Khảo sát đột biến gen atp7b (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 và 20) trong bệnh wilson bằng kỹ thuật giải trình tự sanger

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài : KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ATP7B (CÁC EXON 2, 8, 10, 12, 14, 16 VÀ 20) TRONG BỆNH WILSON BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC GVHD : PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ Tp Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài : KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ATP7B (CÁC EXON 2, 8, 10, 12, 14, 16 VÀ 20) TRONG BỆNH WILSON BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC GVHD : PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập thực đề tài thực tập tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, với góp ý, cảm thơng q thầy cơ, gia đình bạn bè Với tất kính trọng lịng biết ơn chân thành nhất, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Thầy PGS.TS.BS Hoàng Anh Vũ, thầy Hồ Quốc Chương điều kiện tình hình dịch bệnh Covid-19 phức tạp thầy chấp nhận, tạo điều kiện cho em có chỗ thực tập tốt Bên cạnh thầy tận tình truyền đạt, hướng dẫn, kiên nhẫn, động viên bảo em suốt trình thực đề tài thực tập tốt nghiệp Các anh chị kỹ thuật viên, nghiên cứu viên, nhân viên trung tâm Y Sinh học phân tử - Trường đại học Y Dược TP.HCM, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em trình thực thực tập tốt nghiệp Ban Giám hiệu nhà trường, quý Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu suốt năm học qua Bên cạnh quý Thầy Cô tạo điều kiện tốt để em hồn thành thực tập tốt nghiệp Tồn thể bạn bè em, người sẵn sàng giúp đỡ em học tập, trình thực đề tài đời sống Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ người thân gia đình yêu thương, chăm sóc, động viên làm chỗ dựa vững giúp đạt mục tiêu năm đại học Với điều kiện thời gian thực tập hạn chế tình hình dịch bệnh, kinh nghiệm thân em hạn chế, em tin báo cáo thực tập tốt nghiệp em tránh khỏi thiếu sót Em xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH WILSON 1.1.1 Sơ lược bệnh Wilson 1.1.2 Sinh bệnh học bệnh Wilson 1.1.3 Cơ chế phân tử bệnh Wilson 1.2 BỆNH HỌC PHÂN TỬ BỆNH WILSON 1.2.1 Vị trí gen ATP7B 1.2.2 Cấu trúc gen ATP7B 1.2.3 Chức protein ATP7B 1.2.4 Đột biến gen ATP7B 1.3 PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN ATP7B GÂY BỆNH WILSON 1.3.1 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 1.3.2 Phương pháp Sanger 11 1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) 13 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Hóa chất 14 2.2.1 Hóa chất tách chiết DNA gen (gDNA) từ mẫu máu 14 2.2.2 Hóa chất PCR 14 2.2.3 Hóa chất dùng điện di gel agarose 14 2.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng tinh sản phẩm PCR 14 2.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR giải trình tự 14 2.2.6 Hóa chất dùng cho trình kết tủa sản phẩm PCR 15 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 15 2.4.1 Thu thập liệu 15 2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA từ mẫu máu 16 2.4.3 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 16 2.4.4 Kỹ thuật PCR khuếch đại exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B 17 2.4.5 Điện di 18 2.4.6 Kỹ thuật tinh sản phẩm PCR 19 2.4.7 Kỹ thuật PCR giải trình tự (Cycle Sequencing) 19 2.4.8 Kết tủa sản phẩm PCR giải trình tự 20 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết 21 2.5 Thời gian thực địa điểm 21 2.6 Quy trình nghiên cứu 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Kết khai thác liệu 23 3.2 Tách chiết DNA 23 3.3 Kết PCR 24 3.4 Kết giải trình tự theo phương pháp Sanger 25 3.5 Các đột biến phát gen ATP7B exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 28 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 4.1 Kết luận 30 4.