Mục tiêu nghiên cứu luận án là phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam; Xác định mối tương quan giữa mức độ methyl hóa promoter GSTP1 với các đặc điểm mô bệnh học, từ đó hoàn thiện kỹ thuật phát hiện sự methyl hóa làm tiền đề để phát triển bộ sinh phẩm sử dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đoán UTTTL.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA Ở GEN GSTP1 LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƢ TIỀN LIỆT TUYẾN Ở BỆNH NHÂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 Cơng trình hồn thành : Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Võ Thị Thương Lan Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam; - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Di truyền ngoại gen thông tin di truyền qui định cách thức methyl hóa DNA biến đổi histone Thay đổi mức độ methyl hóa DNA tham gia kiểm sốt tiêu cực, kìm hãm hoạt động gen Do mức độ DNA bị methyl hóa trở thành dấu chuẩn phân tử đầy tiềm chẩn đoán, tiên lượng điều trị ung thư Ung thư tuyến tiền liệt ung thư phổ biến, có tỷ lệ tử vong cao nam giới Methyl hóa DNA tăng cao số gen UTTTL, đó, gen nghiên cứu nhiều GSTP1 (πclass glutathione S-transferase gene) mã cho enzym tham gia khử độc tố gây ung thư Ở Việt Nam, nghiên cứu methyl hóa DNA triển khai Nghiên cứu phát triển hệ dấu chuẩn di truyền ngoại gen hỗ trợ chẩn đoán sớm, tiên lượng điều trị đích xác nhiệm vụ bất khả kháng sinh y học đại Với lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tượng methyl hóa gen GSTP1 liên quan ung thư tuyến tiền liệt bệnh nhân Việt Nam” với mục đích: - Phân tích mức độ methyl hóa promoter GSTP1ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt/phì đại tuyến người Việt Nam, - Xác định mối tương quan mức độ methyl hóa promoter GSTP1 với đặc điểm mơ bệnh học, từ hồn thiện kỹ thuật phát methyl hóa làm tiền đề để phát triển sinh phẩm sử dụng dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 để hỗ trợ chẩn đốn UTTTL Đóng góp ý nghĩa thực tiễn luận án: Lần xây dựng tối ưu điều kiện phản ứng MS-PCR để phát promoter GSTP1 bị methyl hóa bệnh nhân UTTTL PĐT người Việt Nam; Tỷ lệ methyl hóa promoter GSTP1 bệnh nhân UT/PĐT người Việt Nam chiếm 66,1 % 10,8 % Sự sai khác có ý nghĩa methyl hóa promoter GSTP1 với UT/PĐT; methyl hóa promoter GSTP1 với phân độ Gleason; Bước đầu hồn thiện tiêu chuẩn sở sinh phẩm phát methyl hóa promoter GSTP1; kết hợp MS-PCR với lai điểm để tăng độ nhạy đảm bảo độ xác phát sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa Giới thiệu luận án: Luận án gồm 109 trang (3 chương): Đặt vấn đề trang, chương (tổng quan) 28 trang, chương (vật liệu, phương pháp) 18 trang, chương (kết thảo luận) 38 trang, kết luận- kiến nghị trang Luận án có 39 hình, 13 bảng, 148 tài liệu tham khảo (3 tiếng việt, 136 tiếng anh, trang web) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Ung thƣ 1.1.1 Thực trạng ung thƣ Theo WHO, ước tính đến năm 2030 khả mắc UT năm khoảng 27 triệu người, 17 triệu người chết UT Việt Nam có khoảng 110000 người mắc UT khoảng 82000 người tử vong UT năm, chiếm tới 73,5 % tổng số bệnh nhân UT 1.1.2 Cơ sở tế bào học ung thư Sáu đặc điểm tế bào UT: trì tín hiệu tăng sinh, trốn tránh yếu tố ức chế khối u, chống lại apotosis, nhân lên bất