Đồ án tốt nghiệp khảo sát đột biến gen ret trên ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tà KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RET TRÊN CA LÂM SÀNG iệ il U SẮC BÀO TUYẾN THƯỢNG THẬN u MANG TÍNH GIA ĐÌNH CH TE U H Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS.BS Đỗ Đức Minh Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Mỹ Hiền MSSV: 1515100017 Lớp: 15HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan nội dung trình bày đồ án tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát đột biến gen RET ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” thành nghiên cứu sở số liệu thực tế thực hướng dẫn trực tiếp giáo viên hướng dẫn Mọi tham khảo đồ án trích dẫn rõ ràng nguồn gốc Mọi chép vi phạm quy chế nhà trường em xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Tà u iệ il Nguyễn Thị Mỹ Hiền CH TE U H LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Cơng nghệ Tp.HCM tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức, lòng nhiệt huyết niềm đam mê nghiên cứu cho em suốt thời gian học tập trường Em xin gửi lời cảm ơn đến TS.BS Đỗ Đức Minh, người thầy, người anh tận tình hướng dẫn em thông tin lâm sàng, kiến thức sinh học phân tử suốt thời gian làm đồ án Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến anh chị Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược Tp HCM quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Thời gian học hỏi làm việc môi trường Tà thân thiện, nhận giúp đỡ góp ý nhiệt tình anh chị Trung iệ il tâm khoảng thời gian quý báu, mang lại cho em thêm nhiều kiến thức kinh u nghiệm trình làm việc H Và hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới gia đình Cảm ơn dõi theo bước đường CH TE U cha, mẹ sinh thành, nuôi dưỡng khôn lớn, bên cạnh động viên, ủng hộ, Tp.Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 07 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mỹ Hiền Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 U sắc bào tuyến thượng thận Giới thiệu 1.1.2 Nguyên nhân 1.1.3 Biểu 1.1.4 Xét nghiệm chẩn đoán 1.1.5 Điều trị Tà 1.1.1 Bất thường di truyền 1.3 Các bệnh hội chứng liên quan il 1.2 iệ 1.3.3 Hội chứng MEN CH TE Hội chứng VHL U 1.3.2 H Hội chứng NF1 u 1.3.1 8 1.4 Cấu trúc, đột biến, chức gen RET 10 1.5 Các phương pháp giải trình tự 13 1.5.1 Phương pháp hóa học 13 1.5.2 Phương pháp enzyme 13 1.5.3 Giải trình tự máy tự động (automated sequencer) 14 1.5.4 Kỹ thuật giải trình tự hệ mới-454 Pyrosequencing 15 1.6 Cơ sở liệu phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 1.6.1 Cơ sở liệu 16 1.6.2 Phần mềm phân tích trình tự nucleotide 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thiết kế nghiên cứu 17 2.2 Đối tượng nghiên cứu 17 i Đồ án tốt nghiệp 2.3 Vật liệu 19 2.3.1 Dụng cụ thiết bị 19 2.3.2 Hóa chất 20 2.4 Sơ đồ quy trình thực 23 2.5 Thuyết minh quy trình 24 2.5.1 Quy trình tách chiết DNA 24 2.5.1.1 Nguyên tắc: 24 2.5.1.2 Các bước thực hiện: 24 Quy trình PCR gen RET 25 2.5.2 2.5.2.1 Nguyên tắc: 25 2.5.2.2 Các bước thực hiện: 27 Điện di sản phẩm PCR Tà 2.5.3 2.5.3.1 Nguyên tắc: 2.5.3.2 Các bước thực hiện: 27 iệ il 2.5.4.2 Các bước thực hiện: CH TE Nguyên tắc: U H Quy trình tinh sản phẩm PCR 2.5.4.1 2.5.5 29 u 2.5.4 27 Quy trình cycle sequencing 30 30 30 31 2.5.5.1 Mục đích: 2.5.5.2 Các bước thực hiện: 31 Quy trình tủa sản phẩm cycle 32 2.5.6 31 2.5.6.1 Nguyên tắc: 32 2.5.6.2 Các bước thực hiện: 32 2.5.7 Giải trình tự máy ABI 3500 33 2.5.7.1 Nguyên tắc: 33 2.5.7.2 Đọc trình tự chuỗi DNA: 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1 Kết