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ATOX1 : Antioxidant Copper Chaperone ATP Adenosine triphosphate : ATP7B : P-type ATPase Bp : Base pair CBPs : Copper Binding Proteins CCS1 : Chaperone đồng cho superoxide dismutase Cp : Ceruloplasmin CTR-1 : Copper transporter ddNTP : Dideoxynucleotide triphosphate DKTG : (D: axit aspartic, K: Lysin, T: Threonin, G: Glycine) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxynucleoside triphosphat gDNA : Genomic DNA GSH : Glutathione Kb : Kilobase MBDs : Metal Binding Domains NCBI : National Center for Biotechnology Information OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction SOD1 : Superoxide dismutase NCBI : National Center for Biotechnology Information ddATP : Dideoxyadenin triphosphat ddCTP : Dideoxycitosin triphosphat ddGTP : Dideoxyguanin triphosphat ddNTP : Dideoxynucleoside triphosphat ddTTP : Dideoxytimin triphosphat DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 : Các trình tự mồi dùng để khuếch đại exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B 17 Bảng 2.2 : Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.3 : Chu trình luân nhiệt PCR vùng khởi động gen ATP7B 18 Bảng 2.4 : Thành phần hóa chất cho phản ứng tính sản phẩm PCR 19 Bảng 2.5 : Chu trình luân nhiệt quy trình tinh sản phẩm PCR 19 Bảng 2.6 : Thành phần hóa chất PCR giải trình tự 20 Bảng 2.7 : Chu trình luân nhiệt PCR giải trình tự 20 Bảng 3.1 : Độ tinh DNA tổng số thu nhận từ mẫu máu 23 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 : Con đường chuyển hóa đồng tế bào gan Hình 1.2 : Vị trí gen ATP7B Hình 1.3 : Tổ chức cấu trúc gen ATP7B Hình 1.4 : Phân bố số đột biến gen ATP7B Hình 1.5 : Các bước kỹ thuật PCR 11 Hình 1.6 : Quy trình phương pháp Sanger 12 Hình 2.1 : Quy trình xác định đột biến gen ATP7B 22 Hình 3.1: Kết PCR gen ATP7B mẫu WD-65, WD-67 exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 24 Hình 3.2 : Kết giải trình tự exon 25 Hình 3.3 : Kết giải trình tự exon 25 Hình 3.4 : Kết giải trình tự exon 10 26 Hình 3.5 : Kết giải trình tự exon 12 26 Hình 3.6 : Kết giải trình tự exon 14 27 Hình 3.7 : Kết giải trình tự exon 16 27 Hình 3.8 : Kết giải trình tự exon 20 28 Hình 3.9 : Đột biến c.2333G>T (p.R778L) exon gen ATP7B 29 Hình 3.10 : Đột biến c.2549C>T (p.T850I) exon 10 gen ATP7B 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson tình trạng bệnh đặc trưng tích tụ đồng thể, ảnh hưởng đến gan, não, quan khác Bệnh tác giả Kinnear Wilson mô tả lần đầu tiền vào năm 1912 Bệnh Wilson bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, liên quan đến thay đổi chức gen ATP7B [14] Vai trò protein ATP7B điều hịa q trình hấp thụ, chịu trách nhiệm phân bố thải trừ đồng ngồi thể Do đó, đột biến gen xảy gây rối loạn q trình chuyển hóa đồng đặc biệt giảm tiết đồng qua đường mật Lượng đồng ứ lại thể lắng đọng dần quan: gan, não (chủ yếu nhân xám), mắt, da, thận, xương nhiều quan khác, gây triệu chứng khác lâm sàng [22] Bệnh Wilson ghi nhận hầu hết quốc gia chủng tộc giới với tỷ lệ mắc dao động khoảng 1/100.000 đến 1/35.000 trẻ em sinh Tỷ lệ người mang bệnh 1/90 người, bệnh Wilson trở thành rối loạn phổ biến theo di truyền học Mendel [29] Đồng khoáng chất vi lượng mà thể cần với số lượng nhỏ, cần thiết cho trao đổi chất tế bào, q trình chuyển hóa Ngồi đồng cịn tham gia trì chức nhiều enzyme cytochrome c oxidase, ceruloplasmin, Cu/Zndependent superoxide dismutases, tyrosinase, dopamine-β-hydroxylase peptidyl-αmonooxygenase Các enzyme xúc tác cho trình phosphoryl hóa, vận chuyển sắt, chống oxy hóa, trung hòa gốc tự tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh [25] Ở điều kiện sinh lý bình thường, lượng đồng thể hấp thụ từ 2-5 mg/ngày Sau hấp thụ ruột non nhờ methallothionin, đồng đưa vào huyết tương gắn với albumin dạng Cu2+ trước kết hợp với protein hepatocuprein gan để tổng hợp thành cerulopasmin đào thải qua mật Khoảng 95% đồng máu dạng ceruloplasmin, có chất alpha globulin Ceruloplasmin protein quan trọng trình chuyển hóa đồng thể Những người mắc bệnh Wilson, kết hợp đồng vào ceruloplasmin tiết đồng qua mật bị suy giảm [6] Gan quan cân nội mơ thể, liên quan đến việc loại bỏ đồng dư thừa Lượng đồng bị ứ lại thể không đào thải ngồi được, chất oxy hóa kích thích hình thành gốc tự q trình peroxy hóa lipid Trong tế bào gan, vai trị vận chuyển đồng ATPase vận chuyển ATP7B Sự sai hỏng mặt di truyền gen ATP7B dẫn đến rối loạn chức vận chuyển đồng, gây tích tụ Bảng 2.2 : Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) 10X PCR buffer 1,5 μl 2,5 mM dNTP 1,5 μl Mồi xuôi F (10 µM) 0,75 μl Mồi ngược R (10 µM) 0,75 μl Takara Taq HS 0,12 μl H2 O 8,88 μl gDNA 1,5 μl Tổng thể tích 15 μl Bảng 2.3 : Chu trình luân nhiệt PCR vùng khởi động gen ATP7B Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ 98 phút 98 10 giây 60 20 giây 72 phút 72 phút 10 ∞ 40 2.4.5 Điện di Nguyên tắc: Dựa vào di chuyển nucleic acid gel tác động điện trường Sự di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử, kiểu cấu trúc nồng độ chất cấu thành gel Các bước tiến hành điện di gel agarose: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1% với đệm TBE 0,5X Mẫu chạy kèm với thang DNA 1kb plus để so sánh kích thước Chuẩn bị gel agarose 1%: cân g agarose hòa 60 ml dung dịch 0,5X TBE; làm tan agarose cách đun lị vi sóng, để nguội đến khoảng 50 – 550C, đổ gel, gắn lược Chuẩn bị điện di: chuyển gel đổ vào bồn điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X vào bồn điện di Nạp mẫu: µl mẫu + µl dung dịch gelred, trộn Bơm mẫu thang chuẩn vào giếng 18 Chạy điện di với hiệu điện 100 volt 25 phút Xem kết máy UV, đối chiếu thang chuẩn Kb Plus DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm PCR 2.4.6 Kỹ thuật tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR tinh giải trình tự gen trực tiếp để xác định đột biến gen ATP7B Sản phẩm PCR tinh kit ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup Thermo Scientific Bảng 2.4 : Thành phần hóa chất cho phản ứng tính sản phẩm PCR Thành phần Thể tích Exonuclease 0.5 μl Alkaline Phosphatase 0.5 μl Nước cất khử ion μl Sản phẩm PCR μl Tổng μl Bảng 2.5 : Chu trình luân nhiệt quy trình tinh sản phẩm PCR Nhiệt độ (0C) Thời gian 37 0C 15 phút 80 0C 15 phút 0C ∞ 2.4.7 Kỹ thuật PCR giải trình tự (Cycle Sequencing) Giải trình tự theo phương pháp Sanger với kit BigDye® Terminators V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) mồi xi/ngược Quy trình tiến hành: Chuẩn bị tube µl, ghi ký hiệu mẫu Pha master mix gồm nước cất, sequencing bufer 5X, BigDye® Terminator V3.1 2,5X Tồn khâu chuẩn bị master mix phải thực khay đá Các hóa chất 19 phải làm tan trộn trước sử dụng Big dye 2,5X phải bảo quản tránh ánh sáng Mỗi DNA thực hai phản ứng với mồi xuôi mồi ngược Vortex, spin Bảng 2.6 : Thành phần hóa chất PCR giải trình tự Thành phần Thể tích BigDye® Terminator V3.1 2,5X 0,5 µl Sequencing buffer 5X 1,5 µl Mồi giải trình tự (1,6 µM) µl Sản phẩm PCR tinh µl Nước cất 4,5 µl Cho 6,5 µl hỗn hợp vào tube chuẩn bị Cho µl mồi tương ứng với mẫu (mồi xi mồi ngược) Cho µl sản phẩm PCR tinh vào tube, vortex, spin Đặt tube mẫu vào máy PCR Bảng 2.7 : Chu trình luân nhiệt PCR giải trình tự Nhiệt độ (0C) Thời gian 96 phút 96 10 giây 50 giây 60 phút ∞ Chu kỳ 25 - 2.4.8 Kết tủa sản phẩm PCR giải trình tự Sản phẩm PCR sau