pháp s d ng thu c lƠm ch m quá trình phát tri n các t bƠo ung th b ng cách gi t ch t t bƠo hay lƠm d ng l i s phơn chia t bƠo

M t s thu c đ c s d ng trong đi u tr ung th vú nh Abitrexate, Abraxane,

Ado - Trastuzumab Emtansine, Cyclophosphamide, Cytoxanầ

Liệu pháp nhắm trúng đích và liệu pháp hormone là những phương pháp điều trị hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của ung thư Một số loại thuốc như tamoxifen có tác dụng làm giảm quá trình sản sinh estrogen, từ đó ngăn chặn sự hình thành khối u vú Ngoài ra, các thuốc kháng thể đơn dòng như Trastuzumab (Herceptin) và Bevacizumab (Avastin) cũng được sử dụng để điều trị ung thư vú, mang lại hy vọng cho nhiều bệnh nhân.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 10

T ng quan ung th c t cung

1.2.4.1 Ung th c t cung (Cervicial Cancer)

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là một loại ung thư phát sinh tại vị trí cổ tử cung, thường bắt nguồn từ vùng chuyển tiếp giữa biểu mô trụ và biểu mô vảy Bệnh bắt đầu từ tế bào ung thư tại cổ tử cung, sau đó lây lan sang các mô xung quanh và cuối cùng kết thúc bằng sự phát triển của ung thư xâm lấn Nhiều nguyên nhân gây ra UTCTC, trong đó nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm virus HPV (Human Papilloma virus) Trong trường hợp bệnh nhân được phát hiện sớm và điều trị kịp thời, UTCTC có thể được điều trị hiệu quả.

1.2.4.2 Y u t nguy c b nh ung th c t cung: [88]

Virus HPV (Human papilloma virus) là nguyên nhân chính gây ung thư cổ tử cung, chiếm khoảng 70% ca mắc bệnh này Hai chủng virus HPV phổ biến nhất, chủng 16 và chủng 18, đóng góp lớn vào tỷ lệ mắc ung thư cổ tử cung ở phụ nữ.

Thói quen sinh hoạt không lành mạnh, như hút thuốc và uống rượu, có thể làm suy giảm hệ miễn dịch và tăng nguy cơ nhiễm virus HPV Ngoài ra, tình trạng béo phì cũng làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư cổ tử cung.

Suy giảm miễn dịch có thể dẫn đến các bệnh nhiễm trùng do virus như Chlamydia, HIV/AIDS, và các tác động phụ của thuốc điều trị một số bệnh lây nhiễm, bao gồm cả nhiễm HPV.

Ti n s gia đình m c b nhμ n u m ho c ch gái m c b nh ung th t cung, c h i m c b nh cao h n g p 2 - 3 l n ng i không có ti n s ung th

Nghiên cứu cho thấy, những người có làn da đen có nguy cơ mắc ung thư cao hơn so với người da trắng, đặc biệt là ở phụ nữ và trẻ em gái Điều này cho thấy mối liên quan giữa tình trạng di truyền và nguy cơ mắc bệnh ung thư, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ các yếu tố rủi ro trong cộng đồng.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 11

1.2.4.3 Phân lo i ung th c t cung [81]

Khi u bướu mô bao gồm ung thư biểu mô, ung thư biểu mô giai đoạn đầu không xâm lấn (microinvasive) xảy ra trong tế bào biểu mô, tế bào này bắt đầu bất thường, khiêu khích tiến triển chất.

Kh i u trung mô vƠ đi u ki n kh i unh Leiomyosarcomaầ

Bi u mô h n h p vƠ trung mô bao g mμ ung th ác tính, adenosarcoma, adenofibroma, adenomyoma

H ch b ch huy t vƠ t o máutrong đó g mu lympho ác tính, ung th b ch c u 1.2.4.4 Các giai đo n ung th c t cung [87]

Theo y ban Liên H p M v ung th (AJCC) phơn ra các giai đ an ung th c t cung:

Giai đo n 0μ các t bƠo ung th t i ch (in sitiu)

Giai đo n Iμ các t bƠo ung th n m trong gi i h n t cung bao g mμ giai đo n

IA lƠ giai đo n ung xơm l n vƠ giai đo n IB lƠ ung th có d u hi u t n th ng lơm sƠng

Giải đoán IIμ ung thư xơm là một phương pháp quan trọng trong việc chẩn đoán các loại ung thư không xơm lẫn nhau Phương pháp này giúp xác định các tế bào ung thư không xơm lẫn trong mô cận kề, trong khi giải đoán IIA và IIB liên quan đến ung thư xơm lẫn trong mô cận kề.

Giai đo n IIIμ Kh i u m r ng đ n x ng ch u vƠ ơm đ o n c

Lý Th Tuy t Ng c Trang 12

Giai đoạn IV của ung thư phổi là giai đoạn nghiêm trọng nhất, trong đó tế bào ung thư đã lan rộng ra các cơ quan lớn trong cơ thể Ở giai đoạn IVA, tế bào ung thư di căn đến các cơ quan lân cận, trong khi ở giai đoạn IV, tế bào ung thư lây lan qua hệ thống tuần hoàn.

1.2.4.5 Ph ngpháp ch n đoán ung th c t cung (CC) [90][89]

Các tri u ch ng th ng g pμ ch y máu ơm đ o b t th ng nh sau th i k mƣn kinh hay th ng xuyên b ch y máu ơm đ o.

Dạo gần đây, tình trạng lơ m sông nh xu t hi n m n cóc ơm đ o và th ng xuyên xu t huy t ơm đ o đang gia tăng Tuy nhiên, các tri u ch ng ung th c t cũng thường được phát hiện, giai đo n xơm l n có nguy c t vong cao.

Ung thư cổ tử cung có thể được chẩn đoán thông qua xét nghiệm PAP và nghiên cứu hình ảnh Xét nghiệm PAP giúp phát hiện bất thường trong tế bào cổ tử cung Sau đó, tiến hành soi cổ tử cung để kiểm tra các tế bào này qua kính hiển vi Nếu phát hiện tế bào ung thư cổ tử cung có biểu hiện sớm, cần tiến hành kiểm tra di căn thông qua xét nghiệm máu và chụp CT để kiểm tra sự di căn đến các cơ quan khác Nghiên cứu cũng bao gồm một số phương pháp như MRI và X-quang để xem các tế bào ung thư có thể lan đến phổi.

G m ba ph ng pháp chínhμ ph u thu t (Surgery), x tr (Radiation therapy), hóa tr

(Chemotherapy), trong đi u tr th ng s d ng ba ph ng pháp k t h p mang l i hi u qu cao.

Phẫu thuật thẩm mỹ là một phương pháp hiện đại giúp cải thiện hình dáng và chức năng cơ thể Phẫu thuật bằng tia laser được sử dụng để điều trị các khối u đặc trong giai đoạn 0 mà không gây xâm lấn Kỹ thuật này mang lại hiệu quả cao trong điều trị, đặc biệt trong giai đoạn IA.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 13

Trachelectomy trong giai đo n I, ph u thu t lo i b các c quan lơn c n trong giai đo n di c n nh vùng ơm đ o, x ng ch u, h ch b ch huy tầ

Liệu pháp xạ trị ung thư, bao gồm phương pháp sử dụng năng lượng tia X và liệu pháp Brachytherapy, là những phương pháp điều trị hiệu quả cho các tế bào ung thư Tuy nhiên, các phương pháp này có thể gây ra tác dụng phụ như mệt mỏi, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn, và có thể dẫn đến viêm hoặc di căn đến các tế bào bình thường xung quanh.

Liệu pháp hóa trị là phương pháp điều trị ung thư phổ biến, sử dụng các loại thuốc như Cisplatin, Carboplatin, Paclitaxel, Topotecan và Gemcitabine Những loại thuốc này không chỉ có tác dụng trong việc điều trị ung thư mà còn có thể gây ra các tác dụng phụ như nhiễm trùng, buồn nôn, và ảnh hưởng đến hệ thần kinh.

Ngày nay, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra liệu pháp mới trong việc phát hiện và điều trị ung thư, bao gồm các liệu pháp sinh học và phương pháp hóa mô Các phương pháp này đặc biệt chú trọng vào việc phát hiện gen liên quan đến ung thư, mở ra hướng đi mới trong việc điều trị bệnh.

EPIGENETICS

nh ngh a

Epigenetics là sự thay đổi thông tin di truyền trong quá trình biểu hiện gen mà không làm thay đổi trình tự DNA Điều này cho phép các đặc tính di truyền được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác mà không cần thay đổi cấu trúc di truyền một cách trực tiếp.

Hi n t ng epigenetics

Bi n đ i epigenetics bao g m các hi n t ng methyl hóa DNA, bi n đ i histone vƠ microRNAs [21]

Lý Th Tuy t Ng c Trang 14

Hình 1.6 C ch epigenetics bao g m hi n t ng methyl hóa DNA, bi n đ i histone vƠ micro - RNA [45]

Epigenetics đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen bằng cách ức chế quá trình phiên mã trong chu kỳ sống của tế bào, kiểm soát sự tự sinh của tế bào và điều chỉnh hoạt động của một số gen Các gen này có chức năng điều khiển hoặc chuyên biệt hóa tế bào.

o CpG

Vùng CpG là vùng giàu dinucleotide CpG (cystosine phosphate guanine) có kích thước từ 0,5 đến 4,0 kb, bao gồm các đồn vị cystosine và guanine liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester, với thành phần phân trâm GC cao hơn so với các vùng khác (>50%) trong bộ gen người Các đồn CpG thường kéo dài từ vùng đầu 5’ đến exon 1 thuộc vùng promoter của gen Các tế bào bình thường phần lớn có các đồn CpG không bị methyl hóa, trong khi đó, vùng được methyl hóa thường bắt đầu từ vùng promoter đến exon đầu tiên của gen trong suốt quá trình phát triển và biệt hóa tế bào.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 15

Chu k t bƠo vƠ gen p16 INK4

Gen p16 INK4α đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào và kiểm soát quá trình phân chia tế bào Chu kỳ tế bào là một phần thiết yếu trong sự phát triển và tự sinh của tế bào.

Chu kỳ tế bào bao gồm bốn pha: G1 (GAP 1), S (Synthesis), G2 (GAP 2) và M (Mitosis) Trong pha S, DNA được sao chép, dẫn đến sự hình thành hai tế bào con giống nhau trong pha M Pha G1 và G2 là giai đoạn chuyển tiếp giữa pha S và M, cung cấp thời gian và vật liệu cần thiết cho quá trình sao chép và phân chia tế bào Các tế bào bình thường điều hòa chu kỳ hoạt động trong pha G0 và đầu pha G1 thông qua sự hình thành phức hợp cyclin - CDK4/6, kích hoạt enzyme kinase phụ thuộc cyclin (CDKs - Cyclin Dependent Kinases) thực hiện phosphoryl hóa yếu tố pRb Khi pRb được phosphoryl hóa, nó có khả năng gắn kết với yếu tố phiên mã E2F, hình thành phức hợp pRb - E2F, cho phép tế bào tiến vào pha S và tiếp tục vào các pha G2 và M của chu kỳ tế bào.

