Khảo sát đột biến gen brca1 brca2 kiểu dòng tế bào mầm và tế bào sinh dưỡng germline and somatic mutation trong ung thư buồng trứng bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới next generation sequencing ngs

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm tế bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) ung thư buồng trứng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing-NGS) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS.TS.BS Hồng Anh Vũ TS Nguyễn Trọng Bình Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm tế bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) ung thư buồng trứng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing-NGS) (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 27/5/2020) Chủ nhiệm nhiệm vụ: Hoàng Anh Vũ Nguyễn Trọng Bình Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỒ HỒ CHÍ MINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TPHCM, ngày tháng năm 2020 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Khảo sát đột biến gen BRCA1/BRCA2 kiểu dòng tế bào mầm tế bào sinh dưỡng (germline and somatic mutation) ung thư buồng trứng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing-NGS) Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Y tế Chủ nhiệm nhiệm vụ: 2.1 Chủ nhiệm: Họ tên: HOÀNG ANH VŨ Ngày, tháng, năm sinh: 27/01/1973 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Phó giáo sư, Tiến sĩ Chức danh khoa học: Giảng viên cao cấp Chức vụ: Giám đốc Trung tâm Y sinh học phân tử Điện thoại: Tổ chức: 028 38558411; Mobile: 077-2993537 Fax: E-mail: hoanganhvu@ump.edu.vn Tên tổ chức công tác: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 217 Hồng Bàng, quận 5, TPHCM Địa nhà riêng: 1/94 Cư Xá Lữ Gia, P15, Q.11, TPHCM 2.2 Đồng chủ nhiệm: Họ tên: NGUYỄN TRỌNG BÌNH Ngày, tháng, năm sinh: 05/02/1982 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Chức vụ: Phó Trưởng phịng, phụ trách phịng Cơng nghệ Sinh học Động vật Điện thoại: Tổ chức: 08.37153792 Mobile: 0935255352 Fax: 08.38916997 E-mail: ntbinh.snn@tphcm.gov.vn Tên tổ chức công tác: Trung tâm Công nghệ Sinh học TPHCM Địa tổ chức: 2374 Quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12 Địa nhà riêng: 22/20/1 Đường 990, Phường Phú Hữu, Quận 9, TP.HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: 028 38558411 Fax: E-mail: yds@ump.edu.vn Website: yds.edu.vn Địa chỉ: 217 Hồng Bàng, quận 5, TPHCM Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS Trần Diệp Tuấn Số tài khoản: 3713.0.1057277.00000 Kho bạc: Kho bạc nhà nước Quận 5, Tp.HCM Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Công nghệ TPHCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 11/2017 đến 11/2019 - Thực tế thực hiện: từ tháng 11/2017 đến 05/2020 - Được gia hạn (nếu có): lần từ 12/2019 đến 05/2020 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 3.072 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 3.072 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 11/2017 1.530 Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 11/2017 1.530 9/2019 9/2019 Số TT 1.234,8 1.234,8 Ghi (Số đề nghị tốn) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Tiền công lao động trực tiếp (khoa học, phổ thông) Vật tư, nguyên, nhiên vật liệu Sửa chữa, thuê thiết bị, mua sắm tài sản Hội thảo khoa học, cơng tác phí Dịch vụ th ngồi, phục vụ nghiên cứu Điều tra khảo sát thu thập số liệu VPP, thông tin liên lạc, in ấn Chi Hội đồng tự ĐG KQ thực Chi quản lý nhiệm vụ KH&CN Chi khác liên quan hoạt động nghiên cứu Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH 229,13 75 Tổng NSKH 229,137 229,13 75 229,137 2.648, 317 2.648,3 17 2.646, 8367 2.646,8 367 0 74 74 74 74 0 7,4455 7,4455 7,4358 7,4358 13,1 13,1 10,850 10,850 100 100 100 100 0 3.068, 260 3.068,2 60 3.072 Nguồn khác Thực tế đạt 3.072 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Theo kế hoạch Tổng NSKH Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Ngun vật liệu, lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn 1150/QĐ-SKHCN, 23/11/2017 Quyết định việc phê duyệt nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ 247/ĐHYD-HĐĐĐ, 31/7/2017 Chấp thuận hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 223/2017/HĐSKHCN, 23/11/2017 Hợp đồng thực nhiệm vụ khoa học công nghệ 151/QĐ-BVTD, 10/01/2018 Quyết định việc đồng ý cho phép tiến hành thu nhận số liệu nghiên cứu Bệnh viện Từ Dũ 49/HĐ-ĐHYD, 16/01/2018 Hợp đồng nghiên cứu khoa học 50/HĐ-ĐHYD, 16/01/2018 Hợp đồng giao khốn chun mơn 725/TTr-ĐHYD, Tờ trình phê duyệt kế hoạch lựa chọn nhà thầu gói thầu phục Ghi 14/6/2018 vụ nhiệm vụ khoa học công nghệ 2610/SKHCNQLKH, 14/11/2018 Công văn việc chấp thuận việc thay đổi chủ nhiệm đề tài PGS.TS Hoàng Anh Vũ thay cho TS Nguyễn Duy Sinh 49/PLHĐ-ĐHYD, 20/11/2018 Phụ lục hợp đồng nghiên cứu khoa học 10 630/QĐ-SKHCN, 29/6/2018 Quyết định việc phê duyệt kế hoạch lựa chọn nhà thầu nhiệm vụ nghiên cứu khoa học 11 5435/QĐ-ĐHYD, 04/12/2018 Quyết định việc phê duyệt kết lựa chọn nhà thầu nhiệm vụ nghiên cứu khoa học theo hình thức chào hàng cạnh tranh 12 560/ĐHYD-SHPT, 09/5/2019 Công văn việc xin bổ sung cán thực nhiệm vụ khoa học công nghệ 13 27/2019/PLHĐSKHCN, 22/8/2019 Phụ lục hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Trung tâm Công nghệ sinh học TPHCM Tên tổ chức tham gia thực Trung tâm Công nghệ sinh học TPHCM Nội dung tham gia chủ yếu Giải trình tự mẫu hệ thống Ion Torrent PGM Sản phẩm chủ yếu đạt Quy trình giải trình tự gen hệ cho gen BRCA1/2 Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* Nguyễn Duy Sinh Hoàng Anh Vũ Điều hành chung; phân tích liệu NGS; xác nhận lại đột biến BRCA/2 Sanger; viết báo khoa học; viết báo cáo tổng kết đề tài Thay chủ nhiệm đề tài Nguyễn Duy Sinh chuyển công tác Nguyễn Trọng Bình Nguyễn Trọng Bình Hồn thiện đề cương nghiên cứu; xây dựng quy trình NGS Ion Torrent PGM; hướng dẫn học viên cao học; viết báo khoa học; viết báo cáo tổng kết đề tài Hồng Thành Chí Hồng Thành Chí Lê Quang Thanh Lê Quang Thanh Bùi Thị Hồng Nhu Bùi Thị Hồng Nhu Tham gia