Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6

Bởi lẽ, dù chỉ đứng thứ hai về mặt số lượng các thuốc chuyển hóa nhưng CYP2D6 lại là một trong những enzym có hiện tượng đa hình phổ biến nhất.. Enzym này đã được phát hiện từ những năm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho tôi xin được gửi tới Ths Nguyễn Xuân Bắc lời biết ơn chân

thành và sâu sắc Thầy là người đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa Sinh Trường Đại học Dược Hà Nội, các dược sỹ và bác sỹ trong bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin dành những lời tri ân tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn luôn động viên, cổ vũ tôi vượt qua những khó khăn mà có lúc tưởng chừng như muốn bỏ cuộc, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình

Hà Nội, ngày 21/5/2013

Hồ Minh Tấn

MỤC LỤC

Trang

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6 2

1.1 CYTOCHROM − P450 2

1.1.1 Phân bố 3

1.1.2 Phân loại và danh pháp 3

1.1.3 Cơ chế xúc tác của CYP 4

1.2 CYP2D6 6

1.2.1 Cấu trúc của CYP2D6 7

1.2.2 Cơ chế tác dụng của CYP2D6 8

1.2.3 Cơ chất của CYP2D6 9

1.3 GEN MÃ HÓA CYP2D6 15

CHƯƠNG 2 ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6 16

2.1 KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN 16

2.1.1 Các loại đột biến 17

2.1.2 Nguyên nhân đột biến 20

2.2 NHỮNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 25

2.2.1 Những allen của gen CYP2D6 25

2.2.2.Kiểu hình và kiểu gen CYP2D6 của các chủng tộc trên thế giới 37

2.3 HẬU QUẢ LÂM SÀNG CỦA TƯƠNG TÁC KIỂU GEN – KIỂU HÌNH CỦA CYP2D6 38

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 43

3.1 KỸ THUẬT ADN CHIP 43

3.1.1 Nguyên tắc: 43

3.1.2 Ưu điểm: 44

3.1.3 Nhược điểm: 45

3.2 KỸ THUẬT LONG-PCR 45

3.2.1 Nguyên tắc 45

3.2.2 Ưu điểm 45

3.3.3 Nhược điểm 45

3.3.4 Áp dụng xác định sự nhân đôi gen CYP2D6 46

3.3 KỸ THUẬT REAL-TIME PCR 47

3.3.1 Nguyên tắc: 47

3.3.2 Ưu điểm 48

3.3.3 Nhược điểm 48

3.3.4 Áp dụng xác định đột biến CYP2D6 48

3.4 KỸ THUẬT PCR-RFLP 49

3.4.1 Nguyên tắc 49

3.4.2 Ưu điểm 51

3.4.3 Nhược điểm: 51

3.4.4 Áp dụng trên CYP2D6 51

3.5 KỸ THUẬT PCR PHỨC HỢP 52

3.5.1 Nguyên tắc: 52

3.5.2 Ưu điểm 53

3.5.3 Nhược điểm 53

3.5.4 Áp dụng trên CYP2D6 giúp chẩn đoán allen *5 và allen*10 53

3.6 MỘT SỐ KỸ THUẬT KHÁC GIÚP XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CYP2D6 56

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 56

4.1 HIỆN TƯỢNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6 56

4.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH CYP2D6 TRÊN THẾ GIỚI 57

4.3 ĐỀ XUẤT HƯỚNG NGHIÊN CỨU CYP2D6 Ở VIỆT NAM 58

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 59

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(nếu có)

thuốc

gan

FADH2 Flavin Adenine Dinucleotide

polymorphism Đa hình đơn nucleotid

DANH MỤC BẢNG Trang

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của đa hình di truyền CYP2D6 lên một số thuốc điều trị 38

Bảng 3.1 Các mồi và enzym cắt tương ứng từng allen [79] 50 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1 Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65] 4

Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1] 5

Hình 3 Mô hình phân tử CY2D6 [100] 7

Hình 4 Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100] 7

Hình 5 Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68] 9

Hình 6 Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105] 12

Hình 7 Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37] 15

Hình 8 Mô tả các loại đột biến điểm [2] 19

Hình 9 Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [2] 20

Hình 10 Hình thành gen lai [33] 29

Hình 11 Sự lặp lại một hay nhiều lần và xóa toàn bộ gen CYP2D6 [43] 36

Hình 12 Kiểu gen CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 37

Hình 13 Kiểu hình của CYP2D6 ở các vùng địa lý khác nhau [109] 38

Hình 14 Phân loại kiểu hình dựa trên kiểu gen và hậu quả lâm sàng dựa vào kiểu xúc tác bởi hiện tượng đa hình enzym [109] 39

Hình 15 Sơ đồ minh họa một AND chip [118] 44

Hình 16 Sản phẩm Long-PCR [95] 46

Hình 17 Phổ điện di [95] 47

Hình 18 Mồi và trình tự mồi [82] 49

Hình 19 PCR-RFLP chẩn đoán đột biến 360C>G trên gen mã hóa enzym deoxycytidin kinase [144] 50

Hình 20 Các allen CYP2D6 [84] 53

Hình 21 Chẩn đoán kiểu gen bằng kỹ thuật PCR truyền thống và PCR phức hợp [84] 55

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vào cuối những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện và tập trung nghiên cứu một hệ thống enzym có vai trò vô cùng quan trọng đối với con người, đó là hệ thống cytochrom P450 hay còn được gọi là CYP450 Hệ thống enzym này là tác nhân xúc tác chuyển hóa cho các chất nội sinh như các steroid, cholesterol, các acid mật…cũng như các chất ngoại sinh có cấu trúc khác nhau trong đó có các chất độc, chất gây ung thư và đặc biệt là chuyển hóa thuốc Hiện nay người ta đã phát hiện được 57 isozym trên hệ thống CYP450 ở người và chia nó thành các họ và phân họ khác nhau