giải trình tự kết tủa pha loãng với Hi-Di formaldehyde trước cho vào đĩa 96 giếng giải trình tự Quy trình tiến hành: - Chuẩn bị tube 1,5 ml, ghi ký hiệu mẫu - Pha hỗn hợp: 11 μl NH4OAC 5M 60 μl ethanol 100%, cho toàn số mẫu Vortex trộn - Cho 71 μl hỗn hợp vào tube 1,5 ml chuẩn bị 20 - Cho toàn sản phẩm cycle sequencing PCR vào tube, vortex kỹ - Ly tâm lạnh 14600 vòng/phút 40C 25 phút - Loại bỏ dịch nổi, thêm 400 μl ethanol 70% vào tube Đảo - Ly tâm lạnh 14600 vòng/phút 40C 15 phút - Dùng máy hút chân không hút dịch nổi, thu tủa - Ủ tube 480C (đến cồn bay hết) - Cho 17 μl Hi-Di formamide vào tube, vortex kỹ, ly tâm nhanh - Ủ 960C, phút - Giữ lạnh -300C phút nạp vào giếng giải trình tự (đĩa 96 giếng) 2.4.9 Giải trình tự phân tích kết Trình tự nucleotide đoạn gen cần phân tích xác định máy giải trình tự tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, Mỹ) Kết phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 2.5 Thời gian thực địa điểm Đề tài tiến hành từ ngày 02 tháng 12 năm 2021 đến ngày 12 tháng năm 2022 Trung tâm Y Sinh học phân tử - Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 21 2.6 Quy trình nghiên cứu Bệnh nhân Wilson Tinh sản phẩm Thu thập mẫu máu Điện di PCR Phản ứng giải trình tự (Cycle Sequencing) Tủa sản phẩm Tách chiết DNA từ mẫu máu Phản ứng PCR khuếch đại exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B Giải trình tự phân tích kết Xác định đột biến exon khảo sát Hình 2.1 : Quy trình xác định đột biến gen ATP7B 22 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết khai thác liệu Chúng sử dụng từ khóa: “Wilson disease”, “ATP7B gene mutation”, “copper transporting ATPase”, “spectrum mutation of ATP7B gene”, … nhằm khai thác liệu nguồn sở liệu NCBI: ngân hàng sở liệu để khai thác thu thập thông tin (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), sci-hub (https://sci-hub.se/), google schoolar (https://scholar.google.com/), google (https://www.google.com.vn/?hl=vi),… 3.2 Tách chiết DNA Mẫu máu bệnh nhân tách chiết thu nhận DNA tổng số Wizard® Genomic DNA Purification Kit Sau tách chiết, tiến hành kiểm tra độ tinh DNA thu phương pháp đo giá trị mật độ quang (OD – Optical density) Kết đo OD DNA thu nhận từ mẫu mô máu thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 : Độ tinh DNA tổng số thu nhận từ mẫu máu Mẫu DNA (ng/µl) Độ tinh (A260/280) WD-65 40 1,8 WD-66 36 1,9 WD-67 39 1,8 Chú thích: A260: độ hấp thụ dung dịch DNA bước sóng 260nm A280: độ hấp thụ cực đại protein bước sóng 280nm Nhận xét: Ba mẫu DNA tách chiết có nồng độ đạt yêu cầu để thực phản ứng PCR; độ tinh đạt tiêu chuẩn với tỷ số mật độ quang bước sóng 260/280nm nằm khoảng 1,8-2,0 Cho thấy DNA tinh sạch, nồng độ DNA tương đối cao mẫu, đủ điều kiện để tiếp tục thực thí nghiệm 23 3.3 Kết PCR Việc khuếch đại thành công đoạn gen đặc hiệu cần khảo sát đột biến phản ứng PCR khâu quan trọng quy trình phát đột biến gen kỹ thuật giải trình tự Sử dụng cặp mồi đặc hiệu Bảng 2.1 để khuếch đại exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết đọc qua hệ thống GelDoc-It® Imager hãng UVP Kết điện di thể Hình 3.1 Hình 3.1 : Kết PCR gen ATP7B mẫu WD-65, WD-67 exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 Chú thích: Giếng số 1, 4, 7, 10, 13, 16: sản phẩm PCR WD-65 exon 2, 8, 10-12, 14, 16 20 Giếng 2, 5, 8, 11, 14, 17: sản phẩm PCR WD-67 thực trước exon tương ứng Giếng 3, 6, 9, 12, 15, 18: giếng chứng âm Giếng M: thang chuẩn Kết điện di cho thấy, chứng âm giếng 3, 6, 9, 12, 15, 18 khơng xuất băng sản phẩm nào, khơng bị nhiễm trình khuếch đại Các cặp mồi khuếch đại cho exon mục tiêu cho kết băng sản phẩm kích thước Các băng sản phẩm rõ, có kích thước độ sáng so với chứng dương Các sản phẩm PCR