Trong quá trình đi u hòa ho t đ ng chu k t bƠo g m có ba đi m ki m soát (check

- point) quan tr ng, có tên lƠ g i restriction - point x y ra t i phachuy n ti p G1/S,

G 2 /M vƠ pha M, đi m ki m soát có ch c n ng phát tín hi u d ng l i hay đi ti p (go

Trong quá trình phát hiện DNA bị hư hỏng tại các điểm kiểm soát G1/S, các yếu tố kiểm soát sẽ phát tín hiệu kìm hãm hoạt động của enzyme kinase (CKIs - Cyclin Kinase Inhibitors) CKIs có chức năng ngăn cản hoạt động của enzyme kinase phụ thuộc vào các yếu tố cyclin (CDKs - Cyclin Dependent Kinases), dẫn đến việc không hình thành phức hợp cyclin/CDKs Quá trình này ảnh hưởng đến phosphoryl hóa pRb (sản phẩm của gen retinoblastoma), khiến pRb tách rời khỏi các yếu tố phiên mã, dẫn đến việc ngăn chặn quá trình sao chép không di truyền và duy trì chu trình tế bào tại điểm kiểm soát G1/S Kết quả là gen chịu trách nhiệm sẽ hoạt động để điều chỉnh DNA trở lại trạng thái bình thường.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 16

CDKs và cyclin là hai nhóm protein quan trọng trong việc kiểm soát chu kỳ tế bào Cyclin D đóng vai trò then chốt trong việc điều hòa chu kỳ, có khả năng liên kết với các enzyme CDKs, chủ yếu là CDK4 và CDK6 Sự hình thành phức hợp CDK4-cyclin D và CDK6-cyclin D giúp kích hoạt enzyme kinase, thực hiện quá trình phosphoryl hóa pRb CDKs là enzyme kinase phụ thuộc vào cyclin và chỉ hoạt động khi liên kết với cyclin.

Methyl hóa DNA

Methyl hóa là quá trình gắn nhóm methyl (CH3-) vào các phần tử DNA, đặc biệt là tại vị trí carbon số 5 của các nucleotide cytosine trong dinucleotide CpG (cystosine - phosphate - guanine).

Methyl hóa DNA là một hiện tượng quan trọng trong nghiên cứu epigenetics, ảnh hưởng đến sự điều hòa biểu hiện gen ở nhiều loại tế bào, bao gồm cả tế bào phôi thai Quá trình này diễn ra bình thường trong sự phát triển của các tế bào và có vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh phiên mã, cấu trúc nhiễm sắc thể, và sự bất hoạt của nhiễm sắc thể X, từ đó ảnh hưởng đến hoạt động của gen.

Quá trình methyl hóa DNA xảy ra sau khi DNA được tổng hợp, được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) Quá trình này hình thành liên kết hóa trị chuyển nhóm methyl từ S-adenosyl-L-methionine (SAM) đến trình tự 5'-CG-3' của cytosine.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 17

Hình 1.7 Quá trình methyl hóa DNA [44]

Hình 1.8 C ch methyl hóa DNA chuy n hóa 5 - cystosine (5C) thƠnh 5 methylcytosine (m5C) [91]

1.3.4.3 Phân lo i và vai trò DNA methylatranferase (DNMT) trong quá trình methyl hóa DNA

Nhóm enzyme methyltranferase (DNMTs) bao gồm hai loại chính: de novo methyltransferase, chịu trách nhiệm methyl hóa các chuỗi DNA tại các dinucleotide CpG, và nhóm methyltranferase duy trì, giúp duy trì trạng thái methyl hóa của DNA tại các dinucleotide CpG Trong đó, DNMT1 thuộc nhóm methyl transferase duy trì, trong khi DNMT3a và DNMT3b thuộc nhóm de novo transferase, tham gia trực tiếp vào quá trình methyl hóa DNA.

Nhóm enzyme de novo methyltranferase, đặc biệt là DNMT3a, chịu trách nhiệm methyl hóa nhóm 5-Cytosine, tạo ra 5-methylcytosine (m5C) Enzyme này có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển phôi thai và biểu hiện mạnh mẽ trong giai đoạn này, trong khi biểu hiện của nó giảm trong quá trình chuyên biệt hóa tế bào soma.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 18

DNMT3b là một enzyme thuộc nhóm de novo methyltransferase, có khả năng hoạt động độc lập trong quá trình sao chép DNA Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc methyl hóa các vị trí cụ thể trên DNA, góp phần điều chỉnh hoạt động gen và duy trì tính ổn định của bộ gen.

Enzyme methyltranferase duy trì DNA, đặc biệt là DNMT1, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép DNA trong tế bào, giúp duy trì mức độ methyl hóa của các tế bào soma khác nhau DNMT1 có khả năng tương tác với DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, góp phần vào việc tái tạo di truyền Ngoài ra, enzyme DNMT1 còn hỗ trợ hoạt động của nhóm enzyme de novo transferase.

Trong quá trình sinh ung thư, sự tích lũy sai khác thông tin di truyền hay DNA dẫn đến sự biến đổi trong cơ chế di truyền học, đặc biệt là trong tình trạng điển hình của epigenetics Nghiên cứu gần đây cho thấy sự biến đổi trong epigenetics đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành các loại ung thư như ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi và ung thư đại trực tràng.

Hình 1.9 C ch bi n đ i epgenetics gơy im l ng gen [51]

Methyl hóa DNA trong ung th

Trong quá trình khởi sinh ung thư (tumorigenesis), một trong những nguyên nhân chính là hiện tượng methyl hóa DNA, dẫn đến sự im lặng của các gen ức chế khối u (tumor suppressor genes) Hiện tượng này có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học (biomarker) nhằm phát hiện, tiên lượng và chẩn đoán một số bệnh ung thư.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 19

Sự biến đổi methyl hóa DNA, bao gồm hypermethylation tại các vị trí CpG trong vùng promoter và hypomethylation trên bề mặt gene, có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh cấu trúc gen và kích thích hoạt động của các oncogene, từ đó góp phần vào sự phát triển của ung thư.

Hình 1.10 Mô hình methyl hóa DNA [54]

Methyl hóa DNA tại các vị trí được biết trên vùng gen, đặc biệt là các đảo CpG, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh biểu hiện gen và có liên quan đến sự phát triển của nhiều bệnh ung thư Nguyên nhân chính của hiện tượng methyl hóa DNA là do hoạt động của các enzyme DNMTs, bao gồm DNMT1 và DNMT3, với sự biểu hiện của nhóm enzyme này ở các tế bào bình thường có thể gây ra hiện tượng methyl hóa bất thường Hiện tượng này làm giảm quá trình phiên mã, dẫn đến giảm biểu hiện của một số gen quan trọng như p53, hMLH1, MGMT, WRN, cũng như các gen điều hòa chu kỳ tế bào và gen liên quan đến quá trình apoptosis.

Hiện tượng hypermethylation đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung, trong khi sự giảm methyl hóa (hypomethylation) diễn ra trên các vùng promoter của gen làm tăng cường quá trình tái cấu trúc gen, góp phần kích thích hoạt động của các gen tiền ung thư (proto-oncogen) Hiện tượng methyl hóa mạch thập giá tăng theo độ tuổi, trong đó độ tuổi càng cao thì tỷ lệ methyl hóa mạch thập các gen càng phổ biến.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 20

Methyl hóa m c th p (hypomethylation) lƠ nguyên nhơn d n đ u lƠm gi m bi u hi n gen c ch kh i u, thông qua m t s c ch g n k t nhóm protein MBD

Các miền gắn methyl (MBD) có khả năng cạnh tranh với các nhóm methyl (CH3-) trên các đoạn CpG, dẫn đến việc ức chế enzyme 5-methylcytosine glycosylase Điều này ảnh hưởng đến quá trình phiên mã gen bằng cách ngăn cản sự bám dính của các yếu tố phiên mã vào vùng promoter của gen, từ đó điều chỉnh hoạt động gene.

Methyl hóa DNA, đặc biệt là hiện tượng hypomethylation, là một chỉ báo di truyền quan trọng trong việc hình thành khối u, xảy ra tại các vùng trình tự gen như vùng trình tự lặp lại và vùng promoter nghèo dinucleotide CpG Hiện tượng này dẫn đến sự gia tăng kích thích xơ hóa NST và sự biểu hiện bất thường của gen, góp phần vào sự phát triển của ung thư.

Hình 1.11 Mô hình methyl hóa DNA các trình t l p l i [54]

T ng quan v gen p16 INK4

1.3.6.1 V trí vàtên g i gen p16 INK4  trên NST

Hình 1.12 nh v gen p16 INK4  trên NST s 9 thu cb gen ng i [79]

Lý Th Tuy t Ng c Trang 21

Gen p16 INK4  g mnhi u tên g inh CDKN2A (Cyclin - Depedent Kinase inhibitor

2A) y u t cyclin ph thu c kinase, MST1 (multiple tumor suppressors 1) lƠ m t ph c h p cch kh i u, th ng đ c g it t gen p16 [14][37] Gen p16 INK4  t i v trí s 21 c anhánhnh trên NST s 9 thu cb gen ng i [37][79]

1.3.6.2.Vai tròvà ch c n ng gen p16 INK4 

Gen p16 INK4α là một gen ức chế khối u quan trọng, tham gia vào các quá trình như im lặng tế bào, chuyên biệt hóa tế bào và lão hóa tế bào.

NgoƠi ra, gen p16 INK4  lƠ m t y u t clycin c ch ho t đ ng enzyme kinase (CKI - cyclin kinase inhibitor) quan tr ng ng n c n quá trình phiên mƣ trong chu k t bƠo [8][25]

Gen p16 INK4  lƠ m t trong nh ng gen c ch kh i u mƣ hóa các protein ng n c n s phát tri n c a t bƠo vƠ chuy n t pha G1 sang pha G 0 t m ng ng ho t đ ng chu k t bƠo [37]

Gen p16 INK4 α có vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào thông qua con đường pRb/E2F Trong giai đoạn G0 và đầu pha S, yếu tố pRb (sản phẩm của gen retinoblastoma) ở trạng thái không bị phosphoryl hóa, do đó không thể tách rời yếu tố phiên mã E2F, dẫn đến việc ngăn chặn quá trình tăng trưởng của tế bào Khi gen p16 INK4 α hoạt động, nó liên kết với CDK4/6 và cyclin D1, làm cho yếu tố pRb không bị phosphoryl hóa, từ đó ngăn chặn sự liên kết với yếu tố phiên mã.

Gen p16 INK4α đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu kỳ tế bào thông qua việc tương tác với các yếu tố như CDK7, một thành phần của nhóm TFIIH, hình thành phức hợp CTD/CDK7 Yếu tố CTD (carboxyl-terminal domain) cần thiết cho hoạt động của RNA polymerase II (Pol II) và nếu không được phosphoryl hóa, sẽ không thể hoạt động trong quá trình sao chép chu kỳ tế bào Ngoài ra, gen p16 INK4α cũng ức chế hoạt động của enzyme kinase JNK3 bằng cách gắn kết vào vùng glycine-rich loop của N-terminal domain của JNK3, dẫn đến việc C-Jun không bị phosphoryl hóa, từ đó điều hòa chu kỳ tế bào.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 22

Con đ ng d n đ n s đi u hòa b t th ng gen p16 INK4  các b nh ung th

P16 INK4α là một gen quan trọng liên quan đến sự điều hòa của tế bào, có vai trò trong việc ức chế quá trình sao chép tế bào Biểu hiện cao của p16 INK4α góp phần vào sự suy giảm khả năng nhân đôi của tế bào, dẫn đến sự lão hóa tế bào Quá trình lão hóa này có thể được kích thích bởi các yếu tố gây tổn thương DNA, đồng thời ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis.

1.3.7 Con đ ng d n đ n s đi u hòa b t th ng gen p16 INK4  các b nh ung th

1.3.7.1 S đi u hòa b t th ng trong ung th

Tiến trình hình thành ung thư (carcinogenesis) là một quá trình phức tạp, bao gồm việc kích hoạt các gen tiền ung thư (proto-oncogenes) và sự điều chỉnh của các gen ức chế khối u, liên quan đến sự phát triển của các tế bào khối u ác tính.

Gen p16 INK4α không có khả năng hoạt động do bị đột biến điểm hoặc đột biến mất đoạn Hiện tượng methyl hóa và các yếu tố khác có thể làm thay đổi cấu trúc gen, dẫn đến việc không còn khả năng chức năng sinh học.