Trong số những isozym này, CYP2D6 giành được sự quan tâm đặc biệt Bởi

lẽ, dù chỉ đứng thứ hai về mặt số lượng các thuốc chuyển hóa nhưng CYP2D6 lại là một trong những enzym có hiện tượng đa hình phổ biến nhất Và những hậu quả của hiện tượng này nhiều khi rất nghiêm trọng Hơn thế nữa các nhóm thuốc điều trị được enzym này chuyển hóa như tim mạch, giảm đau, thần kinh, ung thư là những nhóm thuốc rất phổ biến hiện nay và có cửa sổ điều trị hẹp Do đó, việc hiểu biết về CYP2D6 trên các phương diện: các đột biến gen, những biến đổi ở kiểu hình, hậu quả lâm sàng kèm theo và các phương pháp phát hiện đột biến là cần thiết, góp phần vào việc “tối ưu hóa điều trị”

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Tổng quan về các đột biến gen mã hóa CYP2D6” với những mục tiêu sau:

1 Tìm hiểu các đột biến gen mã hóa CYP2D6 đã được phát hiện

2 Tìm hiểu về các phương pháp phát hiện đột biến gen CYP2D6

CHƯƠNG 1 ĐẠI CƯƠNG VỀ CYP2D6

1.1 CYTOCHROM − P450

Cytochrom – P450 (Cyt-P450) là enzym mới được phát hiện cách nay khoảng

60 năm Đây là một enzym oxy hóa cuối cùng của hệ thống monooxygenase (phản ứng oxy hóa sử dụng một nguyên tử oxy), tham gia phản ứng oxy hóa rất nhiều hợp chất khác nhau và có vai trò rất quan trọng trong chuyển hóa những chất có nhân thơm (gồm cả chất nội sinh ưa mỡ như steroid, acid béo, những vitamin tan trong dầu mỡ, prostaglandin, leukotrien, thromboxan và những chất ngoại sinh) Cytochrom – P450 thuộc nhóm b theo cách phân loại của D Keilin [53] Enzym này đã được phát hiện từ những năm 1940 trong khi các nhà khoa học đang tìm cách giải thích cho một loại phản ứng không bình thường có sự tham gia của phân

tử oxy Trong những phản ứng này, một nguyên tử oxy liên kết với hai nguyên tử hydro (được cho từ hai phân tử NADPH) để tạo thành H2O, trong khi nguyên tử oxy thứ hai được gắn vào cơ chất (kí hiệu là RH) Phản ứng có thể được biểu diễn theo công thức sau:

2 NAD(P)H+ + O2 + RH → 2 NAD(P)+ + H2O + ROH

Cytochrom – P450 khác biệt với các Cytochrom khác ở chỗ chúng chuyển thẳng điện tử đến phân tử oxy còn cytochrom khác chuyển điện tử đến các protein,

và có sóng hấp thụ cực đại ở 450nm khi gắn với CO Sự có mặt của một chất màu phản ứng với CO và đi kèm với cytochrom b5 trong microsom đã được phát hiện bởi G.R.William vào năm 1955 và Garfinkel (1958) trong quỹ học bổng Johnson và bởi Klingenberg [59] Chất màu này được đặc trưng bởi một băng hấp thụ của hợp chất với CO ở 450 nm, vì vậy gọi là P450 Để đơn giản và thống nhất về mặt thuật ngữ, người ta qui ước dùng chữ CYP thay cho Cyt-P450 Sau đó, Sato và Omura (1962,1964) đã xác định bản chất hem của nhóm ngoại của nó Loại protein chứa hem có mặt trong microsom mới được phát hiện này có những thuộc tính riêng biệt

đã được xác định là một enzym oxy hóa cuối cùng của nhiều phản ứng oxy hóa khác nhau tham gia vào một số quá trình chuyển hóa quan trọng ở cơ thể động vật:

sinh vật tổng hợp hormon steroid, acid mật từ cholesterol và chuyển hóa thuốc [85, 86]

1.1.1 Phân bố

CYP là hệ enzym gắn màng có ở hầu hết các mô trong cơ thể, trong đó tập trung nồng độ cao chủ yếu ở vi thể trên lưới nội sinh chất nhẵn của tế bào gan và một lượng ít hơn ở ruột non, phổi, thận và não

Ở người, CYP tập trung nhiều nhất ở tế bào gan CYP cũng được tìm thấy trong ti thể của thượng thận chuột cống và ở ti thể vỏ thượng thận bò [56, 132] Người ta cũng phát hiện ra rằng CYP không chỉ có ở vi thể và ti thể của động vật có

vú mà còn phân bố rộng rãi ở các dạng tồn tại khác nhau của sự sống bao gồm: động vật và vi sinh vật Những nghiên cứu về CYP tăng lên đặc biệt nhanh chóng trong nửa sau của những năm 1960, khi những nghiên cứu được tập trung chủ yếu vào chức năng của CYP trong chuyển hóa thuốc ở vi thể gan Vai trò của CYP trong

sự hoạt hóa các chất gây ung thư khác nhau (carcinogen) đã được khẳng định vào đầu những năm 1970 và nhiều nhà khoa học đang nghiên cứu các hóa chất gây ung thư chuyển sang nghiên cứu CYP, mang lại sự phát triển vượt bậc lần thứ hai trong lĩnh vực nghiên cứu này Sự phát triển quan trọng tiếp theo là những nghiên cứu làm sạch CYP từ vi thể và ti thể và dẫn tới việc tinh chế và đặc trưng được nhiều dạng khác nhau của CYP nguồn gốc động vật Hầu hết những dạng đã tinh thế này đều tham gia vào sự chuyển hóa của những chất nội sinh khác nhau, khẳng định vai trò thiết yếu của CYP trong sự chuyển hóa bình thường ở động vật [77]