tử, cảm ứng tăng sinh mạch máu, xâm lấn di 1.1.3 Di truyền học ung thư Các gen liên quan đến hình thành tế bào ác tính phát triển khối u phân thành hai nhóm gen ức chế khối u gen gây ung thư 1.2 Di truyền ngoại gen ung thƣ 1.2.1 Biến đổi histone ung thư Trong dạng biến đổi, acetyl hóa methyl hóa phổ biến liên quan tới ung thư 1.2.2 Methyl hóa DNA bất thường ung thư Methyl hóa DNA tượng gắn thêm gốc methyl vào nucleotide phân tử DNA Methyl hóa DNA mức UT xảy trình tự lặp lại, yếu tố vận động Alu hay LINE1, vùng DNA vệ tinh α gần tâm động Methyl hóa mức vùng promoter gây bất hoạt gen ức chế khối u mức độ methyl hóa gen loại ut khác 1.3 Methyl hóa DNA UTTTL 1.3.1 Phân độ ung thư tuyến tiền liệt Hệ thống phân loại Gleason xem tiêu chuẩn vàng cho phân chia giai đoạn UTTTL, gồm hai giá trị: độ Gleason điểm Gleason 1.3.2 Methyl hóa DNA ung thư tuyến tiền liệt Hơn 30 gen bị methyl hóa bất thường UTTTL, methyl hóa promoter gen GSTP1 phổ biến rộng rãi Methyl hóa GSTP1 có nhiều tiềm để phát triển thành dấu chuẩn hỗ trợ tiên lượng UTTTL 1.4 Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA 1.4.1 Phương pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) Khi DNA xử lý với bisulfite, cytosine không bị methyl biến đổi thành uracil, sau phản ứng PCR, uracil thành thymine Sự thay đổi nucleotide làm xuất vị trí nhận biết enzyme giới hạn 1.4.2 Phương pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction) MS-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa vào vùng giàu CpG cho phép phân biệt DNA bị methyl hóa với DNA khơng methyl hóa Kết hợp hai kỹ thuật MS-PCR với lai điểm cho phép định lượng cytosine bị methyl hóa khơng cần điện di 1.4.3 Phương pháp định lượng qMS-PCR Để tăng tính xác, hạn chế dương tính giả, TaqMan mồi kết hợp với đầu dò xây dựng hồn thiện, MethylLight HeavyLight hai kỹ thuật định lượng phổ biến 1.5 Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng ung thƣ 1.5.1 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng ung thư đặc biệt quan tâm áp dụng phổ biến: dấu chuẩn DNA, dấu chuẩn RNA dấu chuẩn protein 1.5.2 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thư tuyến tiền liệt PSA (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt) dấu chuẩn sinh học phổ biến, ngồi cịn có alpha-methylacyl CoA racemase (AMACR), kháng nguyên màng đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSMA), protein giàu cystein, Chromogranin A, PCA3… 1.5.3 Triển vọng kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA Epi prolung dụng dấu chuẩn methyl hóa gen SHOX2 chẩn đốm sớm ung thư phổi Epiprocolon dựa dấu chuẩn methyl hóa SEPT9 chẩn đốn sớm ung thư đại tràng ConfirmMDx phân tích methyl hóa q mức gen GSTP1, APC RASSF1A nhằm hạn chế trường hợp sinh thiết không cần thiết UTTTL 1.6 Nghiên cứu methyl hóa DNA ung thƣ Việt Nam Nghiên cứu Trinh HT cho thấy 87,5 % mẫu UT đại trực tràng có methyl hóa mức gen ức chế khối u APC Tran THT cs.; Le NQ cs phát tỷ lệ methyl hóa gen ER tương ứng 26/28 (92,9 %) 21/24 (87,5 %) bệnh phẩm UT vú Vi Thuật Thắng cs nhận thấy 11/20 (55 %) mẫu UT 2/10 (20 %) mẫu PĐTTL có RASSF1A bị methyl hóa Phân tích methyl hóa DNA gen riêng rẽ hay phân tích kết hợp methyl hóa đồng thời nhiều gen UT cịn Vo LT cs phân tích đồng thời dấu chuẩn methyl hóa