1.3.7.2 C ch methyl hóa b t th ng gen p16 INK4  trong ung th

Methyl hóa các vị trí CpG trên vùng promoter của gen p16 INK4α có thể dẫn đến sự bất hoạt của gen này, với hypermethylation và hypomethylation ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào ung thư Sự methyl hóa này xảy ra do gắn kết của nhóm methyl vào các vị trí CpG, liên quan đến các protein gắn methyl (MBD) và ảnh hưởng đến các yếu tố phiên mã không hoạt động Các chất ức chế như TSA có thể làm thay đổi cấu trúc NST thông qua việc biến đổi histon (deacetylated), tạo thành phức hợp chứa HDAC, từ đó làm thay đổi môi trường trung tâm hoạt động của các yếu tố phiên mã và dẫn đến sự không hoạt động của chúng.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 23 d n đ n nhơn t polymerase không th tr t trên vùng nƠy vì v y quá trình phiên mƣ gen p16 INK4  im l ng (gene silencing) [36][13][62]

Hình 1.13 Quá trình phiên mƣ gen p16 INK4  [13]

Khi gen p16 INK4  im l ng không còn kh n ng g n k t y u t CDK4/6 nên y u t Cyclin D g n k t CDK4/6 hình thƠnh ph c h p giúp phosphoryl hóa Rb

Retinoblastoma liên quan đến protein pRB, có vai trò quan trọng trong việc ức chế hoạt động của yếu tố phiên mã E2F, giúp kiểm soát quá trình chuyển từ pha G1 sang pha S trong chu kỳ tế bào Sự tương tác giữa pRB và gen p53, một yếu tố biểu hiện, có thể dẫn đến những sai lệch trong hoạt động của chu kỳ tế bào, ảnh hưởng đến sự phát triển và hình thành khối u.

Hình 1.14 C ch hình thƠnh kh i u [72]

Lý Th Tuy t Ng c Trang 24

Gen p16 INK4α điều hòa chu kỳ tế bào thông qua cơ chế methyl hóa vùng promoter, dẫn đến sự tăng trưởng không kiểm soát của các tế bào khối u Nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự hypermethylation của các đảo CpG trong vùng exon 1 của gen p16 INK4α liên quan đến quá trình tăng trưởng tế bào và một số bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư đại trực tràng và ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC).

[19] Do đó, gen p16 INK4a h a h n lƠ m t d u ch ng sinh h c trong phát hi n, tiên l ng, ch n đoán vƠ theo dõi ti n tri n kh i u ti m n ng trên m t s b nh ung th

1.3.8 Các ph ngphápphát hi n s methyl hóa

Sodium bisulfite DNA bisulfite là phương pháp đầu tiên được sử dụng để phân tích sự methyl hóa của DNA Phản ứng xử lý với sodium bisulfite cho phép xác định các cystosine và cystosine methyl hóa (5mC) trong DNA Tác động của sodium bisulfite sẽ chuyển đổi các cystosine không methyl hóa thành uracil, trong khi các cystosine methyl hóa vẫn giữ nguyên trạng thái ban đầu.

Hình 1.15 X lý sodium bisulfite vƠ s chuy n đ i cytosine thƠnh uracil [1]

1.3.8.2 Ph ngpháp Methylation - Specific PCR (MSP)

Ph ng pháp MSP do Herman vƠ c ng s phát minh vƠo n m 1λλ6, đ c s d ng đ phơn tích nhanh tình tr ng methyl hóa c a các đ o CpG MSP th c ch t lƠ m t k

Lý Th Tuy t Ng c Trang 25 cho thấy rằng trên PCR, có thể phát hiện đến 0,1% các alen b methyl hóa trong vùng CpG gần kề, điều này quan trọng cho việc đánh giá mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG cụ thể.

Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) là kỹ thuật tiên tiến dùng để phân tích khuôn DNA đã được biến đổi bằng sodium bisulfite, cho phép phân biệt giữa hai trạng thái methyl hóa và không methyl hóa Kỹ thuật này cung cấp thông tin chi tiết về sự khác biệt giữa các alen methyl hóa và không methyl hóa, cũng như giữa DNA đã được xử lý bằng sodium bisulfite và DNA chưa qua xử lý Để đạt được các mục tiêu này, các trình tự mẫu trong MSP thường được thiết kế chứa nhiều cytosine và có các cặp CpG nằm gần vị trí 3’ của các mẫu.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 26

V T LI U VÀ PH NG PHỄP NGHIểN C U

V t li u

Nghiên c u s d ng 10 m u mô vú đúc trong paraffin đ c thu nh n t b nh vi n

H Y D c Tp.HCM vƠ l u gi t i phòng Thí Nghi m Sinh H c Phơn T , Khoa Công ngh Sinh H c, H M TP.HCM Các m u nƠy đ c b o qu n nhi t đ -20 oC đ n khi s d ng.

Ph ng pháp

Khai thác d li u in silico

A comprehensive review of data from PubMed, PubMed Central, and Google Scholar highlights the significant role of epigenetics, particularly focusing on the gene p16 INK4α and DNA methylation, in various cancers Key findings indicate that hypermethylation of the p16 INK4α gene is associated with lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, and cervical cancer This underscores the importance of understanding DNA methylation patterns in cancer research and potential therapeutic interventions.

Bài viết này trình bày những thông tin đáng tin cậy từ các báo cáo trên tạp chí uy tín về nghiên cứu methyl hóa gen p16 INK4α Các số liệu thống kê được tổng hợp từ các nghiên cứu thực nghiệm, cung cấp cái nhìn sâu sắc về mức độ methyl hóa và phương pháp thực nghiệm liên quan.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá mức độ methyl hóa gen p16 INK4α trên các bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư thực quản qua các giai đoạn khác nhau Mục tiêu của nghiên cứu là thực hiện đánh giá và phân tích tần suất methyl hóa để hiểu rõ hơn về vai trò của gen này trong tiến triển của bệnh.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 27 hóa gen p16 INK4  nh m kh ng đ nh gen p16 INK4  lƠ d u ch ng sinh h c (Bio - marker) cho các b nh ung th

Phương pháp thống kê dữ liệu giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thống kê, trong đó có việc tính toán giá trị trung bình Nghiên cứu trình tự vùng promoter của gen p16 INK4α và xác định cấu trúc gen cùng với các vùng CpG là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về chức năng và vai trò của gen này trong các quá trình sinh học.

Tiến hành thu thập trình tự vùng promoter của gen p16 INK4α từ NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) với mã truy cập DQ406745 Sau khi thu thập thông tin, xác định vị trí một số vùng quan trọng trong cấu trúc gen như promoter, 5’UTR, exon 1, và vị trí gần các yếu tố phiên mã trên vùng promoter Các chương trình phần mềm được sử dụng như TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) để xác định các yếu tố phiên mã, và phần mềm Methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) để xác định vị trí các đảo CpG.

Khảo sát và phân tích trình tự gen P16 INK4a để xác định các nhân tố phiên mã quan trọng như SP1, GATA2, ADR1, và AML từ các đảo CpG bằng chương trình TF Search.

Trong nghiên c u nƠy, ti n hƠnh thu th p trình t m i các bƠi báo tin c y, ki m tra kh n ng thi t k m i cho ph n ng MSP b ng ch ng trình Annhyb, ch ng trình

Phân tích OligoAnalyzer là công cụ quan trọng để đánh giá các thông số như Tm (nhiệt độ nóng chảy), L (chiều dài), tỷ lệ phần trăm GC, khả năng tạo cấu trúc thứ cấp, và các cấu trúc như self dimer, hairpin loop và hetero dimer Công cụ này cũng hỗ trợ trong việc xác định khả năng bắt cặp với trình tự đích, giúp phát hiện và đánh giá mức độ methyl hóa DNA tại các đảo CpG trong vùng promoter của gen p16 INK4α.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 28

Ghi chúμ MF (methyl forward)μ m i xuôi, MR (methyl reverse)μ m i ng c.

V trí CG đ c in đ m vƠ g ch d i.

Ph ngpháptách chi t phenol/chloroform

Nguyên tắc tách chiết DNA sử dụng phương pháp phenol/chloroform là một quy trình hiệu quả Trong đó, màng tế bào và màng nhân được phá vỡ để giải phóng DNA Sau đó, protein sẽ được tách biệt bằng phenol/chloroform và loại bỏ Cuối cùng, DNA được thu nhận bằng cách kết tủa với ethanol.

Máy ly tơm l nh Hettich

B ng 2.3 Các b c tách chi t phenol/chloroform

Lý Th Tuy t Ng c Trang 29

1 C t nh m u mô trong parafin cho vƠo ng eppendorf lo i 1,5 ml

Thêm 1 ml xylene, vortex 1 phút, ly tơm 13000 vòng trong 2 phút L p l i 3 - 5 l n, đ t nhi t đ phòng trong vòng 10 phút.

Thêm 1 ml Ethanol 100%, vortex 2 phút, ly tơm 13000 vòng trong 2 phút.

Thêm 1 ml Ethanol 70%, vortex 2 phút, ly tơm 13000 vòng trong

Thêm 1ml Ethanol 50%, vortex 2 phút, ly tơm 13000 vòng trong

2 phút, s y khô kho ng 30 phút.

Thờm 700 àl dung d ch lysis buffer (mụ t B ng 2.4), tr n đ u các thƠnh ph n trong eppendorf b ng cách l c nh

Thờm 8 àl proteinase K (18,5 mg/ml), tr n đ u Sau đú, 56 oC kho ng 3 ngƠy.

8 a eppendorf v nhi t đ phũng, thờm 700 àl phenolμ chloroform (t l 1 μ 1), l c đ u nh nhƠng Ly tơm nhi t đ phòng 13000 vòng/phút trong 3 phút Thu d ch n i, l p l i 2 - 3 l n.

Thêm cùng th tích chloroform, l c đ u, ly tơm 13000 vòng/phút trong 1,5 phút, thu d ch n i.

Thêm 0.2 l n th tích NH4OAc 5 M vƠ 2.5 l n th tích Ethanol

100%, đ o đ u, l nh 4 o C trong 30 - 60 phút Ly tơm 13000 vòng trong 10 phút 4 o C, thu t a.

R a l i b ng Ethanol 70%, ly tơm 13000 vòng trong 10 phút 4 oC B d ch, đ khô t nhiên.

B ng 2.4 ThƠnh ph n dung d ch lysis buffer

Lý Th Tuy t Ng c Trang 30

ThƠnh ph n N ng đ Th tích ( l)

H 2 O - 637 ánhgiá DNA tách chi t b ng Ph ngphápđo quang ph

Nguyên tắc xác định nồng độ DNA dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị OD260 (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch, với A260 = 1 OD tương ứng với 50 µg/ml DNA Tính chất của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280, trong đó nồng độ DNA thu nhận được tinh khiết khi giá trị này dao động từ 1,4 đến 2,0.

Máy đo quang ph Bio Rad

Các b c ti n hƠnhμ DNA sau khi tách chi t đ c pha loƣng 6 l n b ng n c c t vô trùng Sau đóchuy n t t c dung d ch vƠo cuvette vƠ đo n ng đ DNA b c sóng

260 nm tinh s ch c a dung d ch đ c xác đ nh b ng OD260/OD 280

Ph ng pháp bi n đ i bisulfite DNA s d ng b kit EZ DNA METHYLATION - GOLD TM

Nguyên t cμ Bi n đ i DNA b ng sodium bisulfite b ng EZ DNA METHYLATION

Bộ kit GOLD TM cho phép xử lý DNA sau khi đã xé lẻ bằng sodium bisulfite, biến đổi các cytosine thành uracil trong 5mC Quá trình này được xác định trên mảnh của các đoạn DNA Sau các bước rửa sạch, DNA được tách ra bằng dung dịch rửa M - Elution buffer (EZ7).

Lý Th Tuy t Ng c Trang 31

Máy ly tơm l nh Hettich

ThƠnh ph n b EZ DNA METHYLATION - GOLD TM kit (hƣng Zymo Research) bao g m CT conversion reagent (EZ1), M - Dilution buffer (EZ2), M - Dissolving buffer (EZ3), M - Bindiing buffer (EZ4), M - Wash buffer (EZ5), M -

Desulphonation buffer (EZ6), M - elution buffer (EZ7)

Các b c ti n hƠnh bao g mμ ch n b Ctconversion reagent (EZ1), M - Wash buffer (EZ5), th c hi n ph ng pháp bi n đ i bisulfite c a b kit EZ DNA METHYLATION - GOLD TM

B ng 2.5 Các b c ch nb Ct conversion reagent (EZ1)

B c 1 Thêm λ00 l vƠo 300 l M - Dissolving buffer (EZ2) vƠ 50 l M -

B c 2 H n h p đ c vortex trong 10 phút, nhi t đ phòng L u Ủ tránh ánh sáng, b o qu n l nh vƠ lƠm m tr c khi s d ng.