1.1.2 Phân loại và danh pháp

CYP là tên chung của một “đại gia đình” các enzym gồm nhiều isozym có trọng lượng phân tử khoảng 45-60 kDa, trong đó có chứa một nhân Hem ở dạng Fe protoporphyirin IX và một chuỗi polypeptid Hệ gen người có 57 gen và 33 pseudogen mã hóa CYP Các isozym được sắp xếp lại thành họ và trong họ lại được chia thêm thành các phân họ theo sự tương đồng của chuỗi acid amin trong phân tử Các họ có ít nhất 40% trình tự giống nhau, trong khi đó các phân họ tỷ lệ này ít nhất

là 55% Mỗi họ được ký hiệu bởi một chữ số (ví dụ CYP2), mỗi phân họ được ký hiệu bởi một chữ cái viết hoa (ví dụ CYP2D) và gen đơn hoặc isozym được biểu thị bởi chữ số thứ hai ( ví dụ CYP2D6) Ngoài ra, người ta còn sử dụng chữ số thứ ba ( được ngăn cách với chữ số biểu thị isozym cụ thể bởi một dấu hoa thị *) để biểu diễn cho vị trí allen (dạng biến đổi của gen) [107]

Ví dụ:

CYP Họ Phân họ Isozym Allen

Trong 30 họ được phân loại, chỉ có 3 họ CYP là CYP1, CYP2, CYP3 chịu trách nhiệm chuyển hóa phần lớn các thuốc, trong đó riêng 6 enzym 1A2, 3A4, 2C9, 2C19, 2D6 và 2E1 đã đảm nhận chuyển hóa hơn 90% thuốc các thuốc điều trị [65, 94]

Hình 1 Tỷ lệ chuyển hóa thuốc bởi các CYP [65]

1.1.3 Cơ chế xúc tác của CYP

Cơ chế phản ứng vòng được đề xuất cho phản ứng oxygen hóa bởi CYP Theo quan điểm chung, một chu trình phản ứng oxy hóa cơ chất của hệ thống CYP có thể chia thành 6 bước chính như sau:

Hình 2: Cơ chế xúc tác của CYP [1]

 Bước 1: Cơ chất được gắn vào CYP (dạng oxy hóa) tạo ra hỗn hợp enzym-cơ chất Sự gắn cơ chất này làm biến đổi đương lượng từ của CYP từ trạng thái spin thấp (low spin) Sự biến đổi thế năng oxy hóa được gây ra bằng cách đó sẽ tạo thuận lợi cho việc chuyển của điện tử thứ nhất

 Bước 2: Là bước nhận điện tử thứ nhất từ NADPH dưới tác dụng xúc tác của enzym Cyt-P450-reductase (hoặc từ một loại protein chứa sắt- lưu huỳnh (2Fe-2S) gọi là adrenodoxin trong cơ thể vi sinh vật) tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất dạng khử

 Bước 3: Hỗn hợp enzym-cơ chất trên gắn với một phân tử O2 Trong hỗn hợp này mới có sự chuyển điện tử nội phân tử để tạo thành hỗn hợp enzym-cơ chất, trong đó sắt ở dạng oxy hóa gắn với O2-

 Bước 4: Hỗn hợp vừa tạo thành nhận điện tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử NADPH thứ hai do NADPH-reductase xúc tác hoặc từ NADH (xúc tác bởi NADH-Cytochrom b5 reductase và Cytochrom b5), ở vi sinh vật bước này do adrenoxin xúc tác Hai điện tử nhận được khử phân tử O2 trong hỗn hợp enzym-cơ chất thành hợp chất trung gian peroxo (RH) Fe3+-(O2 )

 Bước 5: Oxy được hoạt hóa sẽ phản ứng với 2H+

(do 2 phân tử NADHP+cung cấp) tạo thành phân tử nước tách ra khỏi hợp chất trung gian trên, còn lại hợp chất (RH) (Fe-O)3+

 Bước 6: Là sự oxy hóa cơ chất bằng nguyên tử oxy còn lại và giải phóng cơ chất ở dạng oxy hóa, enzym CYP trở về trạng thái Fe+3 ban đầu (dạng oxy hóa), hoàn thành một chu kì phản ứng Sản phẩm tạo ra là cơ chất được oxy hóa và một phân tử nước [1, 77]

1.2 CYP2D6

CYP2D6 được phát hiện bởi Robert Smith trường đại học Y Saint Mary Khi tham gia tình nguyện thử thuốc hạ áp debrisoquin, Smith đã bị ảnh hưởng lớn tới sức khỏe và điều đó giúp ông phát hiện ra mình bị thiếu hụt CYP2D6 [1]

CYP2D6 đóng vai trò như một enzym oxy hóa một nguyên tử oxy oxygenase) thường được tìm thấy ở trong các vi thể gan Và nó chuyển hóa tới 30

(mono-% thuốc Các nhóm thuốc quan trọng được enzym này chuyển hóa là : thuốc điều trị trầm cảm, thuốc chẹn Beta và thuốc giảm đau Đặc điểm của các thuốc này là những chất thân dầu với một nhóm amin đã được proton hóa và một vòng thơm [13] Sự sáng tỏ về cấu trúc tinh thể của CYP2D6 và việc FDA phê duyệt việc thí nghiệm kiểm tra gen đã đưa việc nghiên cứu về enzym này lên vị trí mũi nhọn [28, 119]

1.2.1 Cấu trúc của CYP2D6

Phân tử CYP2D6 là một protein gồm 479 acid amin, chứa một nhóm heme, ID trong dữ liệu Ngân hàng protein: 2f9q [100] (hình 3) CYP2D6 có một vị trí hoạt động, nằm phía trên nhóm hem (hình 4)

Hình 3 Mô hình phân tử CY2D6 [100]

Hình 4 Cấu trúc vùng hoạt động của CYP2D6 [100]

Các acid amin xoắn lại ở vùng tiếp nhận và gắn cơ chất là Asp301 (D301), Glu216 (E216), Phe483 (F483) và Phe120 (F120) (hình 4) Vai trò rất quan trọng của

D301, E216, F120 và F483 đó là nhận biết và gắn cơ chất Trong đó D301 và E216

giúp gắn kết cơ chất Còn F483 và F120 còn lại điều khiển sự liên kết phân tử cơ

chất ở vị trí hoạt hóa [91]

