Khảo sát đột biến gen rb trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc trường đại học y dược thành phố hồ chí minh

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RB TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS.TS.BS NGUYỄN CƠNG KIỆT TS.BS HỒNG ANH VŨ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2017 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý hội đồng) KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN RB TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS.BS Nguyễn Công Kiệt CƠ QUAN QUẢN LÝ TS.BS Hồng Anh Vũ CƠ QUAN CHỦ TRÌ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 01/ 2017 MỤC LỤC Trang TÓM TẮT I DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ V PHẦN MỞ ĐẦU VI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH ĐỘT BIẾN GEN RB PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM PHỤ LỤC 5: CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC PHỤ LỤC 6: ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC TÓM TẮT NGHIÊN CỨU U nguyên bào võng mạc dạng ung thư nội nhãn thường gặp trẻ em, đột biến gen RB gây nên Nghiên cứu tiến hành để khảo sát đột biến gen RB bệnh nhân Việt Nam, làm sở để xây dựng chương trình tầm sốt phát sớm u ngun bào võng mạc tư vấn di truyền trước sinh Trong thời gian từ tháng 12/2014 đến tháng 08/2016, sử dụng phối hợp hai kỹ thuật giải trình tự DNA Sanger MLPA, khảo sát đột biến gen RB 52 bệnh nhân UNBVM Bệnh viện Mắt TPHCM Tỷ lệ đột biến phát tế bào mô u 82,7% (43/52) Phổ đột biến trải dài toàn gen RB, kể vùng khởi động gen Hầu hết đột biến gây cắt cụt protein RB (đột biến vô nghĩa, đột biến lệch khung đọc đột biến vùng tiếp giáp exon – intron), có bệnh nhân mang đột biến sai nghĩa đột biến Tỷ lệ phát đột biến mầm nhóm bệnh nhân có biểu bệnh hai mắt 69,2% so với 30,8% bệnh nhân bị bệnh mắt Đa số đột biến mầm phát sinh trình hình thành giao tử giai đoạn sớm phôi; có khoảng 9,5% trường hợp đột biến mầm bệnh nhân tìm thấy mẫu máu cha mẹ I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Retinoblastoma is the most common primary intra-ocular malignancy in children caused by mutations in the RB1 tumor suppressor gene This study was conducted to investigate RB mutations in Vietnamese patients Our study might help to establish a screening program for early detection of retinoblastoma and prenatal genetic counseling From December 2014 to August 2016, using a combination of Sanger sequencing and MLPA techniques, we investigated RB mutational status for 52 patients with retinoblastoma at the Ho Chi Minh City Eye Hospital Forty-three out of 52 patients (82.7%) had RB mutation in tumor cells Mutations were scattered across the RB gene, including promoter region The majority of mutations led to a truncated protein (nonsense, frameshift, and splicing mutations) Both missense mutations detected in this study were novel mutations Germline mutations were detected in 69.2% of patients with bilateral presentation, compared with 30.8% of patients with unilateral presentation Most germline mutations were supposed to arise during early embryological development, with only 9.5% of them were found in parents II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT GỐC TỪ CDK Cyclin-dependent kinase cDNA Complementary deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid FISH Fluorescence in situ hybridization (lai chỗ gắn huỳnh quang) MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification NLS Nuclear localization sequence PCR Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi) RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction UNBVM U nguyên bào võng mạc III DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng 3.1 Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu 18 Bảng 3.2 Độ tinh DNA tổng số thu nhận từ mẫu mô u 19 Bảng 3.3 Độ tinh DNA tổng số thu nhận từ mẫu máu 20 ngoại vi Bảng 3.4 Độ tinh RNA toàn phần thu nhận từ mẫu mơ u 21 Bảng 3.5 Trình tự 21 cặp mồi sử dụng khuếch đại 27 exon gen RB 22 thơng số Bảng 3.6 Trình tự cặp mồi sử dụng khuếch đại vùng mã hóa gen RB 25 Bảng 3.7 Kết khảo sát gen RB kỹ thuật giải trình tự DNA 26 Bảng 3.8 Kết khảo sát gen RB kỹ thuật MLPA 35 Bảng 3.9 Đặc điểm phân bố đột biến gen RB mô u máu 36 IV DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1 Hình ảnh tế bào u nguyên bào võng mạc mắt Hình 1.2 Thuyết two-hit Knudson Hình 1.3 Cấu trúc protein RB Hình 1.4 Vai trị protein RB Hình 1.5 Vai trị phức hợp DREAM Hình 1.6 Phân bố đột biến gen RB Hình 2.1 Tóm tắt bước nghiên cứu 17 Hình 3.1 Kết PCR khuếch đại 27 exon genomic DNA 23 Hình 3.2 Kết khuếch đại vùng promoter gen RB 24 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm RT-PCR 25 Hình 3.4 Phổ đột biến gen RB phát kỹ thuật giải trình tự DNA 31 Hình 3.5 Kết phân tích đột biến sai nghĩa polyphen-2 33 Hình 3.6 Lịch theo dõi khám chuyên khoa mắt 37 V PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: “Khảo sát đột biến gen RB bệnh nhân u nguyên bào võng mạc” Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS Nguyễn Công Kiệt TS.BS Hồng Anh Vũ Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2014 đến tháng 01/2017 Kinh phí duyệt: 1.056.000.000 đồng Mục tiêu: 2.1 Mục tiêu tổng quát: Xác định tỷ lệ đột biến gen RB bệnh nhân u nguyên bào võng mạc, làm sở để xây dựng chương trình tầm sốt phát sớm u nguyên bào võng mạc tư vấn di truyền trước sinh 2.2 Mục tiêu cụ thể: + Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự tồn gen RB kỹ thuật MLPA để phát đột biến gen bệnh nhân bị u nguyên bào võng mạc; + Dựa đột biến mầm gen RB tìm thấy bệnh nhân, phát người lành mang gen RB đột biến, bước đầu tư vấn di truyền để tầm soát phát sớm u nguyên bào võng mạc Bệnh viện Mắt TPHCM Nội dung thực (đối chiếu với hợp đồng ký): TT Các nội dung, công việc dự kiến Thu thập bệnh phẩm từ 50 bệnh nhân UNBVM 60 thân nhân Các nội dung, công việc thực + 52 bệnh nhân: 51 mẫu mô u 52 mẫu máu + 42 mẫu máu thân nhân bệnh nhân có đột biến mầm VI &3 Tách chiết DNA, RNA tổng hợp cDNA từ mẫu bệnh phẩm Tách chiết, tổng hợp bảo quản đầy đủ tất mẫu, theo quy trình kỹ thuật Thiết kế đoạn mồi (primer) phù hợp cho phản ứng PCR để khuếch đại chuyên biệt đoạn gen cần khảo sát chuẩn hóa điều kiện PCR Hồn thiện quy trình kỹ thuật khuếch đại: + Vùng promoter gen RB + 27 exon riêng biệt từ DNA + Vùng mã hóa cDNA Tham gia ngoại kiểm chuẩn theo chương trình Châu Âu Kiểm tra kết giải trình tự Pháp 6& Tinh sản phẩm PCR giải Đã mô tả phổ đột biến gen RB từ 52 bệnh trình tự DNA sản phẩm PCR nhân tình trạng người lành mang gen đột theo chiều xi ngược: Phân biến tích, đối chiếu kết giải trình tự chuỗi DNA NCBI Blast server để chẩn đốn tình trạng đột biến Thực kỹ thuật MLPA với Phát trường hợp có mất/ thêm đoạn lớn mẫu