Ch nb M - Wash buffer (EZ5)

B c 1 Thêm 24 ml ethanol 100% vƠo 6ml M - Wash buffer (EZ5)

Các b c bi n đ i bisulfite c a EZ DNA METHYLATION - GOLD TM kit

Thêm 130 l CT conversion reagent (EZ1) đƣ ch n b vƠ 20 l

(C 0 ậ 500 ng) vƠo tube PCR Tr n đ u m u vƠ ti n hƠnh xơy d ng chu trình nhi t (đ c th hi n Hình 2.3)

B c 2 Thêm 600 l M - Bindiing buffer (EZ4) vƠo c t Zymo - spin TM IC

B c 3 Cho m u đƣ ch y chu trình nhi t vƠo c t Zymo - spin TM IC (C1),

Lý Th Tuy t Ng c Trang 32 đ y n p vƠ đ o nh Ly tơm 13000 vòng/30 giơy/nhi t đ phòng vƠ lo i b d ch.

B c 4 Th m 100 l M - Wash buffer (EZ5) đƣ đ c ch n b vƠo c t C1

Ly tơm 13000 vòng/30 giơy/nhi t đ phòng vƠ lo i b d ch.

B c 5 Thêm 200 l M - Desulphonation buffer (EZ6) vƠo c t C1 Ly tơm

13000 vòng/30 giơy/nhi t đ phòng vƠ lo i b d ch.

B c 6 Thêm 200 l M - Wash buffer (EZ5) vƠo c t C1 Ly tơm 13000 vòng/30 giơy/nhi t đ phòng vƠ lo i b d ch L p l i hai l n.

Thay c t C1 b ng eppendorf 1,5 ml, sau đó thêm 10 l M - elution buffer (EZ7) Ly tơm 13000 vòng/30 giơy/nhi t đ phòng vƠ lo i b d ch.

Hình 2.1 Chu trình nhi t bi n đ i bisulfite c a EZ DNA METHYLATION -

Ph ngpháp MSP trên m u b nh ph m

Nguyên tắc của phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) là phát hiện sự methyl hóa của DNA Cụ thể, phương pháp này sử dụng phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn DNA đã qua xử lý bằng sodium bisulfite, biến tất cả các cytosine không methyl hóa thành uracil Phương pháp MSP sẽ tiến hành hai phản ứng PCR riêng biệt cho hai loại mẫu: methyl hóa và không methyl hóa Sản phẩm thu được sau khi PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 33

Máy ly tơm l nh Hettich

Ph n ng PCR đ c ti n hƠnh trong th tích 15 l v i m i p16 INK4  , thƠnh ph n vƠ chu k nhi t c a ph n ng PCR đ c mô t theoB ng 2.6, Hình 2.2 hayHình 2.3

B ng 2.6 ThƠnh ph n ph n ng PCR

Master mix (2X) 7,5 p16 INK4  F primer (10 M) 0,5 p16 INK4  R primer (10M) 0,5

Hình 2.2 Chu k gradient nhi t cho ph n ng PCR

Lý Th Tuy t Ng c Trang 34

Hình 2.3 Chu k nhi t cho ph n ng PCR nhi t đ lai 59 o C

Ph ngphápđi n di trên gel agarose

Các acid nucleic là các đại phân tử quan trọng, trong đó DNA di chuyển trong môi trường gel agarose Sự di chuyển này phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử DNA Các acid nucleic trong gel agarose được ghi lại dưới ánh sáng UV nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn vào giữa các baz của acid nucleic và phát quang khi bị kích thích bởi tia UV (300 nm) Kích thước của các acid nucleic được xác định bằng cách so sánh với kích thước chuẩn trên thang chuẩn.

Bu ng đi n di Bio Rad

Ph ng pháp ti n hƠnhμ Hút kho ng 6 - 10 l s n ph m PCR đ c pha v i dung d ch loading dyer vƠ ch y đi n di v i gel agarose 1,0% hi u đi n th 80 V trong

Các m u sau khi đ c gi itrình s đ c ti n hƠnh hi u ch nh tr c khi đ a vƠo các b c phơn tích sau T t c các trình t đ u đ c c t b ph n nhi u hai đ u b ng ch ng trình Chromas Lite 1

Lý Th Tuy t Ng c Trang 35

Mục tiêu của việc khai thác dữ liệu từ các báo cáo được công bố trên toàn cầu là tổng quan về nghiên cứu khảo sát tình trạng methyl hóa của gen p16 INK4α, một gen ức chế khối u, ở các bệnh nhân ung thư Nghiên cứu này được thực hiện thông qua việc thu thập và phân tích dữ liệu từ các nguồn tài liệu đáng tin cậy như PubMed và PubMed Central.

Nghiên cứu thu thập dữ liệu từ 24 báo cáo khảo sát về mức độ methyl hóa trên vùng promoter của gen p16 INK4α trên một số loại ung thư, bao gồm ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi và ung thư đại trực tràng, với mốc thời gian tính đến tháng 12 năm 2013.

Khai thác d li u trên m t s lo i ung th

Methyl hóa gen p16 INK4α đã được phát hiện trong nhiều loại bệnh ung thư thông qua nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau Sự khác biệt này là nguyên nhân chính dẫn đến sự biến động về mức độ methyl hóa giữa các công trình nghiên cứu Việc phát triển quy trình thực nghiệm nhằm khảo sát các phương pháp methyl hóa đã được thực hiện để đánh giá mức độ phổ biến của các phương pháp này trong các báo cáo nghiên cứu.

Theo nghiên cứu từ 24 báo cáo, có 2,653 mẫu được đánh giá về mức độ methyl hóa gen p16 INK4α theo một số bệnh ung thư, sử dụng phương pháp phân tích mẫu bệnh Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 36

B ng 3.2 Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4  trên m t s b nh ung th

Lý Th Tuy t Ng c Trang 37

Ghi chú: UTPμ ung thư phổi, UTVμ ung thư vú, UTCTCμ ung thư cổ tử cung, UTDTTμ ung thư đại trực tràng, TBUTμ Tổn thương bạch huyết ung thư, TBBTμ Tổn thương bình thường, TLTKμ Tài liệu tham khảo, UTμ ung thư.

Trong nghiên cứu về methyl hóa, đã có 62 loại mẫu bệnh được phân tích bằng 27 phương pháp khác nhau, với 24 bài báo thu thập được Phương pháp MSP được sử dụng phổ biến nhất trong việc phân tích mức độ methyl hóa của gen p16 INK4a, chiếm tỷ lệ 74,1% Ngoài ra, RT-PCR cũng được áp dụng trong một số nghiên cứu Dù có nhiều kỹ thuật được phát triển, MSP vẫn được ưa chuộng nhờ tính đơn giản, độ nhạy cao và khả năng phát hiện nhanh chóng mức độ methyl hóa tại các vùng gen liên quan.

B ng 3.3 Ph ng phápđ c s d ng trong 24 công trình nghiên c u

Lý Th Tuy t Ng c Trang 38

Ghi chú: UTPμ ung th ph i, UTVμ ung th vú, UTCTCμ ung th c t cung, UTDTTμ ung th đ i tr c trƠng, PPμ ph ng pháp, TLTKμ tƠi li u tham kh o.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng mẫu mô đúc paraffin có tỷ lệ sử dụng cao lên tới 54,8% và 12,λ% trong 24 nghiên cứu phân tích Mẫu này cho thấy khả năng hút mô và khối lượng vượt trội so với các loại mẫu khác Đặc biệt, việc sử dụng mô đúc paraffin giúp xác định chính xác tình trạng methyl hóa của tế bào ung thư, với tỷ lệ tế bào ung thư cao hơn so với các phương pháp thông thường Đồng thời, các bio-marker cũng được áp dụng để dự đoán và theo dõi sự tiến triển của các loại mô khác Trong trường hợp này, việc thu thập mẫu từ các vị trí như núm vú, ngực, và các bộ phận khác được thực hiện để đảm bảo tính chính xác trong chẩn đoán bệnh Tuy nhiên, việc thu thập mẫu này gặp khó khăn do đặc điểm sinh lý của bệnh nhân Việt Nam, dẫn đến các quyết định điều trị cần phải được cân nhắc kỹ lưỡng.

B ng 3.4 Lo i m u b nh ph m đ c s d ng trong 24 công trình nghiên c u

Mô đúc parafin D ch Khác

Lý Th Tuy t Ng c Trang 39

Ghi chú: UTPμ ung th ph i, UTVμ ung th vú, UTCTCμ ung th c t cung, UTDTTμ ung th đ i tr c trƠng, PPμ ph ng pháp, TLTKμ tƠi li u tham kh o

Tỷ lệ methyl hóa các tế bào ung thư có sự chênh lệch đáng kể giữa các loại bệnh phẩm, với tỷ lệ methyl cao nhất đạt 87,5% và tỷ lệ methyl hóa thấp nhất chỉ 1,8%, như trình bày trong Bảng 3.1 Để đánh giá tiềm năng ứng dụng sinh học trong việc phát hiện sớm bệnh, cần có tiêu chí và số liệu cụ thể Do đó, tính chất tỷ lệ methyl hóa trung bình có thể giúp phân biệt các loại bệnh phẩm khác nhau trong các công trình nghiên cứu.

(đ c trình bƠy B ng 3.4 vƠ Hình 3.1)

B ng 3.5 B ngtrung bình t n s có tr ng s trên m t s b nh ung th

Hình 3.1 T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a các gen p16 INK4  trong các m u ung th ph i, vú, c t cung vƠ đ i tr c trƠng

Chú thích: t bƠo vú ung th (TBVUT), t bƠo vú bình th ng (TBBT), t bƠo t cung ung th (TBTCUT), t bƠo t cung bình th ng (TBTCBT), t bƠo ph i ung

Lý thuyết về methyl hóa trong các nghiên cứu cho thấy sự ảnh hưởng của methyl hóa đến các biến đổi trong môi trường Các phương pháp như TBBT, TBDTTUT và TBDTTBT được áp dụng để phân tích sự thay đổi này Kích thích methyl hóa đóng vai trò quan trọng trong việc hiểu rõ các quá trình sinh học và hóa học Nghiên cứu cho thấy rằng mức độ methyl hóa trung bình có sự liên quan mật thiết đến các kết quả nghiên cứu trong lĩnh vực này.

Methyl hóa gen p16 INK4 α có liên quan đến sự phát triển của các tế bào ung thư, với tỷ lệ cao nhất trong tổng số loại ung thư là 83,02% ở tế bào ung thư đại trực tràng (TBDTTUT), tiếp theo là 68,28% ở tế bào ung thư cổ tử cung (TBUTCTC), 52,58% ở tế bào ung thư vú (TBVUT) và 3,6% ở tế bào ung thư phổi (TBPUT).

Nh n th y, m i lo i b nh ung th khác nhau có s khác bi t rõ rƠng v t n s methyl hóa trên gen p16 INK4  các t bƠo ung th

Methyl hóa gen p16 INK4 α trong các tế bào bình thường được quan sát thấy ở một số bệnh ung thư, bao gồm ung thư phổi, vú, cổ tử cung và đại trực tràng, với tỷ lệ methyl hóa lần lượt là 8,7%, 7,06%, 3,40% và 1,07% Không có sự khác biệt đáng kể nào được ghi nhận ở các tế bào bình thường.

Vì v y, m c đ methyl hóa gen p16 INK4  các lo i m u ung th khác nhau có s khác bi t nh t đ nh v t n s methyl hóa cho t ng lo i ung th

Methyl hóa gen p16 INK4 α có liên quan chặt chẽ đến sự phát triển của các loại ung thư, với tỷ lệ methyl hóa khá cao (trên 50%) trong nhiều loại ung thư Điều này cho thấy việc xác định mức độ methyl hóa của gen p16 INK4 α có thể là một chỉ số sinh học quan trọng để dự đoán sự xuất hiện của một số loại bệnh ung thư.