CYP2D6 được phát triển sau khi trẻ được sinh ra CYP2D6 hoặc hoạt tính của

nó không được phát hiện ở các tế bào gan của thai nhi mặc dù ARN CYP2D6 tăng lên cùng với sự phát triển của bào thai Lượng CYP2D6 cùng với hoạt tính của nó không liên quan đến tuổi của thai nhi và tăng lên cùng với sự phát triển của trẻ sau khi ra đời Sau khi sinh 7 ngày, hoạt tính enzym này xấp xỉ bằng 25% so với người trưởng thành Và khi một tuổi hoạt tính CYP2D6 ở gan bằng với mức ở người trưởng thành [80]

1.2.2 Cơ chế tác dụng của CYP2D6

Chức năng chính của CYP2D6 là oxy hóa thuốc thông qua cung cấp electron đầu tiên từ việc tương tác với phức hợp hem-oxy (Hình 5) Phản ứng xúc tác liên quan đến sự chèn một nguyên tử oxy vào phân tử chất nền và nguyên tử oxy thứ hai thì được chuyển thành nước

Nguồn electron được cung cấp từ phức hợp khử NADPH - cytochrom P450, đây là một flavoenzym cái chứa 1 phân tử của mỗi coenzym, flavin adenin dinucleotid (FAD) và flavin mononucleotid ( FMN) [55] FAD nhận electron từ NADPH và giảm thế, FADH chuyển electron tới FMN,[87] Sau đó electron được chuyển từ FMNH- tới phức hợp hem, làm giảm hóa trị của sắt từ +3 xuống +2 Vùng liên kết của CYP ở dạng khử này được tìm thấy ở đầu C tận của CYP2D6 Vùng này chủ yếu chứa những vị trí cơ bản, kết nối CYP ở dạng khử thông qua các cầu muối với Arg-440 đóng một vai trò kết nối rất quan trọng [6] Phản ứng oxy hóa được khởi động bởi sự hoạt hóa một phân tử oxy thông qua ion sắt 2 Phản ứng hydroxyl hóa này xảy ra ở vùng 5-7 A˚ so với nguyên tử Ni tơ trong phân tử chất nền Điều này tạo ra cặp sắt – oxy hoạt hóa, chính phức hợp này phản ứng lại với các phân tử thuốc thông qua nhiều cơ chế khác nhau [41]

Hai phức hợp phản ứng sắt – oxy chính liên quan tới phản ứng li giải là phức hợp ái điện tử “ sắt- hydroperoxo và sắt – oxo” [104] Loại “sắt – hydroperoxo” được hình thành bởi phức hợp “ dioxygen- Fe2+”, sắt- peroxo.( Như hình 5) Phức hợp sắt – oxo làm tách liên kết O – O Cơ chế phản ứng đòi hỏi sự giải phóng hợp chất trung gian, mặc dù điều này vẫn còn nhiều sự tranh cãi [68]

Hình 5 Cơ chế xúc tác của CYP2D6 [68]

1.2.3 Cơ chất của CYP2D6

1.2.3.1 Cơ chất mẫu của CYP2D6

Cơ chất mẫu của CYP2D6 thường là những thuốc đã được dùng điều trị từ rất lâu (tới nay có thể không còn dùng để điều trị nữa) và được chuyển hóa thông qua CYP2D6 Sự thay đổi trên CYP2D6 sẽ ảnh hưởng rất lớn tới tác dụng điều trị của các thuốc Khi các nhà khoa học biết được điều này cùng với sự ra đời của các phương pháp pháp hiện đột biến trên gen, họ đã tìm cách đưa ra mối quan hệ về kiểu gen và kiểu hình CYP2D6 Do đó mà các thuốc này được lựa chọn làm chất để phân loại các kiểu hình chuyển hóa nhanh (EM), chuyển hóa chậm (IM), chuyển

hóa siêu nhanh (UM) và chuyển hóa rất chậm (PM) Sự phân biệt này sẽ được trình bày cụ thể ở mục 2.3

a Spartein

Spartein và debrisoquin là hai cơ chất đầu tiên được nghiên cứu và nó cũng được sử dụng rộng rãi để xác định kiểu hình chuyển hóa chậm (PM) của CYP2D6 [138] Những nghiên cứu sớm chỉ ra rằng spartein chuyển hóa chủ yếu bởi một hệ thống các CYP thành một “N-oxid” “N-oxid” tiếp tục phản ứng, và bị mất nước để trở thành 2-dehydrospartein (ví dụ: 2,3-didehydrospartein) và 5- dehydrospartein (ví dụ: 5,6 –didehydrospartein) So sánh sự tạo thành 2-dehydrospartein ở vi thể gan người từ hai kiểu hình EM (MR < 2) và PM (MR > 20) đã chỉ ra hơn sự hơn kém nhau 32 lần đối với giá trị của hằng số thải trừ Km giữa EM và PM (58.3 và 1880 micromol/L ) [89]

Với tỷ lệ chuyển hóa của spartein (MR) = spartein thải trừ qua nước tiểu ÷ ( 2-dehydrospartein và 5- dehydrospartein thải trừ qua nước tiểu)

Ở kiểu hình PM, sự thải trừ spartein phụ thuộc hoàn toàn vào sự thải trừ của thận với tỷ lệ thải trừ 99,9% liều dùng qua thận ở dạng không thay đổi Ở kiểu hình

EM có sự tăng lên 30% chất chuyển hóa của spartein sau khi dùng rifampicin ở liệu pháp điều trị 600 hoặc 1200 mg trong 7 ngày, trong khi rifampicin không ảnh hưởng tới thải trừ spartein ở kiểu hình PM [22] Mặc dù spartein chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 (>85%) [21, 23, 69], nó cũng bị chuyển hóa bởi những CYP không được xác định Có thể những CYP này bị giảm tác dụng bởi rifampicin Điều này có thể giải thích được sự tăng thải trừ toàn phần spartein ở kiểu hình EM Cả