đạt yêu cầu để thực bước quy trình giải trình tự 24 3.4 Kết giải trình tự theo phương pháp Sanger Hình 3.2 : Kết giải trình tự exon Hình 3.3 : Kết giải trình tự exon 25 Hình 3.4 : Kết giải trình tự exon 10 Hình 3.5 : Kết giải trình tự exon 12 26 Hình 3.6 : Kết giải trình tự exon 14 Hình 3.7 : Kết giải trình tự exon 16 27 Hình 3.8 : Kết giải trình tự exon 20 3.5 Các đột biến phát gen ATP7B exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC MainWorkbench v5.5, ghi nhận mẫu bệnh phẩm, phát 2/3 trường hợp phát đột biến exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B Chúng phát đột biến gen ATP7B công bố gây bệnh ngân hàng liệu Clinvar c.2333G>T (p.R778L) exon 8, c.2549 C>T (p.T850I) exon 10 28 Hình 3.9 : Đột biến c.2333G>T (p.R778L) exon gen ATP7B Đột biến c.2333G>T (p.R778L) dạng dị hợp tử mơ tả Hình 3.9, đột biến thay nucleotide G thành T dẫn đến thay đổi amino acid Arginine thành Leucine Đột biến ghi nhận đánh giá sở liệu Clinvar, cho thấy đột biến có khả gây bệnh Wilson Đột biến ghi nhận phổ biến nước châu Á với tỷ lệ 31,9% Trung Quốc, 35% Nhật 43,1% Đài Loan [26] Hình 3.10 : Đột biến c.2549C>T (p.T850I) exon 10 gen ATP7B Nhận xét: Đột biến c.2549 C>T (p.T850I) dạng dị hợp tử mô tả Hình 3.10, đột biến thay nucleotide C thành T dẫn đến thay đổi amino acid Threonine thành Isoleucine Đột biến ghi nhận đánh giá sở liệu Clinvar, cho thấy đột biến có khả gây bệnh Wilson 29 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình thực thực tập tốt nghiệp số kết luận ghi nhận: Quy trình thực khảo sát đột biến phương pháp Sanger exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 gen ATP7B thực thành công Ghi nhận đột biến vùng exon mục tiêu từ bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh Wilson 4.2 Đề nghị Nhằm hoàn thiện nghiên cứu này, phát triển hướng nghiên cứu tiếp theo, chúng tơi đề nghị: Hồn thiện quy trình khảo sát thêm đột biến gen ATP7B tồn vùng mã hố nhằm phục vụ mục tiêu điều trị tư vấn di truyền cho bệnh nhân mắc bệnh Wilson Mở rộng cỡ mẫu nghiên cứu để ghi nhận tỉ lệ lưu hành đột biến gen ATP7B Việt Nam 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Quốc Hương, Nguyễn Nhật Thông, cộng (1970), “Tám trường hợp bệnh thối hóa gan - nhân đậu Việt Nam”, Hội nghị Thần kinh học Mỹ, 25, 1147 Đỗ Thanh Hương (2007), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bước đầu phát đột biến gen gây bệnh Wilson, Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ nội trú bệnh viện Đỗ Thanh Hương (2016), Phân tích mối tương quan đột biến gen ATP7B kiểu hình bệnh nhân Wilson Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Thần kinh, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Hoàng Lê Phúc, Krsin Zinober, Claudia Willheim cộng (2012), “Bước đầu phân tích đột biến phân tử gen ATP7B bệnh nhi Wilson Việt Nam”, Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 16(4) Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Tp Hồ Chí Minh Khuất Hữu Thanh (2005), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thanh Hương (2018), Ba đột biến gen ATP7B bệnh nhân Việt Nam không liên quan đến bệnh, 19(1) Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Phạm Anh Hoa cộng (2018), “Áp dụng phương pháp sinh học phân tử phát sớm người mắc bệnh Wilson chưa có triệu chứng lâm sàng mang gen bệnh”, Tạp chí khoa học công nghệ Việt Nam, 60(7), Phan Tơn Hồng (2016), Nghiên cứu phát đột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson, Luận án Tiến sĩ, Trường đại học Y Hà Nội TIẾNG ANH 10 Alison J Coffey, Miranda Durkie, Stephen Hague (2013), A genetic study of Wilson’os disease in the United Kingdom, Brain, 136(5), 1476-1487 11 Ariöz, C L.