quả, bàn luận tách chiết 35 3.2 Kết quả, bàn luận PCR với cặp mồi đặc hiệu 35 ii Đồ án tốt nghiệp 3.3 Kết quả, bàn luận tinh sản phẩm PCR 37 3.4 Phản ứng cycle sequencing đọc kết giải trình tự 38 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC u iệ il Tà CH TE U H iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Amino acid Bp Base pair CATE Catecholamines CT Computed tomography DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate GDNF Glial cell line Derived Neurotrophic Factor GFLs Family Ligands MEN2 Đa u tuyến nội tiết loại MRI Chụp cộng hưởng từ (Magnetic resonance imaging) NCBI National Center For Biotechnology Information NF1 Neurofibromatosis loại PCCs Pheochromocytomas PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen invitro) PGLs Paragangliomas PPGLs Pheochromocytomas Paragangliomas RNA Ribonucleic acid SNP Điểm đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphisms) VHL Hội chứng Von Hippel-Lindau u iệ il Tà Aa CH TE U H iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Trình tự mồi xi mồi ngược dùng cho phản ứng PCR 21 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 2.3: Các thông số điê ̣n di DNA bằ ng gel agarose 28 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cycle sequencing 32 Bảng 2.5: Thành phần hỗn hợp tủa DNA 33 Bảng 3.1: Kết đo nồng độ nucleic acid mẫu 35 Bảng 4.1: Kết giải trình tự phát SNP exon 11, 13 [1] 44 u iệ il Tà CH TE U H v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mơ tả cách tiếp cận xét nghiệm gen theo hướng dẫn Hội Nội tiết .5 Hình 1.2: Bé trai tuổi có biểu điểm hạt cà phê tàn nhang Hình 1.3: Vị trí gen RET nhiễm sắc thể số 10 10 Hình 1.4: Cơ chế phân tử đột biến gen RET .12 Hình 1.5: Hình kí xạ tự ghi kết giải trình tự DNA gel polyacrylamide 14 Hình 1.6: Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự dùng gel polyarylamide 15 Hình 2.1: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân .18 Hình 2.2: Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase .26 Hình 2.3: Các chu kỳ PCR 26 Tà Hình 2.4: Mơ tả trình tinh sản phẩm PCR 30 iệ il Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm exon 10, 11,13, 14 - 15,16 36 Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn 39 u H Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn 39 TE U Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn 40 Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn 40 CH Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn 41 Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn 41 Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn 42 Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn 42 Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn .43 Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn .43 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU U sắc bào tuyến thượng thận (PPGLs) bệnh nội tiết Việt Nam Tìm hiểu bệnh giúp có biện pháp phịng ngừa, giảm nguy mắc bệnh kịp thời thăm khám gặp triệu chứng bất thường Paragangliomas (PGLs) khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh nằm hạch thần kinh giao cảm phó giao cảm khắp thể, khối u nằm tủy thượng thận gọi pheochromocytomas (PCCs), với triệu chứng lâm sàng đánh trống ngực, nhức đầu nhiều mồ hôi, kèm theo tăng huyết áp, tiết chất catecholamines (CATE) [9] Theo dõi lâm sàng điều cần thiết để chẩn đoán điều trị PPGLs, hầu hết khối u tiết CATE khơng điều trị tỷ lệ tử vong tim mạch di sang mô, quan lân cận cao Việc xác Tà định bất thường di truyền quan trọng 1/3 bệnh nhân bị PPGLs có đột iệ il biến dòng mầm gây bệnh số 