Nghiên cứu hiện tượng methyl hóa vùng promoter gen GSTP1 trong quá sản lành tính và ung thư tuyến tiền liệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG QUÁ SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *************** Vƣơng Diệu Linh NGHIÊN CỨU HIỆN TƢỢNG METHYL HĨA VÙNG PROMOTER GEN GSTP1 TRONG Q SẢN LÀNH TÍNH VÀ UNG THƢ TUYẾN TIỀN LIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án cơng trình nghiên cứu số kết nghiên cứu, cộng tác với cộng khác, sản phẩm đề tài KC.04.05/11-15; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc cơng bố tạp chí khoa học chun ngành nhƣ hội nghị nƣớc quốc tế với đồng ý cho phép đồng tác giả; kết lại luận án chƣa đƣợc tác giả công bố cơng trình khác Hà nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Vƣơng Diệu Linh LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, Khoa Sinh học, Đai học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người hướng dẫn, bảo tận tình suốt q trình tơi thực luận án Cơ khơng truyền thụ cho nhiều kiến thức chuyên môn mà cịn giúp tơi bồi đắp lịng say mê, nghiêm túc, tính cẩn thận nghiên cứu khoa học Đó tảng cho q trình thực luận án, hành trang giúp tự tin vững bước đường khoa học sau Trong thời gian học tập nghiên cứu Phịng thí nghiệm Sinh Y, tơi xin trân trọng cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận Cô động viên, dành cho nhiều lời khun q báu lúc tơi gặp khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Giải phẫu bệnh Sinh học phân tử, Bệnh viện K tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ cấp kinh phí cho đề tài KC.04.05/11-15 hỗ trợ cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Sinh Y, Phịng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đồng nghiệp Trung tâm Giải phẫu bệnh Sinh học phân tử, Bệnh viện K bên cạnh giúp đỡ cổ vũ suốt thời gian qua Với tất lịng biết ơn, tơi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè ln tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện chia sẻ khó khăn thời gian qua, giúp tơi hoàn thành tốt luận án Nghiên cứu sinh Vương Diệu Linh MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG 12 MỞ ĐẦU 13 CHƢƠNG TỔNG QUAN 16 1.1 Ung thƣ 16 1.1.1 Thực trạng ung thƣ .16 1.1.2 Cơ sở tế bào học ung thƣ 17 1.1.3 Di truyền học ung thƣ 19 1.2 Di truyền ngoại gen ung thƣ 22 1.2.1 Di truyền ngoại gen 22 1.2.2 Biến đổi histone ung thƣ 23 1.2.3 Methyl hóa DNA 24 1.2.4 Methyl hóa DNA bất thƣờng ung thƣ 25 1.3 Ung thƣ tuyến tiền liệt 26 1.3.1 Phân độ ung thƣ tuyến tiền liệt 26 1.3.2 Methyl hóa DNA ung thƣ tuyến tiền liệt 28 1.3.3 Cấu trúc chức gen GSTP1 30 1.4 Phƣơng pháp phân tích methyl hóa DNA 31 1.4.1 Phƣơng pháp COBRA (Combined Bisulfite Restriction Analysis) 32 1.4.2 Phƣơng pháp PCR đặc hiệu methyl MS-PCR (Methylation specific Polymerase chain reaction) .33 1.4.3 Phƣơng pháp định lƣợng qMS-PCR .34 1.5 Dấu chuẩn sinh học hỗ trợ chẩn đoán, tiên lƣợng bệnh ung thƣ 36 1.5.1 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ 366 1.5.2 Dấu chuẩn sinh học sử dụng cho ung thƣ tuyến tiền liệt 38 1.5.3 Triển vọng kit sử dụng dấu chuẩn methyl hóa DNA 39 1.6 Nghiên cứu methyl hóa DNA ung thƣ Việt Nam 41 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Nguyên liệu 43 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 43 2.1.2 Các vật liệu 43 2.1.3 Hóa chất .44 2.2 Thiết bị 46 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 47 2.3.1 Chuẩn bị mẫu để tách chiết DNA 47 2.3.2 Ni cấy dịng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 47 2.3.3 Tách chiết DNA tổng số .48 2.3.4 Xử lý DNA tổng số với bisulfite 48 2.3.5 Tách dòng .49 2.3.6 Phƣơng pháp PCR 52 2.3.7 Phƣơng pháp lai điểm 56 2.3.8 Phƣơng pháp điện di .57 2.3.9 Xác định nồng độ DNA phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ 58 2.3.10 Tinh sản phẩm PCR 58 2.3.11 Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng MS-PCR 58 2.3.12 Xác định số copy 59 2.3.13 Xử lý kết thống kê sinh học 59 2.4 Sơ đồ thí nghiệm 60 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Thu thập phân loại mẫu 61 3.2 Tách chiết DNA tổng số 63 3.2.1 Tách chiết DNA từ mẫu máu dịng tế bào ni cấy PC3 63 3.2.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm đúc paraffin 63 3.3 Xử lý DNA tổng số với bisulfite 66 3.3.1 Xây dựng phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng DNA sau xử lý bisulfite 66 3.3.2 Xử lý DNA tổng số mẫu bệnh phẩm với bisulfite .68 3.4 Tối ƣu phản ứng MS-PCR để phát methyl hóa promoter gen GSTP1 69 3.5 Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu cho GSTP1 bị methyl hóa 73 3.5.1 Kiểm tra sản phẩm đặc hiệu phản ứng cắt với enzym giới hạn 73 3.5.2 Kiểm tra sản phẩm MS-PCR đặc hiệu giải trình tự .74 3.6 Xác định methyl hóa promoter gen GSTP1 mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt sản lành tính 77 3.7 Xác định ngƣỡng phát methyl hóa promoter gen GSTP1 phản ứng MSPCR 80 3.8 Phân tích tình trạng methyl hóa promoter gen GSTP1 đặc điểm lâm sàng 82 3.9 Xây dựng qui trình lai điểm (dot blot) để tăng độ nhạy độ xác phát sản phẩm GSTP1 bị methyl hóa từ phản ứng MS-PCR 85 3.9.1 Đánh dấu đầu dò với biotin 87 3.9.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm 88 3.9.3 Xác định tính đặc hiệu kỹ thuật lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa khơng methyl hóa 89 3.9.4 Xác định ngƣỡng phát kỹ thuật lai điểm 91 3.9.5 Xác định sản phẩm MS-PCR có GSTP1 bị methyl hóa từ mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt mẫu sản lành tính 92 KẾT LUẬN 97 KIẾN NGHỊ 98 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 Tiếng Việt 100 Tiếng Anh 100 Trang Web 114 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ A260 Độ hấp thụ bƣớc sóng 260 nm A280 Độ hấp thụ bƣớc sóng 280 nm ACS American Cancer Society (Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ) AMACR Alpha-Methylacyl CoA Racemase AP-1 Activator Protein - APC Adenomatous polyposis of the colon gene Apoptosis Chết theo chƣơng trình AUC Area under the ROC curve bp Base pair BHV-4 Bovine Herpesvirus - BRCA1/2 Breast cancer susceptibility gene BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết bò) BstUI Enzym giới hạn BstUI C-onc Cellular oncogenes CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A gene (p16(INK4a)) COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis CRBP1 Cellular retinol-binding protein-1 CRISP-3 Cysteine-rich secretory protein cs Cộng Da Dalton DNA Acid deoxyribonucleic DNMTs DNA methyltransferase dNTP Deoxynucleotide triphosphate DRE Digital Rectal Exam (Thăm khám qua trực tràng) dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate EcoRI Enzym giới hạn EcoRI EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ER