khơng có đột biến sau gen RB giải trình tự gen Tư vấn di truyền tầm soát phát sớm u nguyên bào võng mạc 10 Viết 02 chuyên đề: 1) Đột biến Hồn thành chun đề, có đánh giá gen RB UNBVM 2) Tư chuyên gia vấn di truyền phát sớm ung thư 11 Đăng báo khoa học Đã đăng báo khoa học 12 Tổng kết báo cáo, nghiệm thu sở cấp thành phố Báo cáo nghiệm thu đầy đủ tiến độ Kết khảo sát gen bác sĩ Bệnh viện Mắt sử dụng tư vấn cho bệnh nhân Sản phẩm đề tài (đối chiếu với hợp đồng ký): Sản phẩm dạng kết I, II VII RB-Y26: c.601G>C (p.A201P) RB-Y27: c.1735delC (p.R579fsX610) RB-Y29: Mất đoạn exon 17 RB-Y30: c.1072C>T (p.R358X), c.1547G>A (p.W516X) c.1666C>T (p.R556X) RB-Y31: c.-197G>A c.368-369insA (p.N123fsX130) RB-Y32: IVS6+1delG c.1548G>A (p.W516X) RB-Y34: c.1363C>T (p.R455X) RB-Y36: c.1841delA (p.K614fsX622) RB-Y37: c.1735delC (p.R579fsX610) 10 RB-Y38: c.1333C>T (p.R445X) RB-Y39: c.2264T>C (p.F755S) RB-Y41: c.1563-1564delTA p.N522fsX526) 11 RB-Y48: c.2359C>T (p.R787X) RB-Y50: IVS12+1 G>A RB-Y51: c.653T>G (p.L218X) c.1666C>T (p.R556X) 12 RB-Y53: IVS6+1 G>T c.1072C>T (p.R358X) RB-Y54: c.1421_1421+1delGG RB-Y55: IVS13-2A>G 13 RB-Y56: c.958C>T (p.R320X) RB-Y58: c.2332_2335del (p.T778fsX808) RB-Y59: Nhân đoạn exon 12 exon 18 14 RB-YY: c.2094_2104>A (p.H699fsX701) 15 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB TRONG U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC Tách chiết DNA từ mẫu mô u Cho khoảng 0,1 g mẫu mô u vào eppendorf 1,5 ml Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu DNA từ tế bào mơ u tách chiết Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) theo hướng dẫn nhà sản xuất, thu 50 µl dung dịch chứa gDNA Sản phẩm DNA sau tách chiết trữ -20oC sử dụng DNA kiểm tra độ tinh máy NanoDrop2000 (Thermo): nhỏ μl dung dịch gDNA lên phận đặt mẫu máy, đóng nắp đọc kết máy tính Tách chiết DNA từ mẫu máu DNA từ tế bào máu tách chiết Illustra Blood GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn nhà sản xuất, thu 200 μl dung dịch chứa gDNA Kiểm tra độ tinh gDNA thu máy NanoDrop2000 (Thermo) Dung dịch gDNA sau tách chiết bảo quản lưu trữ -20oC Tách chiết RNA từ mẫu mô u Bước 1: Xử lý mẫu mô u: Mẫu mô u sau thu nhận phải bảo quản 4oC xử lý ngày Quy trình xử lý sau: - Cho khoảng 0,1 g mẫu mô u vào eppendorf 1,5 ml Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu - Thêm ml dung dịch PBS 1X pH 7, trộn cách đảo ống - Ly tâm 2000 vòng/phút phút - Hút bỏ dịch Thu nhận phần cặn Bước 2: Tách chiết RNA - Thêm vào 900 µl dung dịch Trizol Vortex mạnh giây Để yên 10 phút - Cho tiếp 200 µl dung dịch chloroform Lắc trộn kỹ phút ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Sau ly tâm xong, nhẹ nhàng hút 600 µl dịch chứa RNA vào eppendorf 1,5 ml khác - Thêm 600 µl isopropanol lạnh Trộn hỗn hợp, để yên -20oC - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Đổ bỏ dịch nổi, phải cẩn thận loại dịch dễ loại bỏ cách đồng thời cặn RNA đáy - Cho vào 900 µl ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút phút - Đổ bỏ dịch nổi, thu lấy phần cặn tủa, để cặn khô 60oC 10 phút - Hịa cặn RNA 30 µl H2O-DEPC, thực phản ứng phiên mã ngược Nếu chưa thực bảo quản RNA -20oC vịng 48 Tổng hợp cDNA cDNA tổng hợp kit PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara – Nhật Bản) Giai đoạn biến tính gắn mồi: Thiết lập phản ứng với thể tích 11 µl (kí hiệu hỗn hợp A), gồm: µl Random hexammers; µl