14 gen gây bệnh gồm: NF1, RET, VHL, u SDHD, SDHC, SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2, IDH1, TMEM127, H SDHA, MAX HIF2A [5,9,11] Theo hướng dẫn thực hành Hội Nội tiết lâm TE U sàng, bệnh nhân PPGLs cần thăm khám kiểm tra di truyền cho người thân để sàng lọc di truyền gây bệnh Xuất phát từ thực tiễn nhóm tiến hành đề tài CH “Khảo sát đột biến gen RET ca lâm sàng u sắc bào tuyến thượng thận mang tính gia đình” cách sử dụng phương pháp mơ tả hàng loạt ca, với mục tiêu cụ thể: - Giải trình tự exon gen RET (exon 10,11,13,14,15,16) - Phân tích kết giải trình tự gen dựa liệu ngân hàng gen National Center For Biotechnology Information (NCBI) Đồ án tốt nghiệp gồm có chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Đối tượng – Vật liệu – Phương pháp Chương 3: Kết – Bàn luận Chương 4: Kết luận – Kiến nghị Đồ án tốt nghiệp nhiệt độ bắt cặp · Mồi xuôi, mồi ngược thiết kế trước sau exon cần khuếch đại 100bp Kết khuếch đại exon (10, 11, 13, 14 - 15, 16) phản ứng PCR với cặp mồi phát nhờ điện di DNA gel agarose 2% với thang chuẩn 1kp plus 10 L 948 bp 699 bp 1000 bp 700bp 452bp 420 bp 324bp 400 bp 300bp iệ il Tà 75 bp Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm exon 10, 11,13, 14 - 15,16 u H Chú thích : TE U Giếng 1: Sản phẩm PCR exon 10 với mồi 10F/R Giếng 3: Sản phẩm PCR exon 11 với mồi 11F/R CH Giếng 5: Sản phẩm PCR exon 13 với mồi 13F/R Giếng 7: Sản phẩm PCR exon 14 - 15 với mồi 14F/15R Giếng 9: Sản phẩm PCR exon 16 với mồi 16F/R Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Chứng âm nước L: Thang chuẩn kb plus Theo kết điện di hình 3.1: Giếng 1: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 400 500 Kích thước cho thấy phù hợp với lý thuyết đoạn chứa exon 10 452 bp Giếng 3: Sản phẩm PCR có kích thước gần vạch 700 Kích thước cho thấy phù hợp với lý thuyết đoạn chứa exon 11 699 bp Giếng 5: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 400 450 Kích thước cho thấy phù hợp với lý thuyết đoạn chứa exon 13 420 bp 36 Đồ án tốt nghiệp Giếng 7: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 900 1000 Kích thước cho thấy phù hợp với lý thuyết đoạn chứa exon 14 15 948 bp Giếng 9: Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 300 400 Kích thước cho thấy phù hợp với lý thuyết đoạn chứa exon 16 324 bp Tất phản ứng có băng rõ nét khơng có băng phụ khác Mẫu chứng âm: khơng nhiễm (khơng xuất vạch), cho thấy sinh phẩm hóa chất sử dụng cho phản ứng không bị nhiễm DNA lạ Như vậy, phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại exon gen RET thực cho kết tốt Hiện nay, enzyme polymerase sử dụng cho phản ứng PCR có nhiều loại với hiệu cao như: Takara TaqTM Hot Start Polymerase (Takara Bio), iTaq DNA Tà polymarase (Bio-Rad), FastStart Taq polymerase (Roche), Go Taq® Flexi DNA iệ il polymerase (Applied Biosystems)… Trong luận này, chọn Takara TaqTM Hot Start polymarase để khuếch đại gen u H RET với exon Enzyme có hoạt tính 5’ - 3’ exonuclease, 5’ - 3’ polymerase TE U khuếch đại sử dụng giải trình tự lên đến vài kb Ngồi ra, sản phẩm PCR enzyme khuếch đại sử dụng giải trình tự cho tín hiệu tốt ổn CH định 3.3 Kết quả, bàn luận tinh sản phẩm PCR Thể tích sản phẩm PCR cịn lại sau điện di tinh ExoSap-it 500 rcn Quá trình tinh sản phẩm PCR nhằm bất hoạt thành phần lại sau phản ứng PCR thư Taq polymerase, dNTPs, mồi dư, ion muối,… thu nhận dung dịch chứa đoạn exon chuẩn bị cho phản ứng giải trình tự Nồng độ DNA chủ yếu ước lượng dựa vào độ đậm vạch điện di sau PCR Nồng độ DNA điều chỉnh để sử dụng phản ứng cycle sequencing Tùy theo độ đậm vạch điện di