Estrogen receptor (thụ thể estrogen) FFPE Formalin fixed paraffin embedded GIST Gastrointestinal Stromal Tumor (U mô đệm dày - ruột) GSH Glutathione GSPT1 Glutathione S-transferase Pi gene GSTs Glutathione S-transferase GTP Guanosine Triphosphate H&E Haematoxylin & Eosin HATs Histone acetyltransferase HDACs Histone deacetylase HDMs Histone demethylase HIC1 Hypermethylated in cancer gene HMTs Histone methyltransferase hTERT Humans Telomerase Reverse Transcriptase Gene IARC International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên cứu ung thƣ giới) JMJD3 Jumonji domain-containing protein gene JNK c-Jun N-terminal kinase kb Kilobase = 1000 bp KIT v-kit Hardy-Zuckerman filine sarcoma viral oncogene homolog LB Luria-Bertani (môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn) LSD1 Lysine specific demethylase 1A MDR Multidrug resistance gene MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene MLH1 MutL homolog gene MS-DBA Methyl specific dot blot assay (Lai điểm đặc hiệu methyl) MS-PCR Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl) PBS Phosphate Buffer Saline PC3 Prostate cancer cell lines (Dòng tế bào nuôi cấy) PCA3 prostate cancer antigen gene Platelet – Derived Growth Factor (yếu tố tăng trƣởng có nguồn PDGF gốc tiểu cầu) PDGFRA Platelet-derived growth factor alpha gene PR Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone) PSA Prostate Specific Antigen (Kháng thể đặc hiệu tuyến tiền liệt) PSMA Prostate-specific membrane antigen RASSF1A Ras association domain family 1A gene Rb1 Retinoblastoma gene ROC Receiver Operating Characteristic RTK Receptor Tyrosine Kinase SA-AP Streptavidin - Alkaline Phosphatase SAT2, NBL2 D424, Trình tự DNA lặp lại SDS Sodium Dodecyl Sulfate SEPT9 Septin gene SHOX2 Short stature homeobox gene SP1 Specificity Protein SSC Saline Sodium Citrate SYBR Syber Green (thuốc nhuộm DNA) TAE Tris-acetate-EDTA TBE Tris-borate-EDTA TEMED N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine TIMP3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases gene UTX ubiquitously-transcribed TPR gene on the X chromosome UV Tia tử ngoại VHL Von Hippel-Lindau gene 84 Mikeska T., Candiloro I.L., Dobrovic A (2010), "The implications of heterogeneous DNA methylation for the accurate quantification of methylation", Epigenomics 2(4), 561-73 85 Miki Y., Swensen J., Shattuck-Eidens D., Futreal P.A., Harshman K., Tavtigian S., Liu Q., Cochran C., Bennett L.M., Ding W (1994), "A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1", Science 266(5182), 66-71 86 Nakayama M., Bennett C.J., Hicks J.L., Epstein J.I., Platz E.A., Nelson W.G., De Marzo A.M (2003), "Hypermethylation of the human glutathione Stransferase-pi gene (GSTP1) CpG island is present in a subset of proliferative inflammatory atrophy lesions but not in normal or hyperplastic epithelium of the prostate: a detailed study using laser-capture microdissection", American Journal of Pathology 163(3), 923-33 87 Ngoan L.T., Lua N.T., L.T.M Hang (2007), "Cancer mortality pattern in Viet Nam", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 8(4), 535–8 88 Nowain A., Bhakta H., Pais S., Kanel G., Verma S (2005), "Gastrointestinal stromal tumors: clinical profile, pathogenesis, treatment strategies and prognosis", Journal of Gastroenterology and Hepatology 