gen BRCA1, RASSF1A ER bệnh nhân UT buồng trứng với tỷ lệ methyl hóa 11/59 (18,6 %) gen BRCA1, 40/59 (67,8 %) gen RASSF1A 15/59 (25,4 %) gen ER Tác giả 45/59 (78 %) bệnh nhân bị methyl hóa q mức ba gen Ở Việt Nam, chưa có cơng bố phân tích methyl hóa GSTP1 ung thư tuyến tiền liệt Như vậy, phân tích dấu chuẩn di truyền ngoại gen dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 nói riêng lĩnh vực Việt Nam CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 96 mẫu bệnh phẩm TTL, dòng tế bào PC3, mẫu máu, nguyên vật liệu hóa chất sinh học phân tử 2.2 Thiết bị Các thiết bị chuyên dụng cho sinh học phân tử 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu - Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA - Ni cấy dịng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 - Tách chiết DNA tổng số - Xử lý DNA tổng số với bisulfite - Tách dòng - Phương pháp PCR - Phương pháp lai điểm - Phương pháp điện di - Xác định nồng độ DNA phương pháp đo quang phổ hấp thụ - Tinh sản phẩm PCR - Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR - Xử lý kết thống kê sinh học - Xác định số copy 2.4 Sơ đồ thí nghiệm Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập phân loại mẫu 96 mẫu bệnh phẩm TTL đúc paraffin (59 mẫu UT 37 mẫu PĐT), thu thập Bệnh viện K Hà Nội Mẫu máu người khỏe mạnh chống đông với heparin, cung cấp Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 nuôi cấy môi trường đặc hiệu 3.2 Tách chiết DNA tổng số 3.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu máu dòng tế bào ni cấy PC3 Hình 3.3 (A) Kết điện di DNA tổng số tách từ máu (P1) từ dòng tế bào PC3 (P2) gel agarose % (B) Kết xác định nồng độ DNA phương pháp đo độ hấp thụ Băng DNA tổng số sáng, rõ nét chứng tỏ DNA tách đạt chất lượng tốt Tỷ lệ A260/A280 mẫu DNA đạt giá trị 1,8 - 2,0 chứng tỏ DNA có độ tinh đạt yêu cầu 3.2.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin DNA tổng số tách chiết từ 20 lát cắt/mẫu 96 mẫu TTL kit QIAamp DNA FFPE Tissue kit (Qiagen) Mẫu đúc paraffin có nồng độ DNA thấp, bị đứt gãy lẫn nhiều tạp chất nên điện di xác định nồng độ phương pháp đo độ hấp thụ không xác Trong nghiên cứu, ng 25 ng DNA tổng số tách từ dòng tế bào PC3 µl DNA tổng số mẫu đúc sử dụng làm khn phản ứng PCR để khuếch đại trình tự 268 bp gen đơn quản gia β-globin để đánh giá lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm Kết cho thấy µl DNA tách từ mẫu đúc có ng hầu hết DNA tách từ mẫu đúc đảm bảo số lượng theo yêu cầu kit xử lý bisulfite Hình 3.4 (A) Kết điện di minh họa DNA tổng số tách từ mẫu đúc nến UT (P1-P4) PĐT (B1-B4) gel agarose % (B) Kết xác định nồng độ DNA phương pháp đo độ hấp thụ Hình 3.5 Kết điện di gel agarose 1,5 % minh họa sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin 3.3 Xử lý DNA tổng số với bisulfite 3.3.1 Đánh giá chất lượng DNA sau xử lý bisulfite Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen β-globin với cặp mồi đặc hiệu cho DNA không xử lý bisulfite (A) cho DNA sau xử lý (B) gel acrylamide % Quá trình xử lý yêu cầu: (1) DNA xử lý hoàn toàn đảm bảo khơng cịn DNA ngun gốc (2) DNA thu hồi sau xử lý đảm bảo đủ lượng khuôn cho phản ứng MS-PCR Để đánh giá XL bisulfite xảy hoàn tồn, DNA sau XL dùng làm khn cho phản ứng PCR với cặp mồi gen β-globin, cặp mồi