mà thay đổi lượng nước thêm vào hòa tan DNA bước cuối giai đoạn tinh sản phẩm Phương pháp xác định nồng độ DNA tương đối dựa vào độ đậm vạch điện di so với thang chuẩn kb Phương pháp thực nhanh, tiện lợi, kiểm tra 37 Đồ án tốt nghiệp chất lượng nồng độ DNA sản phẩm PCR Do đó, thời gian thực quy trình rút ngắn 3.4 Phản ứng cycle sequencing đọc kết giải trình tự 3.4.1 Phản ứng cycle sequencing Mỗi sản phẩm PCR thực với phản ứng cycle sequencing (mỗi phản ứng sử dụng với mồi xuôi mồi ngược) Phản ứng cycle sequencing mồi xuôi mồi ngược nhằm tạo tổ hợp đoạn DNA chồng lắp lên nucleotide kết thúc loại ddNTP có gắn chất bắt màu đặc hiệu phát huỳnh quang tia laser Sau đó, sử dụng phương pháp tủa ethanol để thu lại lượng DNA có gắn chất bắt màu Tủa DNA hịa tan dung dịch Hidi Formamide, biến tính 96 oC phút trước Tà làm giảm nhiệt độ nóng chảy DNA Q trình giúp DNA duỗi thẳng mạch điện di mao quản u iệ il biến tính cố định DNA dạng mạch thẳng, hỗ trợ cho trình giải trình tự H Sau thực phản ứng cycle sequencing sản phẩm tủa ethanol TE U để loại bỏ thành phần dung dịch đệm, mồi, nucleotide, sản phẩm khơng đặc hiệu,…đồng thời có tác dụng cô đặc DNA Ở bước rửa ethanol CH 70% sau ly tâm hút bỏ dịch để giữ tủa đáy tube Lượng DNA tủa thường nên cần thao tác cẩn thận Do đó, hút bỏ dịch phía cần phải thật nhẹ nhàng, hút đến đáy tube chứa tủa không nên cố gắng hút cho khô, tủa làm khô tự nhiên hay làm nóng 50 - 70oC - phút Tủa khơ hồn tồn làm cho tín hiệu giải trình tự rõ ràng Ngồi ra, đặt tube vào máy ly tâm phải ý đặt vai tube hướng ngoài, để hút dịch tránh hút phải tủa chứa DNA 3.4.2 Đọc kết giải trình tự Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench 5, so sánh mẫu bệnh phẩm với trình tự DNA gen trình tự exon chuẩn Số thứ tự nucleotide tính theo chuỗi cDNA gen RET bình thường với mã số truy cập NG_007489 ngân hàng gen 38 Đồ án tốt nghiệp Do điều kiện phản ứng PCR cycle sequence như: hoạt tính enzyme, nồng độ hóa chất cho phản ứng (ddNTPs, dNTPs ) tín hiệu số nucleotide đầu nucleotide cuối trình tự thường bị nhiễu (các đỉnh tín hiệu khơng rõ ràng) khó xác định xác tên nucleotide il Tà Hình 3.2: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 11) với trình tự chuẩn iệ u Phân tích liệu hình 3.2 cho thấy vị trí c.1900 có phát thay đổi trình tự H codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine TE U (CGC), chân sóng điểm conflict gần trùng màu nucleotide khác (T>C), tra liệu NCBI cho kết luận đột biến gây hội chứng MEN2A CH Hình 3.3: So sánh trình tự mẫu RET1 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.3 cho thấy vị trí c.2307 có phát thay đổi trình tự codon 769 (CTT thành CTG), sóng điểm conflict chênh lệch màu 39 Đồ án tốt nghiệp nucleotide khác (T>G), nhiên không làm thay đổi amino acid Leucine, tra liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP Tà Hình 3.4: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 11) với trình tự chuẩn il Phân tích liệu hình 3.4 cho thấy vị trí c.1900 có phát thay đổi trình tự iệ codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine u (CGC), chân sóng điểm conflict gần trùng màu nucleotide khác H (T>C), tra liệu NCBI cho kết luận đột biến gây hội chứng MEN2A CH TE U Hình 3.5: So sánh trình tự mẫu RET2 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.5 cho thấy vị trí c.2307 có phát thay đổi trình tự codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng điểm conflict khác với màu quy ước (T>G), nhiên không làm thay đổi amino acid Leucine, tra liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 40 