20(6), 818-24 89 Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E (1999), "DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development", Cell 99(3), 247-57 90 Olga B., Pavel L., Tatyana S., Anna B., Evgeniy M., Alena L., Hans K., Kurt M, Valentin V (2013), "Efficacy of bisulfite modification and recovery of human genomic and circulating DNA using commercial kits", European Journal of Molecular Biology 1(1), 1-8 91 Partha M.D and Rakesh S (2004), "DNA methylation and cancer", Journal of Clinical Oncology 22, 4632-42 92 Pfeifer G.P and Rauch T.A (2009), "DNA methylation patterns in lung carcinomas", Seminars in Cancer Biology 19(3), 181-7 93 Pogribny I.P (2010), "Epigenetic events in tumorigenesis: putting the pieces together", Experimental Oncology 32(3), 132-6 109 94 Prensner J.R., Rubin M.A., Wei J.T., Chinnaiyan A.M (2012), "Beyond PSA: The next generation of prostate cancer biomarkers", Science Translational Medicine 4(127), 127rv3 95 Presti Jr J.C (2000), "Prostate cancer: assessment of risk using digital rectal examination, tumor grade, prostate-specific antigen, and systematic biopsy", Radiologic Clinics of North America 38(1), 49-58 96 Probst A.V., Dunleavy E., Almouzni G (2009), "Epigenetic inheritance during the cell cycle", Nature Reviews Molecular Cell Biology 10(3), 192-206 97 Rhee I., Bachman K.E., Park B.H., Jair K.W., Yen R.W., Schuebel K.E., Cui H., Feinberg A.P., Lengauer C., Kinzler K.W., Baylin S.B., Vogelstein B (2002), "DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells", Nature 416(6880), 552-6 98 Robertson K.D (2001), "DNA methylation, methyltransferases, and cancer", Oncogene 20(24), 3139-55 99 Rogenhofer S., Kahl P., Holzapfel S., Ruecker A., Mueller S.C., Ellinger J (2012), "Decreased levels of histone H3K9me1 indicate poor prognosis in patients with renal cell carcinoma", Anticancer Research 32(3), 879-86 100 Rubin M.A., Zhou M., Dhanasekaran S.M., Varambally S., Barrette T.R., Sanda M.G., Pienta K.J., Ghosh D., Chinnaiyan A.M (2002), "alpha-Methylacyl coenzyme A racemase as a tissue biomarker for prostate cancer", Jama 287(13), 1662-70 101 Ruddon R.W (2007), Cancer Biology, 4th edition, Oxford University Press 102 Ruiz-Aragon J and Marquez-Pelaez S (2010), "Assessment of the PCA3 test for prostate cancer diagnosis: a systematic review and meta-analysis", Actas Urologicas Espanolas 34(4), 346-55 103 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed, Cold Spring Habor laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York, III (Appendix A, B) 104 Sawyers C.L (2008), "The cancer biomarker problem", Nature 452(7187), 548-52 110 105 Schatz P., Distler J., Schuster M (2006), "Novel method for high throughput DNA methylation marker evaluation using PNA-probe library hybridization and MALDI-TOF detection", Nucleic Acids Research 34(8), e59 106 Schmidt B., Liebenberg V., Dietrich D., Schlegel T., Kneip C., Seegebarth A., Flemming N., Seemann S., Distler J., Lewin J., Tetzner R., Weickmann S., Wille U., Liloglou T., Raji O., Walshaw M., Fleischhacker M (2010), "SHOX2 DNA methylation is a biomarker for the diagnosis of lung cancer based on bronchial aspirates", BMC Cancer 10, 600 107 Schneider R and Grosschedl R (2007), "Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression", Genes & Development 21(23), 