EM và PM đều không bị ảnh hưởng bởi liệu pháp điều trị bằng pentobarbital (phenobarbi-ton) một tác nhân gây cảm ứng mạnh tới CYP2B6 [66] Tác động không đáng kể của những enzym cảm ứng điển hình đối với sự chuyển hóa spartein chỉ ra rằng những enzym này chịu tác động chủ yếu do gen Những ca nghiên cứu

xa hơn nữa xác định rằng sự khiếm khuyết chuyển hóa spartein là do những đột

biến gen CYP2D6

b Debrisoquin

Debrisoquin là thuốc điều trị tăng huyết áp và được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 (CYP2D6 còn được gọi là tác nhân hydroxyl hóa debrisoquin) Các chất chuyển hóa của nó là: 4-hydroxy-debrisoquin, 3-hydroxydebrisoquin và 1-hydroxydebrisoquin [24] Mahgoub và cộng sự báo cáo một trường hợp thải trừ 60.8% liều ban đầu dưới dạng nguyên vẹn và chỉ 5.4% dưới dạng 4-hydrodebrisoquin, chỉ số MR là 11.3 [67] Một chuỗi các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trường hợp này là một kiểu hình PM, trong khi đó 3 trường hợp khác trong ca nghiên cứu này chỉ có MR ở mức 0.5 – 1.4 điển hình của kiểu hình EM Tỷ lệ chuyển hóa (MR) của debrisoquin (lượng debrisoquin / lượng 4-hydroxydebrisoquin trong nước tiểu thu thập trong 8h) dùng để xác định kiểu hình của CYP2D6 Ở quần thể người da trắng mức MR >12.6 được xác định là kiểu hình PM, còn mức MR < 12.6 được xác định là kiểu hình EM Có ít hơn 1% người châu Á được phân loại là PM nếu sử dụng MR của debrisoquin = 12.6 là mức để đánh giá [8] Phân bố tỷ lệ chuyển hóa debrisoquin thay đổi cao hơn ở những người châu Á có kiểu hình EM so với người da trắng có kiểu hình EM Các thí nghiệm kiểm tra kiểu hình sử dụng spartein hoặc debrisoquin có giá rẻ và đáng tin cậy tuy nhiên ngày nay không còn dùng nữa

c Dextromethorphan

Dextromethorphan một chất tổng hợp tương tự thuốc giảm đau gây nghiện được sử dụng như một thuốc giảm ho không cần kê đơn Ở người nó được thải trừ

chủ yếu dạng nguyên vẹn và dextrorphan có tác dụng dược lý ( hình 6)

Hình 6 Chuyển hóa của dextromethorphan bởi CYP2D6 [105]

Sự hình thành dextrorphan từ dextromethorphan chủ yếu do CYP2D6 thông qua việc cắt bỏ nhóm methyl qua cầu nối oxy [18, 49] Do đó dextromethorphan ngày nay được sử dụng như là một cơ chất mẫu để xác định hoạt tính CYP2D6 cả ở

in vivo và in vitro Tùy thuộc quần thể, chủng tộc mà biểu đồ tần số phân bố, giá trị

phản ánh mà có các giá trị MR tiêu chuẩn (antimode) khác nhau Giá trị MR nước tiểu = 0.3 khi sử dụng dextromethorphan làm thuốc thử để phân loại EM và PM ở người da trắng, giá trị này cũng được áp dụng cho các quần thể khác [105] Còn đối với MR huyết thanh giá trị sử dụng là 0.126 Tuy nhiên có sự chồng chéo giữa kiểu hình IM và EM khi sử dụng giá trị “antimode” bằng 0.03 [60]

như là một chỉ số để đánh giá hoạt tính hoặc mức độ của CYP2D6 và lượng hydroxybufuralol tạo thành từ bufuralol ở kiểu hình PM của CYP2D6 là rất thấp Tuy nhiên, chính bufuralol chứ không phải spartein hay debrisoquin được chuyển hóa rất mạnh bởi CYP2C19 và một phần bởi CYP1A2, điều này có thể ảnh hưởng đến sự đặc trưng của nó như một cơ chất mẫu của CYP2D6 [133] Ngoài ra, S-metoprolol cũng được sử dụng để làm chất mồi cho CYP2D6 nhưng ở qui mô nhỏ hơn

1’-e Tramadol

Tramadol là một thuốc giảm đau gây nghiện kiểu aminocyclo-hexanol, có hai trung tâm bất đối xứng cũng được sử dụng làm cơ chất mẫu cho CYP2D6 (-)-tramadol được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 thành O-desmethyltramadol (M1) trong khi (+)-tramadol thì được chuyển hóa ít hơn Một chất chuyển hóa khác của

tramadol là N-desmethyl-tramadol (M2) Những ca nghiên cứu in vitro đã chỉ ra

rằng tramadol chủ yếu chuyển hóa thành M1 bởi CYP2D6 và thành M2 bởi CYP2B6 và 3A4 [90, 117]

Giữa 5 loại cơ chất mẫu trên của CYP2D6 thì dextromethorphan và bufuralol

là hai chất được sử dụng rộng rãi trong điều kiện in vitro với tỷ lệ sử dụng bufuralol

là 60% và dextromethorphan là 30% [136]

1.2.3.2 Thuốc điều trị là cơ chất của CYP2D6

a Các thuốc tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

CYP2D6 có thể chuyển hóa một số lượng lớn thuốc có đích tác dụng là hệ thần kinh trung ương và trong chúng có nhiều thuốc với trị số điều trị hẹp [36, 141, 142] Những thuốc này bao gồm: thuốc điều trị trầm cảm ba vòng (như: amitriptylin [124], clomipramin [83], imipramin [123], doxepin [42], thuốc ức chế chọn lọc thu hồi serotonin (SSRI; như là: fluoxetin, fluvoxamin, paroxetin và sertralin), những thuốc điều trị trầm cảm không vòng khác (như là: atomoxetin, maprotilin, mianserin

và venlafaxin ), thuốc điều trị rối loạn tâm thần (như : chlorpromazin, perphenazin, thioridazin, zotepin, zuclopenthixol, risperidon và haloperidol ), nhóm opioid (như là: codein, dihydrocodein và tramadol ) Thuốc chống nôn như là tropisetron,

ondansetron, dolasetron và metoclopramid cũng được CYP2D6 chuyển hóa Tuy nhiên những CYP khác nhau thì đảm nhận vai trò khác nhau, chúng có thể đảm nhận hoàn toàn hoặc chỉ một phần Chẳng hạn như CYP1A2 và 3A4 cũng liên quan đến chuyển hóa của hầu hết thuốc điều trị rối loạn tâm thần trong khi CYP2C19, 2C9 và 3A4 lại có vai trò rất lớn đối với chuyển hóa của phần lớn thuốc ức chế thu hồi chọn lọc serotonin [141] Do đó mà ảnh hưởng của hiện tượng đa hình di truyền của CYP2D6 lên sự chuyển hóa hoàn toàn những thuốc này là rất đa dạng và phụ thuộc rất nhiều vào vai trò của CYP2D6 trong sự chuyển hóa của chúng