viết đề cương; xây dựng quy trình chạy mẫu nghiên cứu hệ thống Ion Torrent PGM Tham gia viết đề cương; chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu Soạn mẫu giấy đồng ý tham gia nghiên cứu; tư vấn chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu Hoàn thành nghiên cứu thời hạn; đăng báo khoa học nước; hoàn thành 01 thảo báo quốc tế; hoàn thành báo cáo tổng hợp, phụ lục sản phẩm tóm tắt Đề cương phê duyệt ; sản phẩm quy trình hồn chỉnh hệ thống Ion Torrent PGM; đăng báo khoa học nước; tham gia hoàn thành báo cáo tổng hợp phụ lục sản phẩm Viết tổng quan phương pháp nghiên cứu; viêt phần kết phân tích NGS Quy định tiêu chuẩn chọn mẫu; chọn đủ mẫu cho nghiên cứu Chọn đủ mẫu cho nghiên cứu Võ Thanh Nhân Võ Thanh Nhân Soạn mẫu giấy đồng ý tham gia nghiên cứu; tư vấn chọn mẫu ung thư buồng trứng cho nghiên cứu Chọn đủ mẫu cho nghiên cứu - Lý thay đổi ( có): Do Nguyễn Duy Sinh chuyển cơng tác từ Đại học Y Dược TPHCM qua Bệnh viện Quốc tế VinMec khơng cịn tham gia nghiên cứu, chủ nhiệm đề tài thay Hồng Anh Vũ Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, (Nội dung, thời gian, TT địa điểm ) kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, cơng việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế đạt hoạch Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh kiểm chứng Bác sĩ giải phẫu bệnh độc lập (20% tổng số mẫu) 11/2017 – 8/2018 1/2019 – 3/2020 Nội dung 2: Thu nhận DNA 3/2018 – 12/2018 1/2019 – 3/2020 Người, quan thực Hoàng Anh Vũ, Lê Quang Thanh, Bùi Thị Hồng Nhu, Võ Thanh Nhân Hoàng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình, Hồng Nội dung 3: Tạo thư viện DNA 5/2018 – 2/2019 2/2019 – 4/2020 5/2018 – 2/2019 2/2019 – 4/2020 5/2018 – 2/2019 2/2019 – 4/2020 Nội dung 6: Phân tích liệu 3/2019 – 7/2019 3/2019 – 4/2020 Nội dung 7: Giải trình tự Sanger 7/2019 – 9/2019 4/2019 – 4/2020 7/2019 – 9/2019 12/2019 – 4/2020 10/2019 – 11/2019 3/2020 – 4/2020 Nội dung 4: Tạo DNA khuôn mẫu phản ứng PCR nhũ tương Nội dung 5: Giải trình tự Ion Torrent PGM Nội dung 8: Gửi 20% số mẫu dương tính để ngoại kiểm công ty Amgen (Hoa Kỳ) Nội dung 9: Xử lý số liệu viết báo cáo nghiệm thu đề tài Thành Chí Nguyễn Trọng Bình, Hồng Thành Chí Nguyễn Trọng Bình, Hồng Thành Chí Nguyễn Trọng Bình, Hồng Thành Chí Hồng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình, Hồng Thành Chí Hồng Anh Vũ, Hồng Thành Chí Hồng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình Hồng Anh Vũ, Nguyễn Trọng Bình, - Lý thay đổi (nếu có): Giai đoạn hoạt động nghiên cứu vị chậm trễ chủ nhiệm đề tài Nguyễn Duy Sinh chuyển công tác khỏi Đại học Y Dược TPHCM Đề tài chuyển chủ nhiệm cho Hoàng Anh Vũ gia hạn tháng sau giám định kỳ (đến tháng 5/2020) III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Đơn vị đo Số lượng Theo kế hoạch Thực tế đạt - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Qui trình chẩn đốn đột biến u cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt Độ nhạy độ Quy trình phát Ghi Quy trình HƯỚNG DẪN TẠO THƯ VIỆN DNA A Nguyên