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.6: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 11) với trình tự chuẩn Tà Phân tích liệu hình 3.6 cho thấy vị trí c.1900 có phát thay đổi trình tự il codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine iệ (CGC), sóng điểm conflict gần trùng màu nucleotide khác u (T>C), tra liệu NCBI cho kết luận đột biến gây hội chứng MEN2A CH TE U H Hình 3.7: So sánh trình tự mẫu RET3 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.7 cho thấy vị trí c.2307 có phát thay đổi trình tự codon 769 (CTT thành CTG), sóng điểm conflict chênh lệch màu nucleotide khác (T>G), nhiên không làm thay đổi amino acid Leucine, tra liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 41 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.8 cho thấy vị trí c.1900 có phát thay đổi trình tự codon 634 làm thay đổi amino acid Cystein (TGC) thành amino acid Arginine Tà (CGC), sóng điểm conflict gần trùng màu nucleotide khác il u iệ (T>C), tra liệu NCBI cho kết luận đột biến gây hội chứng MEN2A CH TE U H Hình 3.9: So sánh trình tự mẫu RET4 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.9 cho thấy vị trí c.2307 có phát thay đổi trình tự codon 769 (CTT thành CTG), màu sóng điểm conflict khác với màu quy ước (T>G), nhiên không làm thay đổi amino acid Leucine, tra liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 42 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 11) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.10 cho thấy vị trí c.2071 có phát thay đổi trình tự codon 691 (G>A) làm thay đổi amino acid Glycine (GGT) thành amino acid Tà Serine (AGT), sóng điểm conflict chênh lệch màu nucleotide khác il u tràng bẩm sinh iệ nhau, tra liệu NCBI cho kết luận nghi ngờ gây hội chứng phình đại CH TE U H Hình 3.11: So sánh trình tự mẫu RET5 (exon 13) với trình tự chuẩn Phân tích liệu hình 3.11 cho thấy vị trí c.2307 có phát thay đổi trình tự codon 769 (CTT thành CTG), sóng điểm conflict chênh lệch màu nucleic khác (T>G), nhiên không làm thay đổi amino acid Leucine, tra liệu NCBI cho kết luận lành tính SNP 43 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ u iệ il Tà CH TE U H Đồ án tốt nghiệp 4.1 Kết luận Sau tiến hành đề tài, qua kết thu nhận phân tích trình bày phần III, chúng tơi kết luận: - Tối ưu hóa thành cơng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế - Phân tích trình tự DNA exon (10, 11, 13, 14, 15, 16) RET - Phát đột biến exon 11 13 gen RET (bao gồm bệnh nhân gia đình bệnh nhân khơng thuộc gia đình này) Bảng 4.1: Kết giải trình tự phát SNP exon 11, 13 [1] Mẫu Exon 11 Exon 13 Tà c.1900 T>C (p.Cys634Arg) RET2 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) RET3 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) RET4 c.1900 T>C (p.Cys634Arg) RET5 c.2071 G>A (p.Gly691Ser) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) iệ il RET1 u c.2307 T>G (p.Leu769Leu) TE U H c.2307 T>G (p.Leu769Leu) c.2307 T>G (p.Leu769Leu) CH c.2307 T>G (p.Leu769Leu) Kết luận: Ở exon 11 mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, có phát đột biến vị trí c.1900T>C (p.Cys634Arg) làm thay đổi Aa Cystein thành Arginine codon 634, đột biến thường gặp gây hội chứng MEN2A báo cáo trước Riêng mẫu RET5 có phát thay đổi SNP vị trí c.2071G>A (p.Gly691Ser) nghi ngờ hội chứng phình đại tràng bẩm sinh (Hirschsprung) Tại exon 13 mẫu RET1, RET2, RET3, RET4, RET5 có phát SNP vị trí c.2307T>G (p.Leu769Leu) khơng làm thay đổi Aa, kết luận lành tính 4.2 Kiến nghị Chúng ta cần tiến hành tầm soát bất thường di truyền bệnh nhân u 44 Đồ án tốt