T n s methyl hóa có tr ng s c a gen p16 INK4  trên b n lo i ung th m c khá cao, ph ng pháp MSP, lo i m u mô t i vƠ mô đúc paraffin đ c s d ng ph bi ntrong 24 công trìnhnghiên c u.

Khai thác d li u trên ung th vú vƠ ung th c t cung

Theo s li u th ng kê trong B ng 3.7, có 6 nghiên c u v ung th vú vƠ 6 nghiên c u ung th c t cung phơn tích tình tr ng methyl hóa c a gen p16 INK4  v i t ng s

Lý Th Tuy t Ng c Trang 41 m u l n l t lƠ 40λ vƠ 830 m u, c ng nh s l ng m u c th cho t ng giai đo n c a hai lo i b nh ung th

Các giai đoạn của ung thư vú và ung thư cổ tử cung đã được phân loại trong các nghiên cứu khảo sát, với thống kê tổng hợp phản ánh tình hình methyl hóa theo giai đoạn của gen p16 INK4a Đối với các nghiên cứu không phân rõ giai đoạn, số liệu thống kê tổng hợp thể hiện tần suất methyl hóa trong ung thư vú nói chung.

Theo nghiên cứu, tần suất methyl hóa các tế bào ung thư và tế bào bình thường có sự khác biệt rõ rệt Cụ thể, tần suất methyl hóa tế bào ung thư vú đạt 86,7%, trong khi đó tần suất methyl hóa ở các tế bào vú bình thường chỉ là 5,6% Sự khác biệt này cho thấy mối liên hệ giữa methyl hóa và sự phát triển của ung thư vú.

Khi phơn tích lo i m u s d ng trong nghiên c u ung th vú đ c th hi n b ng

3.5 Nh n th y, m u mô t i đ c s d ng v i t l cao nh t 68,2% M u huy t thanh vƠ các lo i m u khác c ng đ c s d ng các phơn tích nƠy ung th c t cung (B ng 3.7), nh n th y m u mô t i vƠ mô đúc paraffin đ c s d ng v i t l cao l n l t lƠ 32,3%, 21,λ% NgoƠi ra, các bƠi báo nghiên c u nƠy s d ng ph n nh m u huy t t ng vƠ d ch ph t t cung.

Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng mô hình bì chính xác có thể giúp xác định tình trạng methyl hóa của tế bào ung thư, với tỷ lệ ung thư rất cao so với tế bào bình thường Bio-marker đóng vai trò quan trọng trong việc tiên đoán và theo dõi sự tiến triển của bệnh, không chỉ ở ung thư vú mà còn ở các loại ung thư khác Các dữ liệu cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ methyl hóa giữa các nghiên cứu, với tỷ lệ methyl hóa cao nhất ở gen p16 INK4α đạt 86,7% và thấp nhất là 5,6% Sự chênh lệch này cho thấy tầm quan trọng của methyl hóa trong việc đánh giá tình trạng ung thư.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 42 bình th ng đánh giá ti m n ng lƠm d u ch ng sinh h c trong phát hi n s m b nh c n ph i có tiêu ch n và s li u c th Tình hình methyl hóa trung bình có tr ng s đáng lưu ý, với sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiên cứu (B ng 3.7, B ng 3.8) Mô t t n s methyl có tr ng s của các nghiên cứu ung thư vú được thể hiện qua Hình 3.2 và Hình 3.3.

B ng 3.6 Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4  trên b nh ung th vú

T n s methyl hóa qua các giai đo n ung th

Ghi chú các thuật ngữ liên quan đến nghiên cứu ung thư: MSP (Methylation specific PCR), HMMD (hóa mô miễn dịch), UTP (ung thư phổi), UTV (ung thư vú), UTCTC (ung thư cổ tử cung), UTDTT (ung thư đại trực tràng), HT (huyết thanh), PP (phương pháp), TLTK (tài liệu tham khảo).

Lý Th Tuy t Ng c Trang 43

B ng 3.7 Khái quát tình hình methyl hóa gen p16 INK4  trên b nh ung th c t cung

T n s methyl hóa qua các giai đo n ung th

Ghi chú: MSP là viết tắt của PCR đặc hiệu cho methyl hóa; HMMDμ chỉ việc hóa mô mi n d ch; UTP là ung thư phổi; UTVμ là ung thư vú; UTCTCμ là ung thư cổ tử cung; UTDTTμ là ung thư đại trực tràng; PP là phương pháp; TLTK là tài liệu tham khảo; TBUT là tế bào ung thư; TBBT là tế bào bình thường; GD0 là giai đoạn 0; GDI là giai đoạn I; GDII là giai đoạn II.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 44

B ng 3.8 B ng trung bình t n s có tr ng s các TBUT, TBBT vƠ giai đo n b nhtrên b nh ung th vú

B ng 3.9 B ng trung bình t n s có tr ng s các TBUT, TBBT vƠ giai đo n b nhtrên b nh ung th c t cung

Ghi chú:TBUTμ t bƠo ung th , TBBTμ t bƠo bình th ng, GD0μ giai đo n 0, GDIμ giai đo n I, GDIIμ giai đo n II, GDIIIμ giai đo n III, GDIVμ giai đo n IV

T n s methyl hóa trung bình có tr ng s (%)

Ung th theo giai đo n GD0 GDI GDII 52,58 7,06 9,00 71,20 53,95

T n s methyl hóa trung bình có tr ng s (%)

Ung th theo giai đo nGD0 GDI GDII GDIII GDIV 68,28 3,40 0,00 69,93 18,84 20,05 56,13

Lý Th Tuy t Ng c Trang 45

Hình 3.2 T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a gen p16 INK4  trong ung th vú vƠ phơn chia theo các giai đo n b nh

Hình 3.3 T n s methyl hóa trung bình có tr ng s c a gen p16 INK4  trong ung th c t cung vƠ phơn chia theo các giai đo n b nh

Chú thích về các loại tế bào ung thư bao gồm tế bào ung thư biểu mô (TBUT), tế bào bình thường (TBBT), ung thư giai đoạn 0 (UTGD0), giai đoạn I (UTGDI), giai đoạn II (UTGDII), giai đoạn III (UTGDIII) và giai đoạn IV (UTGDIV) Tế bào ung thư có sự methyl hóa đáng kể, được thể hiện qua các báo cáo liên quan Kích thước tế bào ung thư cũng ảnh hưởng đến lượng mẫu trong các nghiên cứu Đặc biệt, tỷ lệ methyl hóa trung bình được ghi nhận trong tất cả các nghiên cứu.

Khảo sát tần suất methyl hóa của gen p16 INK4α có ý nghĩa trong ung thư vú cho thấy tỉ lệ methyl hóa trong tế bào ung thư (TBUT) đạt 52,58%, cao hơn đáng kể so với tế bào bình thường (TBBT) chỉ đạt 7,06% Trong các giai đoạn ung thư vú, tỉ lệ methyl hóa ở các giai đoạn 0, I, II lần lượt là 0%, 71,20% và 53,5% Điều này cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tần suất methyl hóa giữa các giai đoạn phát triển của ung thư vú.

I (các tuy n hay thùy xu t hi n kh i u ch a có hi n t ng xơm l n) có t n s methyl hóa cao nh t vƠ giai đo n 0 (giai đo n ti n ung th ) lƠ th p nh t.

Methyl hóa có vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của gen p16 INK4α, liên quan đến ung thư thực quản Tỷ lệ tế bào ung thư (TBUT) có tần suất methyl hóa trong bình có trữ lượng (TSTBTS) đạt 68,28%, cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với tế bào bình thường (TBBT) chỉ đạt 3,42%.

Trong các giai đo n ung th vú, các t bƠo ung th thu c ch y u giai đo n 0, I, II, III, IV có t n s methyl hóa các giai đo n ung th l n l t lƠ 0,00%, 69,93%,

KH O SỄT IN SILICO

Xác đ nh c u trúc gen, v trí gen p16 INK4

Hình 3.4 nh v gen p16 INK4  trên NST s 9

Gen p16 INK4α, hay còn gọi là CDKN2A, nằm trên vùng 9p21 thuộc NST số 9, có kích thước từ 21.677.52 đến 21.444.1 Gen này mã hóa cho hai loại protein là p16 INK4a và p14ARF, với trọng lượng phân tử lần lượt là 16kDa và 15kDa Gen p16 INK4a có kích thước 42kb, bao gồm ba exon (1, 2 và 3), đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào Nghiên cứu hiện tại sử dụng mã truy cập NCBI là NC 000009.

Kh o sát v trí vƠ c u trúc đ o CpG thu c vùng promoter gen p16 INK4

Ti n hƠnh thu th p trình t vùng promoter thu c gen CDKN2A (p16 INK4  ) b ng ch ng trìnhNCBI theo mƣ DQ406745

Vùng promoter của gen p16 INK4 đã được thu thập từ cơ sở dữ liệu Genbank với mã số truy cập DQ406745 Các đảo CpG trong vùng này đã được xác định chính xác thông qua chương trình Methprimer, và kết quả được trình bày trong Hình 3.5.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 47

Hình 3.5 S đ hình nh các vùng đ o CpG trên trình t gen kh o sát

Kết quả khảo sát cho thấy bốn đảo CpG được đoán với chiều dài các đoạn ngắn lần lượt là 26bp (CpG1), 130bp (CpG2), 142bp (CpG3) và 257bp (CpG4) Trong nghiên cứu này, nhận diện được một vùng đảo CpG4 với chiều dài 257bp, nằm ở vị trí nucleotide từ 188 đến 2145 Dựa trên kết quả khảo sát từ GenBank, nhận thấy sự phân bố các vùng của trình tự này như sau: vùng promoter được xác định từ nucleotide 1 đến 1787, và vùng exon 1 bắt đầu từ nucleotide 2000 Kết quả phân bố vùng được thể hiện trong Hình 3.5, cho thấy vùng đảo CpG4 bao gồm một phần promoter, vùng 5’UTR và một phần vùng exon 1.

Hình 3.6 V trí các vùng promoter, 5’UTR vƠ exon 1trên trình t kh o sát

Ghi chúμ vùng promoter lƠ đo n mƠu xanh lá, mƠu h ng lƠ exon 1

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng nhiều công trình nghiên cứu khác nhau đã được thực hiện, trong đó nổi bật là các tác phẩm của các tác giả như Hibi K và Yang L Những nghiên cứu này đã góp phần quan trọng vào việc hiểu rõ hơn về các vấn đề liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu Hu X.C.

[74][72] đ u t p trung trong vi c thi t k m i khu ch vùng gen n m thu c đ o CpG đ

Lý Th Tuy t Ng c Trang 48 đã tiến hành đánh giá tình trạng methyl hóa tại vị trí CG trong vùng CpG4 Nghiên cứu này tập trung vào quá trình methyl hóa và không methyl hóa, nhằm cung cấp cái nhìn sâu sắc về các nghiên cứu trước đó trong lĩnh vực này.

NgoƠi ra, b ng ch ng trình TFSEARCH xác đ nh các v trí nhơn t phiên mƣ ch ng h n nh Sp1, CREB, GATA2, AML - 1aầ đ c nh n di n đ c s d ng ch đ ng ng (threshold) l n h n 85

Hình 3.7 Trình t gen p16 INK4 vƠ s phơn b các v trí phiên mƣ trên trình t

Ghi chú: vùng mƠu tímμ 5’UTR, vùng mƠu đ Exon 1, các vùng mƠu xanhμ v trí các CpG, trình t g ch d i lƠ m i.