3027-43 108 Schulte J.H., Lim S., Schramm A., Friedrichs N., Koster J., Versteeg R., Ora I., Pajtler K., Klein-Hitpass L., Kuhfittig-Kulle S., Metzger E., Schule R., Eggert A., Buettner R., Kirfel J (2009), "Lysine-specific demethylase is strongly expressed in poorly differentiated neuroblastoma: implications for therapy", Cancer Research 69(5), 2065-71 109 Schulz W.A and Goering W (2011), "Eagles report: Developing cancer biomarkers from genome-wide DNA methylation analyses", World Journal Clinical Oncology 2, 1-7 110 Schumacher A (2009), "Schumacher’s guide for : Bisulfite conversion of DNA for methylation fine-mapping", Method 1-6 111 Seligson D.B., Horvath S., McBrian M.A., Mah V., Yu H., Tze S., Wang Q., Chia D., Goodglick L., Kurdistani S.K (2009), "Global levels of histone modifications predict prognosis in different cancers", American Journal of Pathology 174(5), 1619-28 112 Seligson D.B., Horvath S., Shi T., Yu H., Tze S., Grunstein M., Kurdistani S.K (2005), "Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence", Nature 435(7046), 1262-6 113 Shao C., Sun W., Tan M., Glazer C.A., Bhan S., Zhong X., Fakhry C., Sharma R., Westra W.H., Hoque M.O., Moskaluk C.A., Sidransky D., Califano J.A., Ha P.K (2011), "Integrated, genome-wide screening for hypomethylated 111 oncogenes in salivary gland adenoid cystic carcinoma", Clinical Cancer Research 17(13), 4320-30 114 Sharma S., Kelly T.K and Jones P.A (2010), "Epigenetics in cancer", Carcinogenesis 31, 27-36 115 Sharp A.J., Stathaki E., Migliavacca E., Brahmachary M., Montgomery S.B., Dupre Y., Antonarakis S.E (2011), "DNA methylation profiles of human active and inactive X chromosomes", Genome Research 21(10), 1592-600 116 Shen L and Waterland R.A (2007), "Methods of DNA methylation analysis", Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 10, 576–81 117 Smith E., Bianco-Miotto T., Drew P., Watson D (2003), "Method for optimizing methylation-specific PCR", BioTechniques 35(1), 32-3 118 Song J., Noh J.H., Lee J.H., Eun J.W., Ahn Y.M., Kim S.Y., Lee S.H., Park W.S., Yoo N.J., Lee J.Y., Nam S.W (2005), "Increased expression of histone deacetylase is found in human gastric cancer", Apmis 113(4), 264-8 119 Song J.S., Kim Y.S., Kim D.K., Park S.I., Jang S.J (2012), "Global histone modification pattern associated with recurrence and disease-free survival in nonsmall cell lung cancer patients", Pathology International 62(3), 182-90 120 Stanbery L., D'Silva N.J., Lee J.S., Bradford C.R., Carey T.E., Prince M.E., Wolf G.T., Worden F.P., Cordell K.G., Petty E.M (2010), "High SEPT9_v1 Expression Is Associated with Poor Clinical Outcomes in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma", Translational Oncology 3(4), 239-45 121 Strachan T and Read A (2004), Human Molecular Genetics Fourth edition Garland Science 122 Syeed N., Syed Sameer A., Hamid A., Shah Z.A., Afroze D., Rasool R., Siddiqi M.A (2010), "Promoter methylation profile of GSTP1 and RASSF1A in benign hyperplasia and metastatic prostate cancer patients in a Kashmiri population", Molecular Medicine Reports 3(5), 883-7 123 Townsend D.M and Tew K.D (2003), "The role of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance", Oncogene 22(47), 7369-75 112 124 Tran T.H.T, Ta B.T and Vo T.T.L (2012), "Analysis of methylation of ER gene in