đặc hiệu với DNA không XL bisulfite Gen β-globin không bị methyl hóa nên trình tự nucleotide sau XL bisulfite có tất C biến đổi thành U Do đó, cặp mồi thiết kế theo trình tự DNA gốc bắt cặp với DNA bị XL Vì q trình XL xảy hồn tồn khơng có sản phẩm PCR Ngược lại, mẫu DNA không xử lý hết xuất băng DNA có kích thước 268 bp Kết Hình 3.6A cho thấy khơng thu băng có kích thước 268 bp cho gen β-globin mẫu DNA qua XL bisulfite Băng 268 bp xuất với DNA không bị xử lý Điều chứng tỏ mẫu DNA XL hồn tồn Sau q trình XL bisulfite, lượng DNA bị hao hụt nhiều bị biến tính chịu tác động hóa chất xử lý, bước tinh Vì cần kiểm tra lượng DNA sau XL có đủ làm khn cho phân tích MS-PCR Q trình kiểm tra thực phản ứng PCR với cặp mồi Un – Globin thiết kế để khuếch đại trình tự gen đơn β globin từ DNA XL (có tất C biến đổi thành U) Kết PCR trình bày Hình 3.6B cho thấy băng DNA 244 bp khuếch đại từ DNA XL Hơn nữa, kết âm tính khơng có sản phẩm PCR với khn DNA chưa XL chứng tỏ tính đặc hiệu cặp mồi Un-globin không bắt cặp nhầm với loại DNA Như vậy, lượng DNA sau XL đảm bảo cho phản ứng MS-PCR 10 Hình 3.10 Kết xác định tính đặc hiệu cặp mồi MS-PCR phát GSTP1 khơng bị methyl hóa (149 bp) (A) GSTP1 bị methyl hóa (155 bp) (B) 3.5 Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa 3.5.1 Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu phản ứng cắt với enzym giới hạn Trình tự nucleotide promoter GSTP1 vùng thiết kế mồi MS-PCR có chứa vị trí CGCG nhận biết enzym giới hạn BstUI Khi GSTP1 bị methyl hóa CGCG giữ ngun, ngược lại biến đổi thành TGTG Vì vậy, sử dụng enzym giới hạn có vị trí nhận biết chứa CG cho phép phân biệt trình tự bị methyl hóa/khơng bị methyl hóa Phản ứng cắt BstUI xảy theo nguyên tắc: vị trí bị methyl hóa trình tự 155 bp bị cắt tạo nên ba đoạn có kích thước 90 bp, 40 bp 25 bp Khi có hai vị trí CGCG bị methyl hóa thu tổ hợp đoạn có kích thước 115 bp, 40 bp 130 bp, 25 bp Ngược lại, hai vị trí nhận biết BstUI khơng bị methyl hóa (trình tự 149 bp) khơng có sản phẩm cắt enzyme giới hạn Kết Hình 3.11B cho thấy sản phẩm 155 bp khuếch đại từ PC3 bị methyl hóa hồn tồn vị trí nhận biết BstUI Trong đó, sản phẩm 149 bp khuếch đại từ mẫu máu đặc hiệu cho GSTP1 khơng bị methyl hóa khơng bị cắt hai vị trí 13 Hình 3.11 (A) Sơ đồ vị trí nhận biết BstUI trình tự GSTP1 bị methyl hóa có kích thước 155 bp khuếch đại phản ứng MSPCR (B) Kết điện di sản phẩm MS-PCR cắt với enzyme BstUI gel acrylamide 10 % 3.5.2 Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu giải trình tự Sản phẩm 258 bp promoter với sản phẩm 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa tế bào PC3 sản phẩm 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa tế bào máu tinh sạch, tách dòng plasmid biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Kết sàng lọc Hình 3.12 cho thấy trình tự tách dịng thành cơng Plasmid gK2 mang đoạn chèn GSTP1 không XL bisulfite, plasmid mK1 mang đoạn chèn GSTP1 bị methyl hóa, plasmid uK6 mang đoạn chèn GSTP1 khơng bị methyl hóa xác định trình tự Trình tự GSTP1 khuếch đại từ DNA khơng XL bisulfite có mức độ tương đồng 100 % so với trình tự GSTP1 (NC_000011.9) ngân hàng liệu (Hình 3.13A) Kết Hình 3.13B cho thấy 19 vị trí C biến đổi thành T trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa, chứng