Trên trình tự khảo sát, kết quả cho thấy có 4 vùng đảo CpG trên vùng promoter thuộc gen p16 INK4A, xác định đặc trưng trình tự nhận biết của một số nhân tố phiên mã như ADR1, Sp1, GATA-2, AML, Các vị trí CpG trong trình tự mới với sản phẩm MSP tạo ra giữa hai mối học các motif nucleotide, kèm theo các vị trí CpG đầu là các vị trí "nóng" (hot spot), chúng chính là các trình tự học mối học mà phần các trình tự nhận biết các nhân tố điều hòa phiên mã quan trọng Những vị trí nóng này dễ dàng bị biến đổi hay methyl hóa dẫn đến gen không được phiên mã, không có khả năng biểu hiện chức năng gen cần thiết.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 49

Methyl hóa các đ o CpG trong vùng promoter của gen p16 INK4  gây ức chế biểu hiện của gen này, một gen ức chế khối u, liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư như ung thư đại tràng, phổi, và vú Nghiên cứu cho thấy vùng exon 1 không bị methyl hóa ở các tế bào bình thường, trong khi quá trình methyl hóa diễn ra tại vùng 5’ của đ o CpG đã được phát hiện ở một số bệnh ung thư Tham khảo công trình nghiên cứu của Vinci A D vào năm 2002 để biết thêm chi tiết về vấn đề này.

M i xuôi (MF) và m i ng c (MR) được xác định tại vùng CpG4 bởi phân tích manhyb trong khoảng từ 1λ20 đến 1λ43, với m i xuôi và m i ng c l ở tại vùng 204λ đến 206λ Vùng gen này có kích thước 257 bp và vùng CpG4 được biểu hiện nhiều điểm CG nhất trong 4 vùng (xem Hình 3.6).

Vùng đảo CpG4 được xác định là vùng khuyết đại trong vùng promoter của gen p16 INK4α, có khả năng phát hiện và tiên lượng một số bệnh ung thư Sau khi nhận định kết quả, mô tả vị trí nhân của phiên mã mới trên đảo CpG thuộc gen p16 INK4α đã được trình bày trong Hình 3.7.

ánh giá m i

3.2.3.1.Kh o sáttính ch t v t lý c a m i b ng ch ngtrình IDT

Mỗi DNA polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp mạch mới từ đầu 3’ OH, điều này giúp cho quá trình tổng hợp DNA diễn ra chính xác Để đảm bảo tính chính xác trong quá trình sao chép, cần có hai vùng trình tự được xác định, nơi mà hai đầu của đoạn gen cần được khuếch đại Bên cạnh đó, cũng cần phải đảm bảo rằng quá trình sao chép diễn ra theo chiều từ mạch gốc, không bị ảnh hưởng bởi các trình tự DNA khác có thể gây ra sai sót.

Thành phần nucleotide A, T, G, C trong trình tự của mạch DNA rất quan trọng cho việc xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) và nhiệt độ bắt cặp (Ta) giữa mạch DNA và DNA đích Sự khác biệt giữa methyl và unmethyl trong quá trình PCR thông thường là do methyl được thiết kế cho phản ứng MSP chứa nhiều cystosine tự do, ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng của phản ứng.

Lý thuyết cho rằng quá trình methyl hóa cystosine thành thymine diễn ra nhờ sự chuyển đổi của nhóm methyl Mỗi methyl hóa liên quan đến việc chuyển cystosine thành thymine, trong khi uracil cũng có thể chuyển thành thymine Ngoài ra, cytosine không methyl hóa sẽ không bị biến đổi, và nếu không có methyl, toàn bộ cystosine sẽ được chuyển thành thymine.

3.2.3.2 Ti n hành ki m tra đ đ c hi u c a các c p m i

Ki m tra b ng ch ngtrình IDT

(https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/), đánh giá các thông s v t lỦ quan tr ng c a các c p m i thu th p nh chi u dƠi (L - lenght), thƠnh ph n

GC (%GC), Tm (nhi t đ nóng ch y), kh n ng hình thƠnh c u trúc k p tóc (hairpin dimer), m i t bát c p (hetero dimer) nh sauμ

Thông s % GC c a các m i không th t s t i uμ ví d m i methyl MR có 66.7% GC

Chi u dƠi m i (L - lenght) lƠ m t y u t quan tr ng trong ph n ng PCR, thông th ng dao đ ng t 18 bp - 25 bp Chi u dƠi m i đ t yêu c u (kho ng 21bp - 24bp)

Nhi t đ nóng ch y (T melt)μ lƠ nhi t đ c a m i khi ch a b t c p v i DNA khuônkhi m i ch a b t c pv i DNA, th ng nhi t đ nóng ch y kho ng 55 -

V các ch s G, sau khi đánh giá thông s m i nh n th y đa s các m i có thông s nƠy l n h n ơm λ kcal/mol.

Cấu trúc của mồi bao gồm hairpin loop, homodimer và heterodimer, trong đó hairpin loop là cấu trúc gập lại của vùng xoắn kép trên DNA hoặc RNA Homodimer là sự kết hợp của các oligonucleotide giống nhau, trong khi heterodimer là sự kết hợp của các oligonucleotide khác nhau Nếu cấu trúc này được tối ưu hóa, hiệu quả của phản ứng PCR sẽ được cải thiện, góp phần vào việc kiểm soát sự kết hợp của các mồi trong quá trình tổng hợp DNA đích.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 51 xác định động lực học của các liên kết trên, người ta dùng một khái niệm là giá trị biến đổi năng lượng tự do G (kcal/mole) Theo hướng IDT, giá trị G lớn hơn 0 kcal/mole thì sẽ không ảnh hưởng đến phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi khuếch đại Vì vậy, kết quả đánh giá mới được sử dụng trong nghiên cứu này là tiêu chí.

Thông qua nghiên cứu, chúng tôi đánh giá rằng thông số chiều dài của mạch RNA phù hợp với phân ng MSP, đã phát hiện sự methyl hóa bất thường tại các vị trí CpG trên vùng promoter của gen p16 INK4α Sử dụng chương trình trực tuyến IDT để khảo sát thông số này, chúng tôi đã thu được kết quả thực hiện như mong đợi.

B ng 3.10 K t qu kh o sát các đ c tính v t lý c a m i

C u trúc homo dimer G (kcal/mol e)

C u trúc hetero dimer G (kcal/mol e)

Ghi chú: T m : nhi t đ nóng ch y, bpμ base pair, v trí CG đ c in đ m vƠ g ch d i.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 52

Ki m tra đ đ c hi u c a các c p m i thông qua ch ngtrình Annhyb

Hình 3.8 V trí trình t m i methyl trên vùng trình t promoter thu c gen p16 INK4 

Ghi chúμ vùng mƠu đ lƠ trình t m i xuôi, vùng mƠu xanh lƠ trình t m i ng c.

Mỗi methyl gen p16 INK4α có kích thước 151bp, tương đồng với kích thước gen trong các nghiên cứu của Nakayama G và Lee J (2012) Hình 3.8 minh họa vị trí methyl hóa trên vùng promoter của gen p16 INK4α, với các điểm methyl hóa nằm trong khoảng từ 120 đến 143 và từ 204 đến 206 Các điểm methyl hóa này có giá trị lần lượt là 71,25 và 63,3, cho thấy sự biến đổi methyl hóa tại các vị trí quan trọng trong quá trình điều chỉnh biểu hiện gen.

K t lu n: Trình t c p m i methyl b t c p b sung t ng đ i đ c hi u v i trình t DNA đ c thu th p mƣ accession DQ406745 Vì v y, c p m i methyl đ c ch p nh n đ khuy ch đ i vùng trình t gen p16 INK4 

K T QU TH C NGHI M

K t qu tách chi t DNA

Các m u DNA sau khi tách chi t b ng ph ng pháp phenol/chloroform đ c ti n hƠnh đo OD Giá tr OD c a 10 m uung th vú đ c th hi n quaB ng 3.10.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 53

B ng 3.11 B ng n ng đ vƠ ch t l ng DNA tách chi t

Ghi chú: HSPLμ h s pha loƣng

Nh n xét: Giá tr t s OD A 260 /A 280 c a c 10 m u còn nh h n 1,8 - 2,0, đi u nƠy ch ng t r ng khi tách chi t v n còn l n protein

Tuy nhiên, m u DNA tách chi t nƠy v n đ c s d ng bi n đ i bisufite đ kh o sát c p m i c a gen p16 INK4 

K t qu ph n ng MSP trên các m u mô đúc paraffin

Sau khi tách chiết DNA bằng sodium bisulfite, nghiên cứu đã thực hiện phân ngữ MSP để xác định mức độ methyl hóa của các mẫu DNA bệnh phẩm Kết quả cho thấy methyl hóa được ghi nhận cho gen p16 INK4α trên 10 mẫu bệnh phẩm ung thư vú.

B c đ u, ti n hƠnh đ t ph n ng gradient nhi t đ cho c p m i methyl c a gen p16 INK4  trên m t m u b t k , k t qu nƠy đ c mô t Hình 3.9 Nh n th y, l a ch n m u nƠy có nhi t đ b t c p khá t t

Lý Th Tuy t Ng c Trang 54

Hình 3.9 K t qu ph n ng gradient nhi t đ trong kho ng 51 o C - 62 o C

Ghi chúμ t ph n ng MSP trên m u s 7, nhi t đ lai đ c cƠi đ t các gi ng t trái sang ph i l n l t lƠ 51 o C, 51,8 o C, 53,1 o C, 55 o C, 57,5 o C, 59,8 o C, 61,2 o C,

Ti p t c ti n hƠnh đ t ph n ng MSP nhi t đ b t c p (Ta) đ c ch n lƠ 5λ o C trên 10 m u b nh ph m, k t qu đ c mô t Hình 3.10

Hình 3.10 K t qu đi n di s n ph m MSP

T k t qu trên hình đi n di s n ph m PCR, ti n hƠnh ghi nh n k t qu ph ng pháp MSP trên 10 m u b nh ph m B ng 3.11.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 55

B ng 3.12 B ng k t qu s b ph ng pháp MSP

Ghi chú: (-)μ m u đ i ch ng ơm, +μ xu t hi n v ch, -μ không có v ch

Theo kết quả điển hình, nhóm này không có xuất hiện vết khuếch tán, tuy nhiên các mẫu đầu có hiện tượng vết sáng không rõ ràng, nguyên nhân là do DNA bị đứt gãy trong quá trình bảo quản DNA Mẫu 1, 4, 6, 7, 10 có xuất hiện vết sáng có kích thước trong khoảng 100 bp - 200 bp, phù hợp với kích thước dự đoán 151 bp, vì vậy nhóm mẫu trên dương tính với methyl Mẫu 2, 3, 5, 8, λ không xuất hiện vết, mẫu DNA của nhóm này âm tính với methyl hay DNA được biến đổi sodium bisulfite đã bảo quản thời gian khá lâu dẫn đến âm tính vết không xuất hiện Ngoài ra, trên gel có xuất hiện vết có kích thước dưới 100 bp, các vết này có thể là do cấu trúc dimer của mẫu, tuy nhiên không làm ảnh hưởng đến việc đọc kết quả điển hình của phản ứng MSP.

T ng k t k t qu th c nghi m MSP th c hi n trên 10 m u ghi nh nμ 40% (4/10) m u b methyl hóa.

Gi i trình t s n ph m MSP

Kiểm tra độ methyl hóa của các sản phẩm MSP được thực hiện bằng phương pháp giải trình tự, cho thấy sản phẩm MSP của gen p16 INK4α hoàn toàn được methyl hóa Kết quả trình bày trong Hình 3.11, thể hiện kết quả giải trình tự gen p16 INK4α sử dụng mồi xuôi methyl.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 56

Hình 3.11.K t qu gi i trình t s n ph m MSP

Vùng trình tự p16 INK4α chứa các cytosine không được methyl hóa, được đánh dấu bằng màu xanh, trong khi các cytosine methyl hóa được đánh dấu bằng màu vàng Trình tự này cho thấy sự phân bố của các nhóm methyl trong vùng gen, với Vùng 1 chứa các cytosine methyl hóa, Vùng 2 có 4 cytosine methyl hóa trong vùng lân cận, và Vùng 3 có 2 cytosine methyl hóa trong khu vực gần đó.

Phân tích kết quả giải trình tự của methyl hóa gen p16 INK4α cho thấy vùng cuối của trình tự này xuất hiện chính xác từng nucleotide của mạch ngược có methyl hóa Cụ thể, có 4 vị trí CpG trên mạch ngược được methyl hóa.