-S (2017), The six metal binding domains in human copper transporter, ATP7B: molecular biophysics and disease-causing mutations, BioMetals, 30(6), 823- 840 12 Bandmann, O W (2015), Wilson’s disease and other neurological copper disorders, The Lancet Neurology, 14(1), 103-113 13 Chang, I J (2017), The genetics of Wilson disease, Handbook of Clinical Neurology, 19-34 14 Chaudhry, H.S., Anilkumar,A.C.(2017), Wilson disease 15 Coffey AJ, D M (2013), A genetic study of Wilson’s disease in the United Kingdom, Brain, 136, 1476-1487 31 16 Curtis D Durkie M.A (1999), Study of Wilson disease mutations in Britain, Hum Mutat, 14, 04-11 17 Curtis, D.D (1999), A study of Wilson disease mutations in Britain, Human Mutation, 14(4), 304-311 18 Ferenci, P (1998), wilson’s disease, Clinics in Liver Disease, 2(1), 31-49 19 Ferenci, P (2005), Wilson’s Disease, Clinical Gastroenterology and Hepatology, 3(8), 726-733 20 Coffey AJ, D M (2013), A genetic study of Wilson’s disease in the United Kingdom, Brain, 136, 1476-1487 21 Kenney, S M (2007), Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter, ATP7B, Human Mutation, 28(12), 1171-1177 22 Kim, E.K (1998), Identification of three novel mutations and high frequency of the Arg778Leu mutation in korean of patients with Wilson disease, Human Mutation, 11(4), 275-278 23 Kumar, M.G (2020), WilsonGen a comprehensine clinically annotated genomic variant resource for Wilson’s Disease, Scientific Reports, 10(1) 24 Mak CM, L C (2008), Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese: Identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity, J Hum Genet, 53, 55-63 25 Margarit E,B.V (2005), Mutation analysis of Wilson disease in Spanish population indentification of prevalent substitution and eight novel mutations in the ATP7B gene, Clin Genet, 61-68 26 Park HD, K C (2009), Carrier frequency of the R778L, A874V, and N1270S mutations in the ATP7B gene in a Korean population, Clin Genet, 75, 405-407 27 Patil, M., Sheth, KA, Krishnamurthy, AC, & Devarbhavi, H (2013), A review and current perspective on Wilson’s disease, Journal of clinical and experimental hepatology, 3(4), 321-336 28 Scheinberg IH Jaffe ME., Sternlieb I (1987), The use of trientine in preventing the effects of interrupting penicillamine therapy in Wilson’s disease, N Engl J Med, 317, 209-213 29 Sternlieb I.(1978), Diagnosis of Wilson’s disease, Gastroenterology, 774-787 30 Terada, K S (1998), ATP7B (WND) protein, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 30(10), 1063-1067 31 Walker, J M (2002), Metallochaperone Atox1 Transfers Copper to the NH2terminal Domain of the Wilson’s Disease Protein and Regulates Its Catalytic Activity, Journal of Biological Chemistry, 277(31), 27953-27959 32 Xiao, H D (2018), Mutation Analysis of the ATP7B Gene in Seven Chinese Families with Wilson’s Disease, Digestion, 1-8 33 Yan-Hong Gu, K.S.L (2004), Genotype- Phenotype Analysis of Mutation R778L in the ATP7B Gene, Original articles, 33-36 32 ... người bệnh Wilson Ở khu vực Châu Á, đột biến exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20 có tần suất phổ biến, tiến hành thực đề tài ? ?Khảo sát đột biến gen ATP7B (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20) bệnh Wilson kỹ. .. kỹ thuật giải trình tự Sanger? ?? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Thực quy trình khảo sát đột biến gen ATP7B (các exon 2, 8, 10, 12, 14, 16 20) phương pháp Sanger Xác định đột biến ghi nhận exon 2, 8, 10, 12,. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên đề tài : KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN GEN ATP7B (CÁC EXON 2, 8, 10, 12, 14, 16 VÀ 20) TRONG BỆNH WILSON BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ SANGER