tỏ XL bisulfite xảy hồn tồn Tuy nhiên trình tự GSTP1 bị methyl hóa PC3 có 17 C bị methyl hóa phức CpG (trong C bị biến đổi thành T trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa mẫu máu) Điều chứng tỏ C phức CpG bị methyl hóa Như vậy, cặp mồi MS-PCR khuếch đại đặc hiệu cho phép phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa với trình tự khơng bị methyl hóa 14 Hình 3.12 Kết kiểm tra có mặt trình tự GSTP1 khơng xử lý bisulfite (A), GSTP1 bị methyl hóa (B) GSTP1 khơng bị methyl hóa (C) plasmid tái tổ hợp Hình 3.13 (A) Kết so sánh trình tự promoter gen GSTP1 với ngân hàng liệu (B) Kết giải trình tự trình tự GSTP1 khơng XL bisulfite, GSTP1 bị methyl hóa khơng bị methyl hóa 3.6 Xác định methyl hóa promoter gen GSTP1 mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt phì đại tuyến Methyl hóa GSTP1 phân tích 59 mẫu ung thư tuyến tiền liệt 37 mẫu phì đại tuyến Kết MS-PCR cho thấy 39/59 mẫu UTTTL 4/37 mẫu PĐT có GSTP1 bị methyl hóa, với tỷ lệ tương ứng 66,1 % 10,8 % tỷ lệ methyl hóa GSTP1 khác tộc người Yegnasubramanian & cs (2004) nghiên cứu bệnh nhân UTTTL Mỹ phát tỷ lệ methyl hóa GSTP1 đạt 94,0 % 15 Enokida & cs (2005) phát methyl hóa GSTP1 92/170 mẫu đạt 54,0 % 170 mẫu UTTTL bệnh nhân Nhật Bản Nghiên cứu Syeed & cs (2010) bệnh nhân Ấn Độ phát tỷ lệ methyl hóa GSTP1 29/50 trường hợp UTTTL đạt 58,0 % Hình 3.14 Kết minh họa sản phẩm MS-PCR phát methyl hóa promoter gen GSTP1 mẫu bệnh phẩm tuyến tiền liệt Bên cạnh mẫu ung thư TTL, mẫu PĐT phát methyl hóa gen GSTP1 Trong nghiên cứu, mẫu PĐT đạt tỷ lệ methyl hóa 10,8 % Kết phù hợp với nghiên cứu công bố Enokida & cs (2005), Syeed & cs (2010) phát methyl hóa mức GSTP1 4/69 (5,8 %) 12/45 (26,6 %) mẫu PĐT Tỷ lệ methyl hóa bệnh nhân UT cao nhiều so với bệnh nhân PĐT Vì vậy, bệnh nhân TTL Việt Nam sử dụng kit thương mại hỗ trợ phân biệt ung thư/phì đại tuyến tiền liệt dấu chuẩn methyl hóa GSTP1 16 3.7 Phân tích tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 đặc điểm mô bệnh học Kết cho thấy sai khác có ý nghĩa thống kê tỷ lệ methyl hóa GSTP1 mẫu UT PĐT (p< 0.0001) Sử dụng phần mềm thống kê sinh học Medcalc, phân tích mối tương quan methyl hóa GSTP1 với đặc điểm mơ bệnh học cho thấy mối tương quan methyl hóa GSTP1 với loại mẫu phân độ Gleason có ý nghĩa thống kê với xác suất p 0,05 Kết cho phép khẳng định dấu ấn methyl hóa GSTP1 đặc thù cho UTTTL, khác biệt mẫu PĐT Hầu hết nghiên cứu trước sử dụng phương pháp MSPCR để đánh giá tình trạng methyl hóa gen riêng lẻ đơn giản hiệu Tuy vậy, phương pháp tồn vài hạn chế tượng dương tính giả, âm tính giả hay khơng cho phép định lượng hay xác định methyl hóa phần đoạn trình tự nghiên cứu Để cải tiến độ nhạy, phương pháp MS-PCR định lượng pyrosequencing phát triển, cho phép định lượng vị trí methyl hóa Như vậy, áp dụng MS-PCR định lượng hay pyrosequencing cần thiết để xác định xác vị trí Cytosine bị methyl hóa dấu chuẩn GSTP1 hỗ trợ chẩn đoán tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt 17 Bảng 3.1 Mối liên quan đặc điểm mơ học methyl hóa promoter gen GSTP1 mẫu ung thư tuyến tiền liệt phì đại tuyến bệnh nhân Việt Nam Hình 3.15 Đường cong ROC thể mối tương quan methyl hóa promoter gen GSTP1 với loại mẫu ung thư tuyến tiền liệt/ phì đại tuyến (A), với độ Gleason (B) độ tuổi bệnh nhân (C) 18 3.8 Xây dựng sinh phẩm phát GSTP1 bị methyl hóa 3.8.1 Xác định độ nhạy phản ứng MS-PCR phát GSTP1 bị methyl hóa Để xác định độ nhạy, plasmid chuẩn lựa chọn plasmid tái tổ hợp mang đoạn GSTP1 bị methyl hóa, kí hiệu pG-Me DNA plasmid pG-Me tách chiết chủ yếu dạng siêu xoắn (Hình 3.16A) pG-Me cắt mở vòng với enzyme EcoRI Sản phẩm cắt tinh kit xác định nồng độ thông qua giá trị A260 DNA tổng số tách từ máu (Hình 3.16B) DNA khơng bị methyl hóa dùng làm đối chứng âm cho cặp mồi phát DNA bị methyl hóa Trong nghiên cứu này, DNA từ máu trước sau XL bisulfite trộn với DNA plasmid pG-Me để tạo mẫu tương tự DNA tách từ tế bào 50 ng DNA tổng số chưa XL (~1500 tế bào) 10 ng DNA XL trộn với 10 copy plasmid pG-Me dạng thẳng Kết Hình 3.17 cho thấy có mặt DNA tổng số tách từ máu chưa bị xử lý bisulfite không làm ảnh hưởng đến độ nhạy phát 10 copy GSTP1 bị methyl hóa Như vậy, sử dụng DNA plasmid dạng thẳng làm đối chứng chuẩn độ nhạy phát trình tự GSTP1 bị methyl hóa đạt 10 copy/2000 tế bào (4000 allen) tương đương 0,3 % allen GSTP1 bị methyl hóa Hình 3.16 Kết điện di plasmid tái tổ hợp pG-Me (A) DNA tổng số tách từ máu (B) gel agarose % 19 Hình 3.17 (A) Kết PCR xác định độ nhạy phát GSTP1 từ plasmid pG-Me dạng thẳng (B) Kết PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu DNA khác 3.8.2 Các thành phần sinh phẩm Tương tự sinh phẩm thương mại “CpG WIZ GSTP1 Amplification Kit” phát GSTP1 bị methyl hóa Hãng Millipore (Code 7808), xây dựng sinh phẩm “GSTP1METHYL Test” gồm loại DNA cặp mồi đặc hiệu cho loại DNA: DNA đối chứng cho GSTP1 bị methyl hóa (DNA-Me); loại DNA đối chứng cho GSTP1 khơng bị methyl hóa (DNA-Un) loại “DNA control” dùng để kiểm tra hóa chất phản ứng PCR Mỗi mẫu DNA (sau XL) thực với cặp mồi (GS Me, GS Un UN-globin) Đồng thời, DNA đối chứng sử dụng với cặp mồi đặc hiệu tương ứng DNA-Un khuếch đại với cặp mồi GS Un; DNA-Me khuếch đại với cặp mồi GS Me DNA-control đối chứng dương cho gen β globin khơng bị methyl hóa khuếch đại cặp mồi UN-globin Sản phẩm PCR điện di gel acrylamide % Sự xuất băng DNA 155 bp đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa băng DNA 149 bp đặc hiệu cho GSTP1 không bị methyl hóa Băng DNA 244 bp đặc hiệu cho β globin khơng bị methyl hóa Đối với mẫu bệnh phẩm thu kết quả: (1) Mẫu có băng DNA 149 bp chứng tỏ promoter GSTP1 khơng bị methyl hóa; (2) Mẫu có băng DNA 155 bp chứng tỏ promoter gen GSTP1 bị methyl hóa; (3) Mẫu có hai băng 149 bp 155 bp chứng tỏ promoter GSTP1 bị methyl hóa allen cịn lẫn tế bào lành có GSTP1 khơng bị methyl hóa; (4) Mẫu DNA cho kết âm tính với hai cặp mồi 20 GS Me GS Un cần phân tích với cặp mồi globin UN; (5) Mẫu cho kết âm tính với loại mồi phải XL lại Hình 3.18 (A) Kết thử nghiệm mẫu DNA đối chứng sinh phẩm “GSTP1-METHYL Test” (B) Kết xác định GSTP1 bị methyl hóa sinh phẩm “GSTP1-METHYL Test” mẫu đại diện Hình 3.19 Kết xác định GSTP1 bị methyl hóa sinh phẩm thử nghiệm mẫu bệnh phẩm Hình 3.20 (A) Bộ sinh phẩm “GSTP1-METHYL Test” sản xuất thử nghiệm nhằm phát GSTP1 bị methyl hóa, hỗ trợ chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt (B) Kết thử nghiệm sinh phẩm bảo quản - 20 0C sau tháng 21 3.9 Xây dựng qui trình lai điểm (dot blot) để tăng độ nhạy độ xác phát sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa từ phản ứng MS-PCR Trong nghiên cứu này, sử dụng pG-Me để đánh dấu đầu dò xây dựng qui trình lai điểm nhằm xác định sản phẩm MS-PCR đặc hiệu với GSTP1 bị methyl hóa Hình 3.21 Đầu dị GSTP thiết kế dựa trình tự GSTP1 bị methyl hóa tách dịng plasmid tái tổ hợp pG-Me 3.9.1 Đánh dấu đầu dò với biotin Hình 3.22 Kết đánh dấu đầu dị GSTP1 với biotin Băng DNA tương ứng với đầu dò đánh dấu biotin P(+) có kích thước cao so với băng DNA tương ứng với đầu dị khơng đánh dấu P(-), chứng tỏ đánh dấu thành cơng đầu dị cho trình lai điểm 3.9.2 Tối ưu điều kiện lai điểm Trước tiên, chúng tơi tiến hành chuẩn hóa điều kiện khóa màng để loại trừ liên kết khơng đặc hiệu xảy màng làm 22 ảnh hưởng tới q trình thu tín hiệu Kết cho thấy điều kiện sử dụng dung dịch khóa màng U1 (Tris-HCl 1M pH 7,5; NaCl 1,5M) có bổ sung Tween 20 cho tín hiệu rõ nhất, khơng có tín hiệu nhiễu Tiếp đó, thay đổi nhiệt độ lai từ 50 0C đến 68 0C cho thấy nhiệt độ lai 65 0C, màng lai cho tín hiệu quan sát P(+) P(-) rõ nét, khơng có tín hiệu nhiễu (hình 3.24) 3.9.3 Xác định tính đặc hiệu kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa khơng methyl Để khẳng định tính đặc hiệu đầu dị thiết kế, chúng tơi phân biệt đoạn GSTP1 155 bp với đoạn GSTP1 149 bp Kết Hình 3.25 cho thấy vị trí chấm đầu dị P(+) P(-)cho tín hiệu rõ nét chứng tỏ trình đánh dấu tương tác streptavidin với biotin tốt Vị trí GSTP1 155 bp cho tín hiệu màu rõ ràng chứng tỏ DNA bị methyl hóa lai với đầu dị Vị trí GSTP1 149 bp khơng xuất tín hiệu màu chứng tỏ sau q trình lai rửa khơng có bắt cặp bổ sung trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa với đầu dị đặc hiệu 23 Hình 3.25 Kết lai điểm phân biệt GSTP1 bị methyl hóa GSTP1 khơng methyl hóa 3.9.4 Xác định độ nhạy kỹ thuật lai điểm Hình 3.26 Độ nhạy phát GSTP1 bị methyl hóa lai điểm Kĩ thuật lai phát 10 copy đoạn GSTP1 bị methyl hóa 10000 đoạn khơng bị methyl hóa (DNA máu) Độ nhạy kỹ thuật lai điểm phát 0,01 % allen bị methyl hóa Độ nhạy tăng 30 lần so với thực MS-PCR 3.9.5 Xác định sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu ung thư tuyến tiền liệt mẫu phì đại Hình 3.27 Kết lai điểm phát sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ 39 mẫu ung thư tuyến tiền liệt Tất 39 vị trí sản phẩm MS-PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu UTTTL cho tín hiệu rõ nét, đồng nghĩa phát GSTP1 bị methyl hóa Kết lai điểm hoàn toàn 24 phù hợp với kết MS-PCR So sánh kết lai điểm với kết điện di, nhận thấy kiểm tra sản phẩm MS-PCR lai điểm tiết kiệm thời gian điện di giảm thao tác chuẩn bị nhuộm gel Hơn nữa, sản phẩm PCR phải đạt đủ lượng gel điện di phát bằeng phương pháp nhuộm ethidium Trong nghiên cứu, sản phẩm MS-PCR thường điện di µl quan sát rõ Tuy nhiên µl chấm lên màng cho tín hiệu lai rõ nét Như vậy, lai điểm thêm lần khuếch đại tín hiệu phát DNA đích bị methyl hóa nồng độ nhỏ khơng quan sát điện di Hình 3.28 (A) Kết lai điểm phát sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu phì đại tuyến tiền liệt B1-B4 (B) Sản phẩm PCR khuếch đại trình tự 155 bp từ mẫu phì đai tuyến B1-B4 có GSTP1 bị methyl hóa (C) Kết giải trình tự sản phẩm MS-PCR từ mẫu phì đại tuyến tiền liệt B1-B4 (Đánh số mẫu có GSTP1 bị methyl hóa theo thứ tự phụ lục 1) Tất vị trí sản phẩm