Vùng trình tự nằm giữa các vị trí CpG trong vùng gen gần kề cho thấy kết quả methyl hóa rõ ràng, với 6 vị trí CpG được xác định Điều này cho thấy vùng DNA cách 151 bp có mức độ methyl hóa cao hơn Các tín hiệu huỳnh quang xuất hiện rõ ràng, mạnh mẽ, và có đặc điểm duy nhất.

Quá trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite đã thành công, cho phép chúng tôi xác định kết quả giới trình Các nucleotide cytosine không nằm cạnh nucleotide guanine sẽ chuyển thành uracil, tạo thành cặp dinucleotide CpG.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 57

Mô t đ c đi m m u b nh ph m ung th vú theo ch tiêu lơm sƠng vƠ c n lơm sƠng

Theo b ng th ng kê B ng 3.13, Ph l c 4, nh n th y trong 10 m u đ c ti n hƠnh th c nghi m MSP đ c phơn lo i theo ba nhómμ nhóm tu i, giai đo n vƠ lo i m u b nh

Theo nhóm tu i s m u b nh d ng tính v i m i methyl nhóm N1 (nh h n tu i

40), N2 ( tu i t 40 đ n tu i 50), N3 (l n h n tu i 50) l n l t lƠ 3, 2, 1 Nh n th y trong các nhóm tu i, các m u b methyl hóa cao nh t lƠ nhóm N1 (< 40) chi m

Theo giai đo n s m u b nh giai đo n I, II, III, IV các m u ung th vú l n l t lƠ 2,

2, 0, 0 Nh n th y, m u ung th vú b methyl hóa ch y u trong giai đo n I vƠ II lƠ 2 trên t ng s 10 m u.

M u b nh bao g mμ m u lƠnh tính vƠ m u ung th D a vƠo B ng 3.13, nh n th y m u b methyl hóa m u ung th cao h n m u mô vú lƠnh tính.

B ng 3.13 B ng mô t đ c đi m m u b nh ph m ung th vú

Methyl Khôngb methyl Nhóm tu i

Lý Th Tuy t Ng c Trang 58

Ghi chú: m u mô vú c a các b nh nhơn tu i nh h n 40, t 40 - 50 vƠ cao h n tu i 50 l n l t lƠ N1, N2, N3 M u môvú trong giai đo n I, II, III vƠ IV.

Xác đ nh m i t ng quan gi a s methyl hóa gen p16 INK4  vƠ b nh ung th

Kết quả ghi nhận trên mẫu bệnh ung thư vú mô lành tính đã xác lập thống kê, nhằm tính toán mối tương quan giữa mức độ methyl hóa tại vùng promoter gen p16 INK4α với bệnh ung thư vú.

M t cách t ng quát, tính toán đ u tiên v i hai phơn nhómμ nhóm m u b nh (ung th ) vƠ nhóm m u lƠnh (v i ung th nh ng m c b nh khác v vú).

Nhóm mụ bệnh lơ sinh thiệt mô độc thu nhận từ bệnh viện H Y D tại TP HCM Một số tiêu chí đánh giá tính chất của bệnh (ung thư vú) dựa trên đích điểm bệnh học bao gồm giai đoạn bệnh từ giai đoạn I đến giai đoạn IV.

Nhóm m u lƠnh (v i ung th ) nh ng m c các b nh lỦ khác v vú (kèm theo ch đ nh ph u thu t l y sinh thi t mô vú c a các bác s

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của gen p16 INK4α có liên quan đến bệnh ung thư vú Các kết quả được trình bày trong Bảng 3.14 và Bảng phụ lục 1, cho thấy tầm quan trọng của quá trình methyl hóa trong sự phát triển của bệnh này.

B ng 3.14 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i ung th vú

Nghiên cứu này phân tích mối liên hệ giữa các chỉ tiêu như tuổi và lối sống với sự methyl hóa, nhằm xác định mối tương quan giữa chúng với ung thư vú Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể với giá trị p = 0,6726, cho thấy tính chất methyl hóa không có ảnh hưởng rõ rệt đến nguy cơ ung thư vú trong nhóm đối tượng được nghiên cứu.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 59

B ng 3.15 M i t ng quan gi a t l methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i các y u t lơm sƠng trên b nh nhơn ung th vú

Methyl p16 INK4  Không methyl p16 INK4 

Giá tr p* 0,2330 p* > 0,05,  Th ng kê b ng ph n m m Medcal(B , 2014)

Ghi chú mô vú của các bệnh nhân tuổi nhàn h n 40, từ 40 - 50 và cao hơn tuổi 50 được phân loại thành các nhóm N1, N2, N3 Mô vú trong giai đoạn I, II, III, IV được nghiên cứu kỹ lưỡng Các yếu tố ảnh hưởng đến nhóm tuổi của các bệnh nhân cũng được xem xét trong nghiên cứu này.

N1 (có độ tuổi < 40) chiếm tỷ lệ phần trăm cao nhất trong các nhóm tuổi không dưới 50,0%, điều này cho thấy mối nguy cơ ung thư vú trong giai đoạn tiền mãn kinh Phân tích thống kê cho thấy yếu tố nhóm tuổi và mức độ methyl hóa gen p16 INK4α không có sự khác biệt có ý nghĩa với giá trị p-value bằng 0,5241, cao hơn 0,05 Đối với yếu tố giai đoạn ung thư, dữ liệu được trình bày trong bảng 3.14, bảng phụ lục 2 cho thấy trong các giai đoạn ung thư vú, mức độ methyl hóa có sự khác biệt trong giai đoạn.

I, II có ph n tr m cao nh t chi m kho ng > 50,0% hay nói cách khác methyl hóa đ c bi u hi n s m trong quá trình sinh u vƠ quá trình b nh hóa c a ung th vú Tuy nhiên, giá tr p - value đ t 0,2330 cao h n 0,05 nên th ng kê không có Ủ ngh a.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 60

3.3.5 Kh o sát m c đ liên quan (t su t chênh - Odd ratio - OR vƠ nguy c t ngđ i - relative risk - RR) gi a tính ch t methyl hóa v i ung th

T su t chênh (Odd ratio) vƠ y u t nguy c t ng đ i (ralative Risk) dùng đ đánh giá hay đo l ng m c đ m nh y u c a m i liên quan m c đ methyl hóa v i lo i m u ung th vú (m u lƠnh vƠ m u ung th ).

Kết quả thống kê cho thấy, tỉ số chênh (OR = 2,6667) và yếu tố nguy cơ (RR = 2,0000) có giá trị p-value lần lượt là 0,4968 và 0,5087, với p > 0,05 cho thấy không có sự khác biệt ý nghĩa trong thống kê Nguyên nhân có thể là do mẫu nghiên cứu còn hạn chế, nếu tỉ lệ mẫu ung thư vú có khả năng thể hiện sự tương quan với mức độ methyl hóa ở các loại mẫu (mẫu lành và mẫu ung thư).

B ng 3.16 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i ung th vú

T s nguy c (RR) 2,0000 0,5087 p* > 0,05,  Th ng kê b ng ph n m m Medcal (B, 2014)

Lý Th Tuy t Ng c Trang 61

Thu th p thông tin, xác đ nh v trí vƠ mô t c u trúc vùng promoter, các đ o CpG vƠ exon 1 thu c gen p16 INK4a

Theo các nghiên cứu đã công bố trên toàn cầu, tỷ lệ methyl hóa gen p16 INK4α trong các loại ung thư như ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi và ung thư đại trực tràng lần lượt là 52,5%, 68,28%, 34,6% và 83,02% từ tổng số 24 công trình nghiên cứu.

Khảo sát đánh giá tình trạng methyl hóa gen p16 INK4α trên 10 mẫu mô vú được đúc paraffin tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ methyl hóa ở các tế bào ung thư là 57,14% và 33,33% Kết quả xác định mức độ methyl hóa tại vùng promoter của gen p16 INK4α liên quan đến các yếu tố lâm sàng trên bệnh nhân ung thư vú, trong đó tỷ lệ methyl hóa ở giai đoạn I và II đều đạt 50% Tỷ số Odds Ratio (OR) đạt 2,6667 và tỷ số Relative Risk (RR) là 2,0000.

NGH

Kh o sát th c nghi m gen p16 INK4  trên nhi u b nh ung th , t ng c ng c m u kh o sát tình tr ng methyl hóa m u ung th Vi t Nam.

Tiếp cận nghiên cứu tính chất methyl hóa kết hợp với các ghi chú về mô học giúp đánh giá khả năng sử dụng tính chất methyl hóa như một dấu ấn sinh học cho bệnh ung thư vú tại Việt Nam.

Lý Th Tuy t Ng c Trang 62

[1] Lê Th Trúc Linh, H B o Khuyên, Lê Huy n Ễi Thúy (2010), Xơy d ng quy trình Methylation specific PCR nh m kh o sát m c đ methyl hóa t i các đ o CpG thu c vùng promoter hai gen Trail - R3,

Trail - R4 trên các b nh nhơn b ung th c t cung, T p chí Công ngh sinh h c, 8(3B), tr 1091 ậ 1096

[3] Baker D.J (2008), Opposing roles for p16 INK4  and p19 Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency, Nat Cell Biol, 10(7), pp 825 - 836

[4] Bean G.R (2007), Morphologically normal - appearing mammary epithelial cells obtained from high - risk women exhibit methylation silencing of INK4a/ARF, Clin Cancer Res, 13(22), pp 6834 - 6841

[5] Bearzatto A (2002), Hypermethylation p16 INK4  detected by Fluorescent Methylation - Specific PCR in plasmas from non - small cell lung cancer, Clin Cancer Res, 3782 (8), pp 3782 - 3787

[6] Carestiato F N (2013), An upward trend in DNA p16 INK4  methylation pattern and high risk HPV infection according to the severity of the cervicial lesion, Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 55(5), pp 329 - 334

[7] Choi B Y (2005), The tumor suppressor p16 INK4  prevents cell transformation through inhibition of c - Jun phosphorylation and AP -

1 activity, Nature Structural and Molecular Biology Cell Biol., 12, pp

Lý Th Tuy t Ng c Trang 63

[8] Coleman K.G (1997), Identification of CDK4 sequences involved in cyclin D1 and p16 binding, J Biol Chem, 272(30), pp 18869 -

[9] Cutts F.T (2007), Humanpapillo virus and HPV vaccines: a review, Bulletin of the World Health Organization

[10] Das P.M (2004), DNA methylation and cancer, Journal of Clinical Oncology, 22(22), pp 4632 - 4642

[11] Deep J S (2012), Aberrant methylation in promoters of GSTP1, p16, p14 and RASSF1A genes in smokers of North India, International Scholarly Research Network ISRN Pulmonology, ID 247631, pp 1 - 6

[12] Delpu Y (2013), DNA methylation and cancer diagnosis, Int J Molecular Sciences, 14(7), pp 15029 - 15058

[13] Herman J.G (1996), Methylation - specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Medical Sciences, 93, pp

[14] Hibi K (2001), Mitochondrial DNA alteration in esophageal cancer, International Journal of Cancer, 92(3), pp 319 - 321

[15] Lee J.J (2012), Tumor suppressor gene in primary breast cancer tissue and their quantitative p16 INK4  hypermethylation in plasma by Real - Time PCR, The Korean Journal of Pathology, 46, pp 554 - 561

[16] Hu X.C (2003), Tumor - derived aberrant methylation in plasma of invasive ductal breast cancer patients: clinical implications, Oncol Rep., 10(6),pp 1811 - 1815

[17] Jha A K (2012), p16 INK4  and p15 INK4  gene promoter methylation in cervical cancer patients, Oncology Letters, 3, pp 1331 - 1335

[18] Janzen V (2006), Stem - cell ageing modified by the cyclin - dependent kinase inhibitor p16 INK4  , Nature, 443, pp 421 - 426

[19] Jarmalaite S (2003), Aberrant p16 promoter methylation in smokers and former smokers with nonsmall cell lung cancer,