Vietnamese patients with breast cancer by using methylation-specific polymerase chain reaction", VNU Journal of Science 28(2S), 203-8 125 Tuveson D.A., Willis N.A., Jacks T., Griffin J.D., Singer S., Fletcher C.D., Fletcher J.A., Demetri G.D (2001), "STI571 inactivation of the gastrointestinal stromal tumor c-KIT oncoprotein: biological and clinical implications", Oncogene 20(36), 5054-8 126 van Oijen M.G and Slootweg P.J (2000), "Gain-of-function mutations in the tumor suppressor gene p53", Clinical Cancer Research 6(6), 2138-45 127 Varambally S., Dhanasekaran S.M., Zhou M., Barrette T.R., Kumar-Sinha C., Sanda M.G., Ghosh D., Pienta K.J., Sewalt R.G., Otte A.P., Rubin M.A., Chinnaiyan A.M (2002), "The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer", Nature 419(6907), 624-9 128 Vardi A., Bosviel R., Rabiau N., Adjakly M., Satih S., Dechelotte P., Boiteux J.P., Fontana L., Bignon Y.J., Guy L., Bernard-Gallon D.J (2010), "Soy phytoestrogens modify DNA methylation of GSTP1, RASSF1A, EPH2 and BRCA1 promoter in prostate cancer cells", In Vivo 24(4), 393-400 129 Venderbos L.D and Roobol M.J (2011), "PSA-based prostate cancer screening: The role of active surveillance and informed and shared decision making", Asian Journal of Andrology 13, 219-24 130 Verma M and Patel P (2011), "Biomarkers in prostate cancer epidemiology", Cancers 3, 3773-98 131 Vo L.T., Thuan T.B., Thu D.M., Uyen N.Q., Ha N.T., To T.V (2013), "Methylation profile of BRCA1, RASSF1A and ER in Vietnamese women with ovarian cancer", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 14(12), 7713-8 132 Witsch E., Sela M., Yarden Y (2010), "Roles for growth factors in cancer progression", Physiology (Bethesda) 25(2), 85-101 133 Wooster R., Bignell G., Lancaster J., Swift S., Seal S., Mangion J., Collins N., Gregory S., Gumbs C., Micklem G (1995), "Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2", Nature 378(6559), 789-92 113 134 Wright W.E., Pereira-Smith O.M., Shay J.W (1989), "Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts", Molecular and Cellular Biology 9(7), 3088-92 135 Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R (1980), "Cell death: the significance of apoptosis", International Review of Cytology 68, 251-306 136 Xiong Z and Laird P.W (1997), "COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay", Nucleic Acids Research 25(12), 2532-4 137 Yegnasubramanian S., Kowalski J., Gonzalgo M.L., Zahurak M., Piantadosi S., Walsh P.C., Bova G.S., De Marzo A.M., Isaacs W.B., Nelson W.G (2004), "Hypermethylation of CpG islands in primary and metastatic human prostate cancer", Cancer Research 64(6), 1975-86 138 Yoon H.Y., Kim Y.W., Kang H.W., Kim W.T., Yun S.J., Lee S.C., Kim W.J., Kim Y.J (2012), "DNA methylation of GSTP1 in human prostate tissues: pyrosequencing analysis", Korean Journal of Urology 53(3), 200-5 139 Zhang Y., Bailey V., Puleo C.M., Easwaran H., Griffiths E., Herman J.G., Baylin S.B., Wang T.H (2009), "DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array", Lab Chip 9(8), 1059-64 Trang Web 140 http://www.benhvienk.com 141 http://www.cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman 142 http://www.epigenomics.com 143 http://www.mdxhealth.com/ 144 http://www.medcalc.org/manual/roc-curves.php 145 http://www.royalmarsden.nhs.uk/ 146 