tắc: Để tạo thư viện DNA (BRCA1 BRCA2) cho giải trình tự khuếch đại với primer chuyên biệt kỹ thuật multiplex PCR, sản phẩm PCR gắn với trình tự Ion P1 Adapter gắn trình tự nhận biết barcode (nếu số lượng mẫu) Sản phẩm sau gắn khuếch đại tinh hạt bead AMPure™ XP Reagent B Vật liệu: - Oncomine™ BRCA Pool (blue cap) 48 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - Oncomine™ BRCA Pool (red cap) 48 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - 5X Ion AmpliSeq™ HiFi Mix (red cap) 120 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - FuPa Reagent (brown cap) 48 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - Switch Solution (yellow cap) 96 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - DNA Ligase (blue cap) 48 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - 25X Library Amp Primers[1] (pink cap) 48 μl, dự trữ từ –30oC đến –10oC - 1X Library Amp Mix (black cap) 1.2 ml, dự trữ từ –30oC đến –10oC - Low TE (clear cap), dự trữ từ 10oC-30oC - AMPure™ XP Reagent, dự trữ từ 4oC - Qubit™ dsDNA HS Assay Kit, dự trữ từ 4oC - Ống tuýp 1.5 ml lobind, pipette 10, 100, 1000 µl, đầu típ retention, DynaMag™ Magnet, giá để tuýp 1,5 ml, 0,2 ml, Ống đo cho máy Qubit - Máy PCR, máy Quibit, votex, spin down, C Phương pháp: Hút µl nước khơng chứa nuclease vào tuýp 0,2 ml (đánh dấu pool 1), tuýp 0,2 ml (đánh dấu pool 2) Cho thêm µl dung dịch 5X Ion AmpliSeq™ HiFi Mix (red cap) vào pool Cho thêm µl dung dịch DNA gen (5 ng/ µl) vào pool 17/27 Cho thêm µl dung dịch Oncomine™ BRCA Pool (blue cap) vào tuýp 0,2 ml (đánh dấu pool 1), cho thêm µl dung dịch Oncomine™ BRCA Pool (red cap) vào tuýp 0,2 ml (đánh dấu pool 2) Trộn pipetting spin down PCR với chu trình nhiệt: 99 oC cho phút (1 chu kỳ), biến tính 99 oC cho 15 giây, bắt cặp kéo dài 60 oC cho phút (18 chu kỳ mẫu DNA FFPE), (21 chu kỳ mẫu DNA FFPE) Chú ý: Sản phẩm khuếch đại dự trữ 10°C qua đêm (12−16 giờ), dự trữ – 20°C thời gian dài Spin down sản phẩm PCR Chuyển sản phẩm PCR pool pool thành ống tuýp 0,2 ml (tổng thể tích 20 µl) Thêm µl dung dịch FuPa Reagent (brown cap) (dung tích phản ứng 22 µl) Trộn pipetting spin down 10 Ủ máy PCR với chu trình nhiệt: 50°C cho 10 phút, 55°C cho 10 phút, 60°C cho 20 phút, giữ 10°C 11 Spin down 12 Trộn chậm lần pipetting 13 Thêm µl dung dịch Switch Solution (yellow cap) 14 Thêm µl dung dịch hỗn hợp Ion Xpress™ Barcode Adaptor/P1 Adaptor mix (hỗn hợp gồm: µl nước khơng chứa nuclease, µl Ion P1 Adapter µl Ion Xpress™ Barcode X ) 15 Thêm µl dung dịch DNA Ligase (blue cap) Chú ý: Tổng thể tích 30 µl 16 Trộn spin down 17 Ủ máy PCR: 22°C cho 30 phút, 68°C cho phút, 72°C cho phút, giữ 10°C 24 Chú ý: Các mẫu dự trữ ở –20°C 18/27 18 Spin down 19 Cho 45 µl (1,5X thể tích mẫu) AMPure™ XP Reagent đến tuýp 1,5 ml 20 Chuyển toàn thể tích thư viện (30 µl) vào 1,5 ml có chứa AMPure™ XP Reagent 21 Trộn pipetting lần 22 Ủ dung dịch trộn phút nhiệt độ phòng 23 Đặt ống tuýp 1,5 ml chứa dung dịch trộn lên DynaMag™ Magnet 24 Ủ nhiệt độ phòng phút dung dịch suốt 25 Loại bỏ dịch 26 Thêm 200 µl dung dịch ethanol 70-75% tiến hành xoay ống tuýp 1,5 ml chứa pellet 27 Loại bỏ dịch 28 Lập lại bước 26-27 29 Loại bỏ dịch đảm bảo khơng có giọt ethanol cịn 1,5 ml 30 Để khơ hạt bead khơng khí nhiệt độ phịng khoảng 2-5 phút Tránh để q khơ 31 Cho 52 µl dung dịch khuếch đại thư viện gồm 50 µl 1X Library Amp Mix (black cap) µl 25X Library Amp Primers (pink cap) đến tuýp 1,5 ml chứa hạt bead 32 Trộn máy vortexer spin down 33 Đặt tuýp 1,5 ml chứa hạt bead lên DynaMag™ Magnet 34 Ủ phút nhiệt độ phịng 35 Thu 50 µl dung dịch cho vào tuýp 0,2 ml 36 Ủ máy PCR với chu trình nhiệt: 98°C cho phút (1 chu kỳ), 98°C cho 15 giây, 64°C cho phút (5 chu kỳ), giữ 10°C Chú ý: Mẫu dự trữ –20°C 37 Spin down 19/27 38 Cho 25 µl (0,5X thể tích mẫu) Agencourt™ AMPure™ XP Reagent vào tuýp 1,5 ml 39 Chuyển 50 µl dung dịch sau ủ vào tuýp 1,5 ml chứa Agencourt™ AMPure™ XP Reagent 40 Trộn pipetting lần 41 Ủ dung dịch trộn phút nhiệt độ phòng 42 Đặt ống tuýp 1,5 ml chứa dung dịch trộn lên DynaMag™ Magnet 43 Ủ phút nhiệt độ phịng dung dịch suốt 44 Thu dịch 45 Thêm 60 μl (1.2X thể tích mẫu ban đầu) Agencourt™ AMPure™ XP Reagent 46 Trộn pipetting lần 47 Ủ dung dịch trộn phút nhiệt độ phòng 48 Đặt ống tuýp 1,5 ml chứa dung dịch trộn lên DynaMag™ Magnet 49 Ủ phút nhiệt độ phòng dung dịch suốt 50 Loại bỏ dịch 51 Thêm 200 µl dung dịch ethanol 70-75% tiến hành xoay ống tuýp 1,5 ml chứa pellet 52 Loại bỏ dịch 53 Lập lại bước 51-52 54 Loại bỏ dịch đảm bảo khơng có giọt ethanol cịn 1,5 ml 55 Để khơ hạt bead khơng khí nhiệt độ phịng khoảng 2-5 phút Tránh để khô 56 Lấy 1,5 ml chứa hạt bead khỏi từ DynaMag™ Magnet 57 Thêm 50 μL nước không chứa nuclease Low TE vào hạt bead 58 Trộn vortexer spin down 59 Ủ nhiệt độ phịng phút 60 Đặt ống tuýp 1,5 ml chứa dung dịch lên DynaMag™ Magnet 20/27 61 Ủ nhiệt độ phịng phút dung dịch 62 Thu tất phần dịch , đo nồng độ thư viện Quibit fluorometer 21/27 HƯỚNG DẪN TẠO HẠT ISP-DNA VÀ GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG PGM D Nguyên tắc: DNA thư viện gắn lên hạt ISP nhờ trình tự DNA có chứa adaptor Hỗn hợp thực PCR nhũ tương để tăng số lượng ISP-DNA Sau hạt ISP –DNA tinh giải trình tự hệ thống PGM E Vật liệu: - Ion PGM™ Hi-Q™ View Reagent Mix - Ion PGM™ Hi-Q™View Enzyme Mix - Ion PGM™ Hi-Q™View ISPs - Library concentration (100 pM) - Nuclease free Water - Ion OneTouch™ Reaction Oil - Ion OneTouch™ Breaking Solution - Ion OneTouch™ Reaction Filter - Ion PGM™ OT2 Recovery Solution - Ion OneTouch™ Wash Solution - 8-well strip Ion OneTouch™ ES Supplies Kit - Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 Beads - dNTP - Ion PGM Hi-Q View Sequencing polymerase - Ống tuýp 1.5ml lobind, pipette 10, 100, 1000 µL, đầu típ retention, DynaMag™ Magnet, giá để tuýp 1,5 ml, 0,2 ml, Ống đo cho máy Qubit, real time PCR - Máy Ion OneTouch™ Instrument, Ion OneTouch™ Instrument, votex, spin down F Phương pháp: 22/27 Chuẩn bị thành phần - Ion PGM™ Hi-Q™ View Reagent Mix để nhiệt độ phòng, trộn dung dịch vortexer 30 giây spin down, giữ dung dịch nhiệt độ phịng suốt q trình dùng, dự trữ 4oC thành phần rã đông mà không dùng - Ion PGM™ Hi-Q™ View Enzyme Mix: spin down đặt đá - Ion PGM™ Hi-Q™ View ISPs: đặt dung dịch nhiệt độ phòng Pha lỗng thư viện sử dụng vịng 48 - Cho 23 µl nước khơng chứa nuclease, µl Ion AmpliSeq™DNA Library (100 pM) vào ống tuýp 1,5 ml Trộn vortexer, spin down đặt đá Chuẩn bị Ion PGM™ Hi-Q™ View ISPs - Trộn ISPs vortexer với tốc độ tối đa - Spin down ISPs - Trộn ISPs pipetting - Thực bước Thêm 25 µl nước khơng chứa nuclease, 50 μl Ion PGM™ Hi-Q™ View Enzyme Mix (Brown), 25 μl thư viện pha loãng, 100 μl Ion PGM™ Hi-Q™ View ISPs (Black) vào ống tuýp 2-ml (violet cap) chứa 800 µl Ion PGM™ HiQ™ View Reagent Mix Trộn pipetting Trộn dung dịch khuếch đại vortexer với tốc độ tối đa giây Tiến hành lắp ráp cài đặt màng lọc Ion OneTouch™ Reaction Filter Hút 1000 µl dung dịch khuếch đại cho vào lỗ đưa mẫu màng lọc Ion OneTouch™ Reaction Filter Hút 850 µl Ion OneTouch™ Reaction Oil (25-mL size) cho vào lỗ đưa mẫu Thay đổi đầu típ thêm 850 µl Ion OneTouch™ Reaction Oil cho vào lỗ đưa mẫu 23/27 10 Đảo ngược sau cài đặt lắp Ion OneTouch™ Reaction Filter vào lỗ thiết bị Ion OneTouch™ 11 Bấm Next để bắt đầu chạy 12 Chú ý: Thêm 150 µl dung dịch phá vỡ Ion OneTouch™ Breaking Solution đến tuýp thu nhận lại (recovery tube) trước bắt đầu chạy Trên màng hình chọn Yes để chạy 13 Loại bỏ mẫu ≤ 16 sau bắt đầu chạy, chọn proceed để tiến hành thu nhận lại ISPs dương tính với DNA khn mẫu 14 Kết thúc chạy mẫu, theo dẫn màng hình để ly tâm mẫu 15 Lấy tuýp Ion OneTouch™ Recovery từ thiết bị đặt tuýp rack tube 16 Loại bỏ tất 100 µl Ion PGM™ OT2 Recovery Solution từ tuýp thu hồi 17 Thêm 500 µl Ion OneTouch™ Wash Solution vào tuýp thu hồi 18 Trộn ISPs pipetting chuyển toàn thành phần ống tuýp thu hồi thành ống tuýp 1,5 ml lobind 19 Li tâm ISPs 15,500 x g 2,5 phút 20 Dùng pipette hút tất để lại 100 µl Wash Solution từ tuýp 21 Hút phần từ bề mặt phía đối diện với pellet 22 Dùng strip gồm có giếng (8-well strip) Ion OneTouch™ ES Supplies Kit, đảm bảo tab hình vng (square-shaped tab) phía bên trái 23 Trộn ISPs pipetting 10 lần, sau chuyển vào giếng 8-well strip 24 Giữ lại 1-2 µl Ion PGM™ Hi-Q™ View OT2 Kit chưa làm giàu từ giếng cho việc đánh giá chất lượng 25 Chuẩn bị thành phần, sau cho vào 8-well strip - Chuẩn bị tuýp chứa 320 μl dung dịch làm tách DNA (Melt-Off Solution) gồm 280 μl Tween™ Solution 40 μl M NaOH (cho 300 μl vào giếng 8-well strip) 24/27 26 Trộn hạt bead Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 Beads vortexer 30 giây spin down 27 Sử dụng đầu típ để pipetting hạt bead phân tán Ngay thực bước 28 Chuyển 13 μl hạt bead Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 Beads đến tuýp 1.5-mL Eppendorf LoBind™ 29 Đặt tuýp lên DynaMag™-2 magnet phút, cẩn thận loại bỏ dịch mà không làm vỡ pellet Dynabeads™MyOne™ Streptavidin C1 Beads 30 Thêm 130 μl dịch rữa MyOne™ Beads Wash Solution vào tuýp chứa Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 Beads (cho vào giếng 8-well strip ) 31 