Lý Th Tuy t Ng c Trang 64

Iternational Journal of Cancer,106(6), pp 913 - 918

[20] Jemal A (2011), Global cancer statistics, CA Cancer J Clin, 61(2), pp 69 - 90

[21] Jennifer B (2009), Promoter methylation and the detection of breast cancer, Cancer causes control, 20(9), pp 1539 - 1550

[22] Jie G (2007), Relationship between expression and methylation status of p16 INK4  and the proliferative activity odifferent areas' tumour cells in human colorectal cancer, Int J Clin Pract, 61(9), pp 1523 -

[23] Jing F (2007), Hypermethylation of tumor suppressor genes BRCA1,p16 and 14 - 3 - 3sigma in serum of sporadic breast cancer patients, Onkologie, 30(1 - 2), pp 14 - 19

[24] Kamb A (1994), A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types, Science, 264(5157), pp 436 - 440

[25] Kim N.B (2005), Methylation and expression of p16 INK4  tumor suppressor gene in primary colorectal cancer tissues, Internationa Journal of Oncology, 2, pp 1217 - 1226

[26] Jane B.R (2011), The cell cycle, Campell biology, Chapter 12

[27] Kim W.Y (2006), The regulation of INK4/ARF in cancer and aging, Cell, 127(2), pp 265 - 275

[28] Kim, Y.T and M Zhao (2005), Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinoma, Yonsei Medical, 46(5), pp 597 - 613

[29] Krishnamurthy J (2004), INK4/ Arf expression is a Bio - marker of aging, J Clin Invest, 114, pp 1299 - 1307

[30] Laird, P.W (2003), The power and the promise of DNA methylation markers, Nature Publishing Group, 3

[31] Latest world cancer statistics Global cancer burden rises to 14.1 million new cases in 2012: Marked increase in breast cancers must be addressed, (2013), International Agency for Research on Cancer

Lý Th Tuy t Ng c Trang 65

[32] Le T.T.L., Ho T.B.P., Ton N.T.K., Doan T.P.T, Le H.A.T (2011), Appraisal of potential methylation Bio - markers: BRCA1, p16 INK4  , cyclin D2, GSTP1, RASSF1A in breast cancer early detection, Journal of Science and Technology, 49(1A), pp 329 - 337

[33] Li J (2002), Novel insights into the INK4 - CDK4/6 - Rb pathway: counter action of gankyrin against INK4 proteins regulates the CDK4 - mediated phosphorylation of Rb, Biochemistry, 41, pp 3977 - 3983

[34] Li J (2011), The Regulatory Mechanisms of Tumor Suppressor p16 INK4  and Relevance to Cancer, Biochemistry, 25(50), pp 5566 -

[35] Liggett W.H (1998), Role of the p16 Tumor Suppressor Gene in Cancer, Jounnal of Clinical Oncology, (16)3, pp 1197 - 1206

[36] Lo P K (2008), Epigenomics and breast cancer, Pharmacogenomics, (9)12, pp 1879 - 1902

[37] LoF - Ohlin Z.M (2011), Hypermethylation of promoter regions of the APC1A and p16 INK4  genes in relation to prognosis and tumor characteristics in cervical cancer, International Journal of Oncology,

[38] Lu Q (2012), DNA methylation changes in cervicial cancer, Cancer Epignetics Method in Molecular Biology, 863, pp 155 - 176

[39] Malhotra P (2010), Aberrant promoter methylation of p16 in colorectal adenocarcinoma in North Indian patients, World J Gastrointest Oncol, 2(7), pp 295 - 303

[40] Man J.H (2010), Gankyrin plays an essential role in Ras - induced tumorigenesis through regulation of the RhoA/ROCK pathway in mammalian cells, J Clin Invest, 120, pp 2829 - 2841

[41] Marcus W K (2013), Epigenetic changes in patients with multiple sclerosis, Nature Reviews Neurology ,9, pp 35 - 43

[42] Manel E (2007), Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA

Lý Th Tuy t Ng c Trang 66 hypermethylome, Human Molecular Genetics, 16(1), pp 50 - 59

[43] Matouk Charles C (2008), Epigenetic Regulation of Vascular Endothelial Gene Expression, Circulation Research, 102(8), pp 873 -

[44] Mohammed A (2009), Status of p16 INK4  and E - Cadheringene promoter methylation in Moroccan patients with cervical carcinoma, Oncology Research, 18, pp 1 - 100

[45] Molofsky AV (2006), Increasing p16 INK4  expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during aging, Nature, 443(7110), pp 448 - 452

[46] Nakayama G (2007), p16 Methylation in Serum as a potential marker for the malignancy of colorectal carcinoma, Anticancer Reasearch, 27 (5A), pp 3367 - 3370

[47] Nephew K.P (2002), Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression, Cancer Letters, 190(2), pp 125 - 133

[48] Nguyen H.L (2010), Cost of treatment for breast cancer in central Vietnam, Glob Health Action, 6: 18872

[49] Ono A (2011), Epigenetic aberrant hypermethylation of DNA in endometrial cancer: application as a Bio - marker, Journal of Cancer Therapy, 2, pp 610 - 615.

[50] Lamy A (2002), Aberant methylation of the CDKN2A/p16 gene promoter regionon prevasive bronchial leison: aprospectives study in high - SK patients without invasive cancer, Int J Cancer, 100(2), pp

[51] Ota N (2006), Prognostic significance of hypermethylation p16 INK4  in non - small cell lung cancer is evident by quantitative DNA methylation analysis, Anticancer Research, 26, pp 3729 - 3732

[52] Peter B., World cancer Report 2008 [online], WHO press, The International Agency for Research Cancer (IARC)

Lý Th Tuy t Ng c Trang 67

[53] Portela A (2010), Epigenetic modifications and human disease, Nature biotechnology, 28(10), pp 1057 - 1067

[54] Russo A.A (1998), Structural basis for inhibition of the cyclin - dependent kinase Cdk6 by the tumour suppressor p16 INK4  , J Nature, 395(6699), pp 237 - 243

[55] Serizawa H (1998), Cyclin - dependent kinase inhibitor p16 INK4  inhibits phosphorylation of RNA polymerase II by general transcription factor TFIIH, J Biol Chem, 273(10), pp 5427 - 5430

[56] Sharma G (2007), Promoter hypermethylation of p16 INK4  , p14ARF, CyclinD2 and Slit2 in serum and tumor DNA from breast cancer patients, Life Sci, 80(20), pp 1873 - 1881

[57] Sharma S (2010), Epigenetics in cancer, Carcinogenesis, 31(1), pp

[58] Sherr CJ (1999), CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1 - phase progression, Genes Dev., 13(12), pp 1501 - 1512

[59] Shima K (2011), Prognostic significance of CDKN2A (p16) promoter methylation and loss of expression in 902 colorectal cancers: cohort study and literature review, Int J Cance, 128(5), pp 1080 -

[60] Shin E A (2009), p16 INK4  methylation and the correlation to immunohistochemical expression in cervical neoplasia, Journal of

[61] Smith J.R (1996), Replicative senescence: implications for in vivo aging and tumor suppression, Science, 273(5271), pp 63 - 67

[62] Spathis A (2011), Promoter Methylation of p16 INK4  , hMLH1, And MGMT In Liquid - Based cervical cytology samples compared with clinicopathological findings and HPV presence, Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology, ID 927861, pp 1 - 5

Lý Th Tuy t Ng c Trang 68

[63] Szalmas A (2009), Epigenetic alterations in cervical carcinogenesis, Semin Cancer Biol, 19(3), pp 144 - 52

[64] Szyf M., (2008), The role of DNA hypermethylation and demethylation in cancer and cancer therapy, Current Oncology, 15(2), pp 72 - 75

[65] Tsao H (1998), Novel mutations in the p16/CDKN2A binding region of the cyclin - dependent kinase - 4 gene, Cancer Res, 58(1), pp

[66] Vallian S (2009), Methylation status of p16 INK4  tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 135(8), pp 991 - 996

[67] Veganzones - de - Castro S (2012), p16 gene methylation in colorectal cancer patients with long - term follow - up, Reveso Ennferm Dig, 104(3), pp: 111 - 117

[68] Vinci D A (2005), p16 INK4  promoter methylation and protein expression in breast fibroadenoma, International Journal of Cancer,

[69] Voyatzi S (2010), Promoter methylation of p16 INK4  , RASSF1A, and RAR2 genes in tumor DNA from patients with breast cancer (BC) in correlation with clinical recurrence, Journal finical Oncology, 28(15), 1551

[70] Walkley C.R (2006), Rb is dispensable for self - renewal and multilineage differentiation of adult hematopoietic stem cells, Proc Natl Acad Sci U S A, 103(24), pp 9057 - 9062

[71] Yang H.J (2004), Detection of hypermethylated genes in tumor and plasma of cervical cancer patients, Gynecologic Oncology, 93, pp 435

[72] Yang L (2006), Aberrant promoter methylation of p16 and MGMT genes in lung tumors from smoking and never - smoking lung cancer

Lý Th Tuy t Ng c Trang 69 patients, Neoplasia, 8(1), pp 46 - 51

[73] Yoruker E.E (2012), Promoter and histone methylation and p16 gene expression in colon cancer, Experimental and therapeutic medicine ,4(5), pp 865 - 870

[74] Zhao Y F (2010), Methylation and expression of gene p16 INK4  and

RB in breast carcinoma, NCBI, 39(6), pp 377 - 381

[75] Frederique M (2001), Selective association of the methyl - CpG binding protein MBD2 with the silent p14/p16 locus in human neoplasia , 98(9), pp 4990 - 4995

[76] Yakov C (2005), Melanoma genetics and the development of rational therapeutics, The Journal of Clinical Investigation, 115: pp

[77] Zou H (2002), Detection of aberrant p16 methylation in the serum of colorectal cancer patients, Clinical Cancer Research, 36(7), pp 188

[78] http://globocan.iarc.fr/Pages/Map.aspx, Globocan 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012

[79] http://screening.iarc.fr/atlasclassifwho.php?lang=1,WHO histological classification of tumours of the uterine cervix, Classification uterine cervicix.

[80] http://www.who.int/cancer/en/, Definition cancer

[81] http://ungthu.net.vn/tinh - hinh - mac - benh - ung - thu - tren - gioi

- va - o - viet - nam, (MED - ADI)

[82] http://www.benhvienthuduc.vn/detail?id4, Ths.Bs.Nguy n Thu

H ng, ch n đoán xác đ nh ung th vú BMR (Bach Mai Radiology).

[83] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/Patient/pa ge5, Treatment Option Overview, Treatment Breast cancer

Lý Th Tuy t Ng c Trang 70

[84] http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/detection/probability

- breast - cancer, Detection breast cancer

[85] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/Patient/pa ge2, Stages of Breast Cancer, National Cancer Institute, Stage of breast cancer

[86] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/breast/healthpro fessional/page, Treatment breast cancer

[87] http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/cervical/Patient/ page2, Stage cervicial cancer

[88] http://ghr.nlm.nih.gov/gene/CDKN2A, Where is the CDKN2A gene located?

[89] http://www.hgu.mrc.ac.uk/people/r.meehan_researchb.html,

Epigenetic Mechanisms in Development and Disease

[90] http://kadinalani.com/rahim - agzi - kanseri - serviks/, Cervicial cancer

[91] http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguide/cervical

- cancer - treating - general - information, Treatment cervicial cancer

[92] http://www.dieutri.vn/daicuongungthu/14 - 3 - 2013/S3597/Dai - cuong - chan - doan - benh - ung - thu.htm, đ i c ng ch n đoán b nh ung th

B ng ph c l c 1 M c đ liên quan gi a tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i ung th vú

K t lu nung th Ểm D ng

B ng ph l c 2 M c đ liên quan tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i nhóm tu i/ đ tu i c a các b nh nhơn ung th vú

B ng ph l c 3 M c đ liên quan tính ch t methyl hóa t i vùng promoter gen p16 INK4  v i giai đo n b nh các b nh nhơn ung th vú

B ng ph l c 4 Thông tin b nh nhơn đ c s d ng trong nghiên c u: 10 m u ung th vú

M u H tên b nh nhơn Tu i Lo i m u