CYP2D6 đóng một vai trò không lớn trong sự chuyển hóa của citalopram Trong khi sự chuyển hóa qua CYP3A4 và CYP2C19 lần lượt chiếm tỷ lệ 70% và 7% Tuy nhiên CYP2D6 lại có vai trò rất quan trọng đối với chuyển hóa escitalopram- đồng phân S của citalopram Sự phân bố tương quan giữa CYP2D6, 2C9 và 3A4 tới độ thanh thải nội tại của gan (CLint) của escitalopram được ước tính theo thứ tự là 28%, 37% và 35% [125] Gepiron là một thuốc chống trầm cảm thế

hệ mới được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6,nhưng ở nồng độ thấp thì vai trò của CYP3A4 lại đóng vai trò chính [39] Một thuốc chống trầm cảm mới hơn, duloxetin, được chuyển hóa chính bởi CYP2D6 và 1A2 [110] Methadon là một thuốc chủ vận trên receptor μ, được chuyển hóa chủ yếu bởi cả CYP2D6 và 3A4 [127]

Atomoxetin, một thuốc điều trị chứng tăng động, giảm tập trung hay nicergolin – một dẫn xuất của cựa lõa mạch để điều trị mất trí nhớ cũng được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 [10, 99] Selegilin, một thuốc sử dụng điều trị giai đoạn đầu của bệnh Parkinson, trầm cảm, chứng mất trí nhớ được chuyển hóa một phần bởi CYP2D6, nhưng CYP2B6 và 2C19 mới là những enzym chính trong sự chuyển hóa thuốc này [44] Almotryptan một chất chủ vận chọn lọc receptor 5-

HT1B/1D đã được phát triển để điều trị triệu chứng của bệnh đau nửa đầu cấp là một

cơ chất của CYP2D6 [38]

b Thuốc tim mạch

CYP2D6 đóng một vai trò quan trọng trong chuyển hóa các thuốc điều trị bệnh tim mạch CYP2D6 chuyển hóa cho rất nhiều thuốc điều trị loạn nhịp tim (như là: spartein, propafenon, encainid, flecainid, cibenzolin, aprindin, lidocain, procainamid và mexiletin) và thuốc chẹn β (như là: atenolol, bufuralol, carvedilol, metoprolol, bisoprolol, propranolol, bunitrolol, bupranolol, timolol andalprenol) [36, 141]

c Những thuốc khác

Tamoxifen được chuyển hóa bởi CYP2D6 thành endoxifen, một chất chuyển hóa có tác dụng dược lý thông qua hai quá trình cắt bỏ nhóm methyl và gắn vào nhóm hydroxyl (“N-demethylation” và “4-hydroxylation”) liên tục [9, 19] Các thuốc kháng histamin, chống dị ứng hay kháng cholinergic cũng được CYP2D6

chuyển hóa

CYP2D6 chiếm 1 vùng 4.2 kb trên nhiễm sắc thể 22 ở vị trí q13.1 và chứa 9

đoạn exon và 8 đoạn intron Nó bao gồm 1491 cặp base mã hóa cho 497 acid amin

Nằm cùng trên nhiễm sắc thể 22 còn có 2 pseudogen là CYP2D8P và CYP2D7P

[37]

Hình 7 Vị trí CYP2D6 trên nhiễm sắc thể [37]

CHƯƠNG 2 ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6

2.1 KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ĐỘT BIẾN GEN

Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột Một đột biến gen là một sự thay đổi trong trình tự nucleotid trên gen, dẫn đến kết quả là tạo

ra một protein đột biến với trình tự acid amin thay đổi hay tác động đến quá trình điều khiển sự tổng hợp của các sản phẩm gen Nếu protein đột biến có chức năng khác với dạng tự nhiên thì sẽ tạo ra một sự thay đổi tương ứng ở những đặc tính có thể quan sát được và tạo ra thể đột biến Sự khác biệt có thể do hoạt tính hay tính ổn định của enzym Một số đột biến có thể tồn tại trong quần thể bên cạnh các dạng tự nhiên làm thành một thể đa hình [4]

Đột biến xảy ra ở các tế bào không sinh sản được gọi là đột biến sinh dưỡng

và tạo ra các thay đổi có tính cục bộ, không di truyền được như các u sắc tố ngoài

da người tạo ra nốt ruồi Những đột biến sinh dưỡng có thể là nguyên nhân gây ra ung thư và có thể là nguyên nhân của sự lão hóa

Đột biến xảy ra trong giao tử được gọi là đột biến dòng mầm và được truyền cho đời sau Khi nghiên cứu các đột biến giao tử và đo tỷ lệ đột biến ở sinh vật đa bào nói chung và người nói riêng cần xét đến tính lưỡng bội Hầu hết các đột biến gen là đột biến lặn và sẽ không được phát hiện nếu hợp tử không có hai bản của allen đột biến Do đó việc phát hiện và đo tần số đột biến phải dựa vào quan sát các đột biến trội đang xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, các đột biến lặn và trội trên nhiễm sắc thể X

Ví dụ: chứng loạn sản sụn xảy ra rải rác là bởi các đột biến mới trong gen của thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi Trong 1 năm có 7 trẻ sơ sinh bị loạn sản sụn trên tổng số 242257 trẻ sơ sinh , tỷ lệ là 7/242257 × 1/2 ( 2allen/ hợp tử) =1,4 × 10^-5