http://www.urogene.org 147 https://sg.idtdna.com/calc/dilution/ 148 https://www.promega.com 114 PHỤ LỤC Bảng 1.1 Danh sách bệnh nhân sản lành tính tuyến tiền liệt Ký hiệu STT SỐ GPB Họ tên Phân loại mô học TUỔI 61748 B1 NGUYỄN DANH T Quá sản lành tính 66 65399 B2 ĐẶNG CAO L Quá sản lành tính 67 66018 B3 NGUYỄN VĂN D Quá sản lành tính 67 58951 B4 NGUYỄN VĂN C Quá sản lành tính 74 70785 B5 TRỊNH L Quá sản lành tính 82 69405 B6 THIẾU VĂN TH Quá sản lành tính 68 65724 B7 NGUYỄN VĂN V Quá sản lành tính 65 68462 B8 NGUYỄN NGỌC KH Quá sản lành tính 81 75489 B9 ĐẶNG VĂN H Quá sản lành tính 68 10 60809 B10 ĐẶNG VĂN B Quá sản lành tính 72 11 73119 B11 NGUYỄN TRỌNG TH Quá sản lành tính 67 12 76399 B12 BÙI VĂN T Quá sản lành tính 68 13 74738 B13 NGUYỄN MAI L Quá sản lành tính 60 14 70437 B14 ĐINH NGUYÊN Đ Quá sản lành tính 74 15 75488 B15 NGUYỄN VĂN K Quá sản lành tính 63 16 64955 B16 TRỊNH TH Quá sản lành tính 76 17 65738 B17 CAO XUÂN TR Quá sản lành tính 80 18 65268 B18 NINH THẾ V Quá sản lành tính 65 19 65921 B19 NGUYỄN KỲ H Quá sản lành tính 72 20 61354 B20 LÊ MINH T Quá sản lành tính 71 21 68467 B21 NGUYỄN HUY CH Quá sản lành tính 76 22 70948 B22 NGUYỄN NGỌC H Quá sản lành tính 76 23 72995 B23 NGUYỄN VĂN TH Quá sản lành tính 63 24 76388 B24 PHẠM HÀ H Quá sản lành tính 86 25 70413 B25 NGUYỄN VĂN G Quá sản lành tính 72 26 69367 B26 NGUYỄN HỮU TH Quá sản lành tính 86 27 75325 B27 ĐINH QUANG TH Quá sản lành tính 90 28 74397 B28 NGUYỄN VĂN V Quá sản lành tính 71 29 N2476 B29 NGUYỄN TỨ C Quá sản lành tính 70 30 N2495 B30 NGUYỄN VĂN L Quá sản lành tính 65 31 N2596 B31 NGUYỄN VĂN M Quá sản lành tính 70 32 N2608 B32 TRẦN VĂN T Quá sản lành tính 74 33 N2613 B33 LÊ MẠNH PH Quá sản lành tính 42 34 N2666 B34 NGUYỄN DANH T Quá sản lành tính 79 35 N2670 B35 ĐẶNG CAO L Quá sản lành tính 64 36 N2713 B36 NGUYỄN VĂN D Quá sản lành tính 68 37 N2728 B37 NGUYỄN VĂN C Quá sản lành tính 74 Bảng 1.2 Danh sách bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt STT SỐ GPB Ký hiệu Họ tên Phân loại mô học TUỔI 23436 P1 TRẦN VĂN T carcinoma tuyến, độ 67 26463 P2 MA ĐÌNH T carcinoma tuyến, độ 71 47600 P3 LƢƠNG VĂN L carcinoma tuyến, độ 70 68164 P4 NGUYỄN TRUNG L carcinoma tuyến, độ 70 17478 P5 TRẦN VĂN T carcinoma tuyến, độ 76 54326 P6 NGUYỄN XUÂN Q carcinoma tuyến, độ 57 57004 P7 TRƢƠNG VĂN N carcinoma tuyến, độ 79 44466 P8 TRẦN ĐÌNH K carcinoma tuyến, độ 89 70947 P9 NGUYỄN VĂN N carcinoma tuyến, độ 76 10 59635 P10 NGUYỄN TRUNG KH carcinoma tuyến, độ 88 11 14672 P11 VŨ THIỆN KH carcinoma tuyến, độ 75 12 31254 P12 PHÙNG QUANG L carcinoma tuyến, độ 80 13 32097 P13 NGUYỄN VĂN NG carcinoma tuyến, độ 69 14 33818 P14 NGUYỄN ĐỨC L carcinoma tuyến, độ 68 15 47078 P15 NGUYỄN ĐỨC C carcinoma tuyến, độ 75 16 5231 P16 PHẠM GIA TH carcinoma tuyến, độ 64 17 30461 P17 ĐỖ VIẾT C carcinoma tuyến, độ 54 18 38380 P18 NGUYỄN TRỌNG L carcinoma tuyến, độ 78 19 43883 P19 ĐINH PHÚ Đ carcinoma tuyến, độ 91 20 68246 P20 PHẠM XUÂN P carcinoma tuyến, độ 44 21 68390 P21 ĐÁM ĐỨC T carcinoma tuyến, độ 67 22 26669 P22 ĐỖ VĂN Đ carcinoma tuyến, độ 76 23 25314 P23 NGUYỄN VĂN H carcinoma tuyến, độ 76 24 43724 P24 NGUYỄN CAO H carcinoma tuyến, độ 70 25 56026 P25 LÊ QUỐC V carcinoma tuyến, độ 50 26 56957 P26 ĐỖ VĂN KH carcinoma tuyến, độ 59 27 16275 P27 DƢƠNG CÔNG T carcinoma tuyến, độ 74 28 67385 P28 KIM VĂN NG carcinoma tuyến, độ 