Loại bỏ tuýp từ DynaMag™-2 magnet, trộn dung dịch vortexer 30 giây spin down - Giếng 1: Toàn mẫu có ISP dương tính với DNA mẫu (100 µl) - Giếng 2: 130 µl Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1 Beads rửa - Giếng 3: 300 µl OneTouch™ Wash Solution (W) - Giếng 4: 300 µl OneTouch™ Wash Solution (W) - Giếng 5: 300 µl OneTouch™ Wash Solution (W) - Giếng 6: Trống (không cho vào) - Giếng 7: 300 µl dung dịch Melt-Off Solution - Giếng 8: Trống (không cho vào) 32 Lắp 8-well strip vào Ion OneTouch™ ES Instrument đẩy vị trí phía bên phải 33 Thực chạy để thu ISP-DNA 34 Trộn hạt ISP mẫu chứng (Control Ion Sphere Particle) vortexer, sau spin down 25/27 35 Thêm µl ISP mẫu chứng trực tiếp vào thể tích tổng ISP-dương tính-mẫu-được làm giàu ống PCR 0,2 ml 36 Trộn hỗn hợp pipetting 37 Ly tâm 15,500 xg phút 38 Loại bỏ dịch, để lại khoảng 15 µl ống (so sách với ống chứng chuẩn bị sẵn) - Đảm bảo primer giải trình tự tan hồn tồn trước sử dụng - Thêm 12 µl primer vào ống chứa ISP, sau xác nhận thể tích tổng 27 µl (thêm buffer gắn primer cần) 39 Trộn hỗn hợp pipetting 40 Đặt vào máy luân nhiệt thermal cycler, sau chạy chương trình 95oC phút sau 37oC phút, sử dụng chương trình nắp đun nóng Sau chạy luân nhiệt xong, mẫu để máy luân nhiệt nhiệt độ phòng (20-30oC) cài đặt máy giải trình tự 41 Đưa enzyme Ion PGM Hi-Q View Sequencing polymerase khỏi nơi lưu trữ, trộn cách vỗ đầu ngón tay vào đáy thành ống lần Spin down, đặt lên đá 42 Sau bước gắn primer giải trình tự, lấy ISP khỏi may luân nhiệt, sau thêm µl enzyme Ion PGM Hi-Q View Sequencing polymerase vào ISPs, cho thể tích cuối 30 µl 43 Trộn mẫu pipetting, sau ủ nhiệt độ phòng phút 44 Đặt chip vào khay bề mặt phẳng vững chãi Sau ủ với enzyme polymerase, hút lấy ~30 µl thể tích ISP chuẩn bị bước 45 Đặt đầu tip khít vào cổng đưa mẫu vào chip 46 Với pipette chưa khóa, áp lên lực nhẹ tip chip chầm chậm vặn giảm thể tích pipettor xuống (sao cho xấp xỉ 1µl giây) để chuyển dần dung dịch từ đầu tip vào chip Tránh đưa bong bóng vào chip, để lượng nhỏ lại đầu tip pipette (~0,5 µl) 26/27 47 Rút ra, sau loại bỏ dịch lỏng xuất phía bên cổng lại 48 Chuyển chip khay đến máy ly tâm với phần rìa chíp hướng vào (vào trung tâm máy ly tâm), sau ly tâm 30 giây 49 Xoay chip lại cho phần rìa quay ngồi (hướng ngồi trung tâm máy), sau ly tâm 30 giây 50 Đưa khay chứa chip khỏi máy li tâm sau đặt lên bề mặt phẳng Điểu chỉnh thể tích pipettor 25µl 51 Nghiên chip góc 45o cho cổng vào mẫu nằm phía dưới, phía thấp so với cổng cịn lại, sau chèn đầu tip đến cổng vào mẫu 52 Giữ im trạng thái, chầm chậm hút mẫu sau đưa mẫu vào lại chip lần 53 Nhẹ nhàng rút dịch lỏng từ chip nhiều cách quay số giảm thể tích pipette Loại bỏ dịch lỏng 54 Lật úp chip xuống khay-đựng-chip, đưa lại máy ly tâm, sau ly tâm trạng thái lật úp giây Lấy lau dịch lỏng bắn 55 Nếu dịch lỏng chip, gõ nhẹ nhanh phía rìa nhơ chip xuống bàn vài lần, sau loại bỏ giọt dung dịch văng 56 Khi việc đưa mẫu hồn thành, nhấn “next” hình cảm ứng 57 Giải trình tự theo chương trình máy có sẵn 27/27