Trong tự nhiên, dù trong điều kiện nào tất cả các gen đều có đột biến được gọi

là đột biến tự nhiên hay đột biến tự phát Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất

ít Các gen khác nhau của cùng một sinh vật có thể có tần số đột biến khác nhau nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen là ổn định

Tần số đột biến được đánh giá căn cứ trên một lần sao chép, một lần phân bào hay trên một giao tử và trên một tế bào trong một thế hệ Tuy tần số đột biến của từng gen rất thấp nhưng tổng các đột biến của nhiều gen lại là một số đáng kể, có ý

nghĩa quan trọng trong tiến hóa Các kết quả nghiên cứu in vivo và in vitro trên tế

bào người khoảng 10-6/gen/thế hệ Ước tính các thay đổi xảy ra trong mỗi thế hệ dựa vào tỷ lệ đột biến ở người như sau: 10-6 đột biến/gen*5.104 gen/ bộ gen đơn bội bằng 5.10-2 đột biến /giao tử (1/20) Mỗi hợp tử có (1/20) 2=1/10 cơ hội xảy ra đột biến gen Con số này có vẻ rất cao nhưng cần nhớ rằng hầu hết các đột biến là lặn

và như vậy sẽ không được biểu hiện trong điều kiện dị hợp tử Sự thay đổi các base

có thể xảy ra trong vùng không mã hóa của phân tử ADN và các acid amin bị thay đổi cũng có thể không phải lúc nào cũng làm thay đổi đặc tính protein Do vậy ,thay đổi trình tự nucleotid có thể không biểu hiện thành sự khác biệt tính trạng và do đó không phải là đối tượng của chọn lọc Các đột biến lặn tích tụ trong bộ gen

Hầu hết các đột biến là bất lợi và do đó các cơ chế đặc hiệu thường được dùng

để giảm thiểu các biến đổi trong chuỗi ADN hoặc hoàn phục trình tự gốc bằng cách sửa chữa đột biến

Phổ biến nhất là chuyển vị, pyrimidin được thay thế bởi pyrimidin khác hay

purin bởi purin khác ( A⇌G , C⇌ T ) Sự chuyển vị, bắt cặp sai có thể gây ra bởi

các acid nitro hoặc các đồng đẳng base như 5-bromo-2-deoxyuridin ( BrdU) Các đột biến điểm ít phổ biến hơn là đảo chuyển, pyrimidin được thay thế bởi purin hay

purin bởi pyrimidin (C/T ⇌ A/G) Đột biến điểm có khuynh hướng đặc trưng là đột

biến điểm có khuynh hướng đặc trưng là đột biến lùi (hồi biến), nghĩa là chuyển lại dạng nguyên thủy Điều này xảy ra vì lần đột biến tiếp theo tại cùng một điểm có một phần ba cơ hội quay lại chuỗi ban đầu Có ba loại đột biến điểm tùy theo codon mang đột biến mã hóa:

 Độ biến lặn hay còn gọi là đột biến đồng nghĩa: mã hóa cho cùng acid amin, không ảnh hưởng đến protein cuối Ví dụ, codon GCA hoặc GCG trong mARN đều mang nghĩa là arginin ( Loại này thường đúng với đột biến chuyển vị ở trí thứ 3-base” linh hoạt” của codon )

 Đột biến sai nghĩa : Mã hóa cho các acid amin khác, có thể làm protein không có chức năng Ví dụ, trong chuỗi protein β-globulin gây bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, GAG mã hóa cho glutamat, nếu thay bằng GUG sẽ mã hóa cho valin Đột biến lệch nghĩa có thể gây hậu quả rất nghiêm trọng như thiếu máu tế bào lưỡi liềm, hoặc nhẹ như hemoglobin C ( acid amin vị trí 6 của β-globulin bị thay thế bởi acid amin khác) hoặc không có kiểu hình

 Đột biến vô nghĩa: Mã hóa cho codon kết thúc, có thể làm cụt protein Tác động của các đột biến vô nghĩa tùy thuộc protein bị cụt bao nhiêu và mức độ cần cho hoạt động của protein

Đột biến thay thế base có thể xảy ra trong promoter hoặc các vùng điều hòa 5’ của gen hoặc trong intron và có thể ảnh hưởng tới sự phiên mã , dịch mã hoặc mức xoắn bện của ADN Nhiều β-thalassemia là hậu quả của các đột biến không cấu trúc này ảnh hưởng mức biểu hiện các gen globin Mức dộ ảnh hưởng tùy thuộc nucleotid bị thay thế và vị trí của nó trong ADN [2]

Hình 8 Mô tả các loại đột biến điểm [2]

((A) Đồng nghĩa (silent); (B, C)Sai nghĩa (missense); (D) Vô nghĩa (nonesense))

Đột biến lệch khung

Các đột biến này do chèn hoặc mất một hoặc nhiều nucleotid trong vùng mã hóa của gen Điều này làm thay đổi khung đọc, vì các codon là các nhóm ba nucleotid nên có thể có ba khung đọc nhưng chỉ một cái được dùng Đột biến loại này thay đổi tất cả các acid amin phía sau đột biến và rất dễ tạo sản phẩm không chức năng vì khác hẳn với các protein thường Ngoài ra, các khung đọc sai thường chứa các codon stop, sẽ làm quá trình tổng hợp protein dừng sớm

Việc thêm hay bớt một nucleotid vào khung đọc sẽ làm thay đổi các acid amin

kể từ đó trở đi Nếu đột biến thêm hoặc bớt cùng xảy ra trên một phân tử ADN thì

do trao đổi chéo giữa các base tương đồng mà đột biến âm có thể sửa chữa lại khung đọc sai do đột biến dương gây ra Nhờ đó chỉ có acid amin nào nằm giữa hai điểm đột biến bị sai mà thôi Như vậy đột biến âm đã tác động như một đột biến kìm hãm ngoài gen đối với đột biến dương hoặc ngược lại

b Đột biến đa điểm

Các đột biến đa điểm là những thay đổi tác động đến hơn một base, thay đổi từ hai đến hàng ngàn base, nhưng thường nhất là chỉ vài base Hậu quả thường là xóa

bỏ một phần của trình tự mã hóa Đột biến đa điểm không có tính hồi biến, nghĩa là đột biến được ổn định