dNTP; µl RNA µl H2O-DEPC Ủ hỗn hợp 65oC phút Sau đó, đặt đá lạnh phút Thiết lập phản ứng tổng hợp cDNA với thể tích 20 µl, gồm: µl enzyme phiên mã ngược; µl dung dịch đệm RT; 0,6 µl RNase Inhibitor; 10 µl hỗn hợp A 4,4 µl H2O-DEPC Chương trình nhiệt phản ứng phiên mã ngược với bước sau: 30oC – 10 phút, 50oC – 45 phút, 70oC - 15 phút Các sản phẩm cDNA chưa sử dụng giữ -20oC Thiết kế mồi cho phản ứng PCR RT-PCR Sử dụng phần mềm CLC Main Workbench v5.5 thiết kế 22 cặp mồi đặc hiệu nhân vùng promoter 27 exon gen RB (mã số GenBank NG_009009) cặp mồi đặc hiệu nhân vùng mã hóa cDNA gen RB (mã số NM_000321) Đây phần mềm chuyên dụng cho phép thiết kế mồi phản ứng PCR từ trình tự gen có sẵn Các phần mềm Oligo Analyzer 3.1 (https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer), Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) sử dụng để kiểm tra thông số độ đặc hiệu mồi Chương trình trực tuyến SNPcheck (https://secure.ngrl.org.uk/SNPCheck/snpcheck.htm) giúp phát vị trí nucleotide đa hình (SNP) cần tránh đầu 3’ mồi Các cặp mồi thiết kế khơng có tượng SNP (single nucleotide polymorphism) có nhiệt độ gắn mồi xấp xỉ đồng thời đạt thông số lý thuyết yêu cầu Sau kiểm tra thông số độ đặc hiệu mồi, mồi tổng hợp công ty IDT (Intergrated DNA Technologies, Mỹ) Bảng Thông tin mồi dùng cho genomic PCR 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Mồi xi (5’-3’) Tên mồi Trình tự RB1-g1F ttttgtaacgggagtcggga RB1-g2F ttcactgtgtggtatcctta RB1-g3F gccatcagaaggatgtgtta RB1-g4F agtgatttgatgtagagctg RB1-g5F aaccttaggtggatcagctg RB1-g6F tgcacaaaaagaaacaccca RB1-g7F ggatatactctaccctgcga RB1-g8F agcagagtagaagagggatg RB1-g9F cttaccctgcattgttcaag RB1-g10F gaaatctgtgcctctgtgtg RB1-g12F gtgggaggcagtgtatttga RB1-g13F cagtagttgtggttacctag RB1-g14F2 atctcttgagcccaggagtg RB1-cF4 gaggttgtaatggccacata RB1-g18F gccactgtcaattgtgccta RB1-g19F ctgggtgtacaaccttgaag RB1-g20F catgtttctctgggggaaag RB1-g21F2 gggacaagagccaaagttag RB1-g24F gtggttctagggtagaggta RB1-g25F gggtgtttaattggggatgg Mồi ngược (5’-3’) Tên mồi Trình tự RB1-g1R tcctgtcaccattctgcaga RB1-g2R tcctctgggtaatggaatta RB1-g3R gagagaatggcagttcacta RB1-g4R ggaagcattcagaatgcata RB1-g5R gtcctgaatcaattccacct RB1-g6R aagccaagcagagaatgagg RB1-g7R tcctgtcagccttagaacca RB1-g8R ttagggagaacttacatcta RB1-g9R caattatcctccctccacag RB1-g11R accacacctggccttcaata RB1-g12R tggtgagcaaggcaaatagg RB1-g13R cagcagggatatagtatctg RB1-g16R gaccaaagaaacacaccaca RB1-g17R2 gatccttgggctatagactg RB1-g18R ggtgattcagtagcactctg RB1-g19R ccagtcagcctagtttcaga RB1-g20R caagtaagtagggaggagag RB1-g23R gggattattttgatccaaga RB1-g24R caatatgcctggatgaggtg RB1-g26R aacaaacctgccaactgaag 21 RB1-g27F tatatggcagccacttgcca RB1-g27R 22 RB1-ProF aagttccgcacctatcagcg RB1-ProR STT Độ dài sản phẩm (bp) 418 480 417 424 539 288 288 415 222 1318 434 394 850 1372 437 282 349 1962 279 1017 Vùng exon khuếch đại 10-11 12 13 14 -16 17 18 19 20 21-23 24 25,26 gtggccataaacagaacctg 241 27 ggcaactgagcgccgcgt 477 Promoter Bảng Thông tin mồi dùng cho RT-PCR Mồi xuôi (5’-3’) STT Mồi ngược (5’-3’) Tên mồi Trình tự Tên mồi Trình tự RB1-cF1 RB1-cF2 RB1-cF3 RB1-cF4 RB1-cF5 tgtaacgggagtcgggagag tgctatgtcaagactgttga aatggacttccagaggttga gaggttgtaatggccacata gtctgagcacccagaattag RB1-cR1 RB1-cR2 RB1-cR3 RB1-cR4 RB1-cR5 cgaactgctgggttgtgtca acattcacctcttcatcaag ccatgggaaagacaaatctg gttcatactcattctgcagg cagtcacatctgtgagagac Độ dài sản phẩm (bp) 