MS-PCR khuếch đại GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu phì đại tuyến tiền liệt cho tín hiệu, đồng nghĩa với việc phát GSTP1 bị methyl hóa Tuy nhiên, tín 25 hiệu quan sát từ mẫu khơng đồng đều, gợi ý mẫu có mức độ methyl hóa khác KẾT LUẬN Với kết thu trình thực luận án, rút số kết luận sau: Thiết kế thành công cặp mồi đặc hiệu tối ưu thành phần, điều kiện cho kỹ thuật MS-PCR để phát tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 Tỷ lệ methyl hóa gen GSTP1 bệnh nhân Việt Nam chiếm 66,1 % (39/59 mẫu) trường hợp ung thư tuyến tiền liệt; 10,8 % (4/37 mẫu) trường hợp phì đại tuyến Có mối tương quan có ý nghĩa methyl hóa GSTP1 mẫu UTTTL/PĐT, methyl hóa GSTP1 phân độ Gleason Methyl hóa GSTP1 đặc thù cho ung thư tuyến tiền liệt với p < 0,05 Xây dựng sinh phẩm thử nghiệm xác định GSTP1 bị methyl hóa dựa kỹ thuật MS-PCR với độ nhạy kỹ thuật 0.3 % có hướng dẫn chi tiết thực phản ứng Thiết kế đầu dò cải tiến kỹ thuật lai điểm để tăng độ nhạy phát sản phẩm MS-PCR đặc hiệu với GSTP1 bị methyl hóa khơng cần điện di; giảm chi phí, thời gian đơn giản thao tác KIẾN NGHỊ Áp dụng kỹ thuật MS-PCR phát dấu chuẩn methyl hóa gen GSTP1 mẫu dịch bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt phì đại tuyến (máu, nước tiểu…) Bổ sung thêm dấu chuẩn nghiên cứu methyl hóa DNA ung thư tuyến tiền liệt dấu chuẩn methyl hóa gen APC, MDR1 Tiếp tục hoàn thiện kỹ thuật lai điểm việc thiết kế đầu dị đa đích phát đồng thời sản phẩm MS-PCR panel dấu chuẩn methyl hóa DNA 26 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vƣơng Diệu Linh, Tạ Văn Tờ, Đặng Bảo Châu, Võ Thị Thương Lan (2012), “Nghiên cứu tượng methyl hóa promoter gen GSTP1 bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến bệnh viện K”, Tạp chí ung thư học Việt Nam, số 1, tr 224-229 Nguyễn Thu Trang, Đoàn Thị Hồng Vân, Vƣơng Diệu Linh, Tạ Văn Tờ, Tạ Bích Thuận, Võ Thị Thương Lan (2014), “Áp dụng kỹ thuật lai điểm (dot blot) để phát sản phẩm MSP đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa bệnh phẩm ung thư tuyến tiền liệt”, Tạp chí Y dược lâm sàng 108, tập 9, tr 71-76 ISSN 1859-2872 Lan VT, Trang NT, Van DT, Thuan TB, To TV, Linh VD, Uyen NQ (2015), “A methylation-specific dot blot assay for improving specificity and sensitivity of methylation-specific PCR on DNA methylation analysis”, Int J Clin Oncol., 20(4), pp 839-45 Thi Thuong Lan Vo, Bich Thuan Ta, Van To Ta, Dieu Linh Vuong and Quynh Uyen Nguyen (2016), “Promoter methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in prostate cancer and benign hyperplasia in Vietnamese men”, Turkish Journal of Medical, 46(1), pp 228-35 27 ... methyl hóa gen GSTP1 mẫu dịch bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt phì đại tuyến (máu, nước tiểu…) Bổ sung thêm dấu chuẩn nghiên cứu methyl hóa DNA ung thư tuyến tiền liệt dấu chuẩn methyl hóa gen. .. khả kháng sinh y học đại Với lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu tượng methyl hóa gen GSTP1 liên quan ung thư tuyến tiền liệt bệnh nhân Việt Nam? ?? với mục đích: - Phân tích mức độ methyl hóa. .. bị methyl hóa dấu chuẩn GSTP1 hỗ trợ chẩn đốn tiên lượng ung thư tuyến tiền liệt 17 Bảng 3.1 Mối liên quan đặc điểm mô học methyl hóa promoter gen GSTP1 mẫu ung thư tuyến tiền liệt phì đại tuyến