nghiệp sắc bào tuyến thượng thận để có kế hoạch theo dõi điều trị Tiến hành nghiên cứu phát đột biến gây bệnh u sắc bào tuyến thượng thận nhiều gen khác u iệ il Tà CH TE U H 45 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO u iệ il Tà CH TE U H Đồ án tốt nghiệp Tài liệu báo tạp chí Tiếng Anh: "MEN2 Database" University of Utah Applied Biosystems, (2002) “BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Protocol” Arighi E, Borrello MG, Sariola H (2005) "RET tyrosine kinase signaling in development and cancer" Cytokine Growth Factor Rev 16 (4–5): 441– 67 doi:10.1016/j.cytogfr.2005.05.010 PMID 15982921 Bausch B, Koschker AC, Fassnacht M, et al, (2006) “Comprehensive mutation scanning of NF1 in apparently sporadic cases of pheochromocytoma” J ClinEndocrinolMetab, 91:3478–3481 Buffet A, Venisse A, Nau V, et al, (2012) "A decade (2001-2010) of genetic testing Tà for pheochromocytoma and paraganglioma" Horm Metab Res Horm iệ il Stoffwechselforschung Horm Metab, 44(5):359–366 Burnichon N, Buffet A, Parfait B, et al (2012) “Somatic NF1 inactivation is a u H frequent event in sporadic pheochromocytoma” Hum Mol Genet, 21:5397-5405 TE U Hall N, (2007) “Advanced sequencing technologies and their wider impact in microbiology”, The Journal of Experimental Biology 209, pp 1518-1525, UK CH Knudsen B et al, (2008): CLC Sequence Viewer Lenders JWM, Duh Q-Y, Eisenhofer G, Gimenez-Roqueplo A-P, Grebe SKG, Murad MH, Naruse M, Pacak K, Young WF, (2014) Endocrine Society "Pheochromocytoma and paraganglioma: an endocrine society clinical practice guideline" J Clin Endocrinol Metab, 99(6):1915–1942 10 Lois M Mulligan, (2014) “RET revisited: expanding the oncogenic portfolio” Nature Reviews Cancer 14, 173–186 11 Moonim MT, (2012) "Tumours of chromaffin cell origin: phaeochromocytoma and paraganglioma" Diagn Histopathol, 18(6):234–244 12 Pasmant E, Sabbagh A, Masliah-Planchon J, et al, (2011) Role of non-coding RNA ANRIL in genesis of plexiform neurofibromas in neurofibromatosis type J Natl Cancer Inst, 103:1713–1722 46 Đồ án tốt nghiệp 13 Ricketts C, Woodward ER, Killick P, et al, (2008) “Germline SDHB mutations and familial renal cell carcinoma” J Natl Cancer Inst, 100:1260–1262 14 StratakisCA, Carney JA, (2006).” The triadof paragangliomas, gastric stromal tumours and pulmonary chondromas (Carney triad) and the dyad of paragangliomas and gastric stromal sarcomas (CarneyStratakis syndroe): molecular genetics and clinical implications” Endocrinol Metab 91:827–836 15 Takahashi M, Asai N, Iwashita T, et al, (1993) "Characterization of the ret protooncogene products expressed in mouse L cells" Oncogene (11): 2925– 2929 PMID 8414495 16 Wells SA, Asa SL, Dralle H, et al (2015) "Revised American Thyroid Association guidelines for the management of medullary thyroid carcinoma" Thyroid Off J Am Tà Thyroid Assoc 25(6):567–610 iệ il Tài liệu trích dẫn từ Internet: 17 http://emedicine.medscape.com/article/1177266-overview u H 18 https://ghr.nlm.nih.gov/condition/von-hippel-lindau-syndrome# TE U 19 https://ghr.nlm.nih.gov/condition/multiple-endocrine-neoplasia#genes 20 https://en.wikipedia.org/wiki/RET_proto-oncogene#Structure CH 21 www.vsmmb.com/data/upload_file/File/ /PCR_sequencing.pdf 22 https://thuocchuabenh.vn/benh-noi-tiet/u-tuy-thuong.html 23 http://cubocube.com/dashboard.php?a=348&b=1601&c=1 47 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Pipetman P10 - P1000 Tủ an toàn sinh học cấp II Máy PCR u iệ il Tà Máy giải trình tự 3500 CH TE U H Bồn điện di Máy soi gel Thiết bị luân nhiệt Máy ủ Máy đo OD