71 29 65131 P29 LÊ VĂN T carcinoma tuyến, độ 70 30 538 P30 TRẦN MINH N carcinoma tuyến, độ 77 31 24245 P31 NGUYỄN VĂN CH carcinoma tuyến, độ 66 32 62108 P32 LÊ KHẮC Đ carcinoma tuyến, độ 73 33 L4601 P33 PHẠM VĂN H carcinoma tuyến, độ 81 34 M1389 P34 NGÔ VĂN T carcinoma tuyến, độ 68 35 M2519 P35 NGUYỄN ĐĂNG Q carcinoma tuyến, độ 71 36 M3146 P36 TRẦN VĂN NGH carcinoma tuyến, độ 77 37 M3308 P37 NGUYỄN VĂN N carcinoma tuyến, độ 71 38 M3330 P38 VŨ BÁ M carcinoma tuyến, độ 70 39 M3932 P39 VŨ ĐÌNH D carcinoma tuyến, độ 90 40 M4309 P40 TRỊNH NGỌC T carcinoma tuyến, độ 80 41 M4834 P41 LÃ HỮU H carcinoma tuyến, độ 71 42 N26 P42 LÊ VĂN K carcinoma tuyến, độ 73 43 N503 P43 TRẦN VĂN T carcinoma tuyến, độ 82 44 N1822 P44 NGUYỄN VĂN Đ carcinoma tuyến, độ 70 45 1677 P45 TRẦN VĂN Q carcinoma tuyến, độ 70 46 3203 P46 NGUYỄN THANH H carcinoma tuyến, độ 70 47 5283 P47 TRẦN ĐỨC L carcinoma tuyến, độ 70 48 8215 P48 PHẠM XUÂN TH carcinoma tuyến, độ 71 49 93858 P49 TRƢƠNG HỒNG N carcinoma tuyến, độ 71 50 96327 P50 VŨ KHẮC P carcinoma tuyến, độ 82 51 N2073 P51 NGUYỄN VĂN K carcinoma tuyến, độ 65 52 7134 P52 NGUYỄN VĂN T carcinoma tuyến, độ 43 53 4302 P53 TẠ VĂN C carcinoma tuyến, độ 61 54 8391 P54 TRẦN THO K carcinoma tuyến, độ 70 55 2215 P55 NGUYỄN VĂN T carcinoma tuyến, độ 58 56 5438 P56 NGUYỄN TIẾN Đ carcinoma tuyến, độ 50 57 N4517 P57 PHẠM THÁI H carcinoma tuyến, độ 63 58 N1439 P58 ĐỖ TUẤN H carcinoma tuyến, độ 73 59 N3715 P59 NGÔ MẠNH H carcinoma tuyến, độ 62 PHỤ LỤC Kết tách chiết DNA tổng số mẫu nghiên cứu Hình 2.1 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi β-globin 96 mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt sản lành tính gel agarose 1,5% L : Thang chuẩn 100 bp (Fermentas) P1-P59: Mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt B1-B37: Mẫu sản lành tính (+): Đối chứng dƣơng ng (++): Đối chứng dƣơng 25 ng (-): Đối chứng âm khơng có khn DNA PHỤ LỤC Kết đánh giá hiệu xử lý bisulfite mẫu nghiên cứu Hình 3.1 Sản phẩm PCR với cặp mồi β-globin F/R kiểm tra chất lƣợng DNA không xử lý (KB) DNA xử lý (XL) gel agarose 1,5% L : Thang chuẩn 100 bp (Fermentas) P1-P59: Mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt B1-B37: Mẫu sản lành tính PC3: Dịng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt M: Mẫu máu ngƣời khỏe mạnh (-): Đối chứng âm khơng có khn DNA PHỤ LỤC Kết MS-PCR mẫu nghiên cứu Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm MS-PCR gen GSTP1 96 mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt sản lành tính gel acrylamide 8% L: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas) P1-P59: Mẫu ung thƣ tuyến tiền liệt B1-B37: Mẫu sản lành tính (-): Đối chứng âm khơng có khn DNA ... liệt; xác định đƣợc tỷ lệ methyl hóa promoter gen GSTP1 bệnh nhân ung thƣ tuyến tiền liệt sản lành tính chiếm 66,1 % 10,8 % Ngƣỡng phát methyl hóa promoter gen GSTP1 bệnh nhân sản lành tính ung. .. cáo 30 gen bị methyl hóa bất thƣờng ung thƣ tuyến tiền liệt, methyl hóa promoter gen GSTP1 phổ biến rộng rãi Methyl hóa GSTP1 đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều ung thƣ tuyến tiền liệt [9, 49, 63,... gen GSTP1 bệnh nhân sản lành tính ung thƣ tuyến tiền liệt, 2) Xác định mối liên quan methyl hóa promoter gen GSTP1 với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thƣ sản lành tính tuyến tiền liệt, 3) Phát triển