644 666 624 607 844 Phản ứng genomic PCR Thiết lập phản ứng PCR để nhân vùng promoter 27 exon gen RB 22 cặp mồi (Bảng 1): Bảng 4: Chương trình nhiệt PCR Bảng 3: Thành phần hóa chất PCR Tên hóa chất Nồng độ cuối Giai đoạn Chu trình nhiệt PCR Buffer 1X Biến tính 98oC phút MgCl2 1,5 mM Lặp lại 40 chu kỳ dNTP 0,2 mM/mỗi loại - Biến tính 98oC Mồi xi/ngược Takara HS Taq polymerase gDNA 0,1 µM - Bắt cặp 58oC 0,5 U - Kéo dài 72oC 10 giây 20 giây 1,5 phút phút H2 O Vừa đủ 15,0 µl 700bp nên búng nhẹ để tránh làm đứt gãy mẫu) - Ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 25 phút - Loại bỏ dịch nổi, thêm 200 μl ethanol 70% vào tube - Ly tâm 13000 vòng/phút 4oC 15 phút - Dùng pipette hút dịch nổi, thu tủa - Ủ tube 48oC (đến cồn bay hết) - Cho 17 μL Hi-Di formamide vào tube, vortex kỹ, ly tâm nhanh - Ủ 96oC, phút - Giữ lạnh -30oC phút nạp vào giếng giải trình tự (đĩa 96 giếng) 12 Giải trình tự phân tích kết Trình tự nucleotide đoạn gen cần phân tích xác định máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ) Kết phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 Chương trình gióng cột trình tự exon mẫu trình tự gen RB NCBI từ phát đột biến gen có Cách đọc tên đột biến theo danh pháp đột biến Johan T den Dunnen cộng đề xuất năm 2000 13 Phản ứng MLPA Bộ kit thương mại SALSA MLPA P047-D1 RB1 probemix (MRCHolland, Amsterdam, Hà Lan) gồm 56 MLPA probe, khuếch đại sản phẩm có kích thước từ 128 – 500 nucleotide Các giai đoạn thực hiện: - Giai đoạn biến tính DNA: lấy µl DNA (có nồng độ 50 – 250 ng) cho vào tube 0,2 ml, biến tính DNA 98oC phút - Giai đoạn lai: bổ sung µl hỗn hợp hybridization master mix vào tube phản ứng (gồm 1,5 µl SALSA MLPA Buffer 1,5 µl probemix), ủ 98oC phút, sau lai 60oC từ 16 - 20 - Giai đoạn nối đoạn probe: thêm 32 µl hỗn hợp Ligase-65 master mix (gồm 25 µl nước; µl Ligase buffer A; µl Ligase buffer B µl enzyme Ligase-65) vào tube phản ứng, trộn đều, ủ 54oC 15 phút để nối probe gắn huỳnh quang, sau tăng nhiệt độ lên 98oC phút để phá hủy enzyme Ligase-65 sau phản ứng nối - Giai đoạn khuyết đại số lượng probe: thêm 10 µl hỗn hợp polymerase master mix (gồm 7,5 µl nước; µl SALSA PCR primer 0,5 µl SALSA polymerase) vào tube tiến hành phản ứng PCR với chương trình nhiệt sau: 35 chu kỳ gồm 98oC 30 giây; 60oC 30 giây; 72oC 60 giây, giai đoạn kết thúc 72oC 20 phút - Giai đoạn phân tách đoạn: sản phẩm sau kết thúc phản ứng MLPA phân tách đoạn hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP với thể tích gồm 32 µl Hi-di formamide; µl Beckman D1-labeled CEQ size standard 600 µl sản phẩm MLPA Điều kiện phân tách: nhiệt độ mao quản 50oC, biến tính 90oC giây, điện bơm mẫu kV 30 giây, điện phân tách đoạn 4,8 kV 60 giây Sau kết thúc điện di, kết phân tích phần mềm GeneMarker ver 1.91 (Softgenetics) để phát đột biến gen RB Kết MLPA mẫu hiển thị dạng bảng biểu đồ sóng Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) sản phẩm probe Kích thước peak xác định nhờ so sánh với thang kích thước mẫu đối chứng để tính tỉ lệ DQ (Dosage quotients) Từ tính số exon gen RB Nhóm đối chứng thực phản ứng MLPA đồng thời với mẫu bệnh nhân cho kết tỷ lệ đỉnh sóng Đối với người bình thường, tỷ lệ đỉnh sóng so với nhóm chứng ± 0,3 Nếu tỷ lệ đỉnh sóng < 0,7 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến đoạn Tỷ lệ đỉnh sóng >1,3 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến lặp đoạn