Sự xóa mất đoạn lớn sẽ làm thay đổi hoàn toàn protein tạo ra, thậm chí xóa bỏ đoạn ngắn cũng gây hậu quả nghiêm trọng nếu nó làm thay đổi khung đọc Hình mô tả sự mất một đoạn gen lớn ở bệnh nhân ung thư phổi

Hình 9 Gen EGFR trong ung thư phổi: p.T751_I759>N [2]

Sự chèn đa điểm có thể xảy ra do gen nhảy hoặc lỗi khi sao chép của các yếu

tố lặp lại ( ví dụ các lặp lại AT) Hầu hết khi gen bị chèn sẽ bị lệch khung hoặc thay đổi kết nối trong mARN, cả hai trường hợp này đều làm thay đổi sản phẩm của gen Gen nhảy dài tới vài ngàn base (kb) và vì vậy , nó làm ngưng quá trình sao mã và dịch mã của bất kì gen nào chúng xen vào Gen nhảy có hai loại, retrotransposon và transposon Các transposon có thể di chuyển trực tiếp từ vị trí này sang vị trí khác của bộ gen, retrotransposon trước hết được phiên mã thành ARN và sau đó lại thành ADN bởi enzym phiên mã ngược và chèn lại vào bộ gen Transposon rất có ích cho các nhà nghiên cứu làm công cụ để biến đổi ADN trong cơ thể sống

2.1.2 Nguyên nhân đột biến

Có hai loại đột biến là đột biến tự nhiên ( xảy ra một cách tự phát )và đột biến cảm ứng( gây ra bởi các tác nhân đột biến)

a Đột biến tự nhiên

Xảy ra trong tự nhiên một cách ngẫu nhiên với tần số nhất định và không xác định được nguồn gốc Bất kì một tiến trình nào dẫn đến sự gắn sai base trong quá trình sao chép ADN sẽ tạo ra một đột biến điểm Tấn suất sai sót tự nhiên vào khoảng 10-10 base Tỷ lệ thấp này đạt được nhờ khả năng sửa lỗi của các ADN polymerase chủ yếu Các enzym này kéo dài ADN theo hướng 5’ → 3’ nhưng có hoạt tính exonuclear 3’ → 5’ Nếu lỗi nằm giữa base được chèn cuối cùng với sợi khuôn được phát hiện, enzym loại bỏ base sai và thay thế base đúng vào Chuỗi mã của một protein trung bình 300 acid amin là khoảng 1000 base chiều dài Tỷ lệ đột

biến tự phát là một trong 107 bản mã sao của gen sẽ có một đột biến điểm, nghĩa là

10-7 tế bào sẽ có đột biến về gen đó

Đột biến tự nhiên ở mức phân tử gồm có hỗn biến, khử amin, chuyển vị, đảo chuyển, đột biến lệch khung, oxy hóa phá hủy

 Hỗn biến: 4 loại base trong ADN có thể tồn tại ở dạng hỗn biến, tức là có

khả năng tồn tại hoán chuyển giữa hai dạng ( Keto ⇌ Enol và Amino ⇌ Imino)

Base pyrimidin bình thường có dạng keto (C = O) , nhưng đôi khi chúng cũng có dạng enol (C – OH) Ở dạng enol, thymin có thể bắt cặp với guanin và enol cytosin

có khả năng bắt cặp với adenin, tương tự base purin bình thường tồn tại dưới dạng amino (NH2) nhưng cũng có dạng hỗn biến imino (=NH) hiếm gặp, có thể dẫn đến

sự bắt cặp nhầm Nếu trong khi ADN sao chép, G ở dạng enol, polymerase sẽ thêm

T vào thay vì bình thường là C vì qui luật bắt cặp bị thay đổi ( không phải do lỗi của polymerase) Kết quả là sự chuyển vị G – C thành A – T; sự hỗn biến chỉ gây các đột biến chuyển vị

 Khử amin: Các phản ứng khử amin thông thường là phản ứng thủy phân cytosin thành uracil, quá trình này phóng thích ammonia và khử amin 5-methylcytosin thành thymin và ammonia Trong ADN, sự khử amin cytosin tự phát được chỉnh lại bằng cách loại bỏ uracil (vì uracil không có trong ADN) và thay thế bằng cytosin, còn sự khử amin 5- methylcytosin không được chỉnh vì cơ chế sửa chữa không nhận thymin là lỗi Trong ADN bộ gen cytosin tại các trình tự CG ( CpG) thường bị methyl hóa, điều này là ở đâu CpG xảy ra trong gen, nó là “điểm nóng” cho đột biến Mới đây người ta tìm thấy gen liên quan đến loạn sản sụn có những điểm nóng như vậy

 Đột biến lệch khung (chèn hoặc mất trên một sợi), thường là lỗi của polymerase khi sao chép các đoạn lặp lại của một nucleotid Mỗi polymerse có độ

chính xác khác nhau Yếu tố chính ảnh hưởng đến độ chính xác của polymerse là có hoạt tính exonuclease đọc sửa 3’ – 5’, làm loại bỏ các base bắt cặp không đúng chèn vào bởi polymerase

 Oxy hóa phá hủy do các gốc oxy Các gốc oxy tăng trong tế bào do chuyển hóa oxy hóa (và cũng được tạo bởi các tác nhân vật lý như tia phóng xạ ) Sản phầm oxy hóa quan trọng là 8 – hydroxy guanin bắt cặp sai với A, tạo đảo chuyển G – C thành T – A

b Đột biến cảm ứng

Các tác nhân là tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là tác nhân gây đột biến Các tác nhân này có thể làm thay đổi trình tự ADN Các tác nhân đột biến cảm ứng được chia thành các tác nhân hóa học và các tác nhân vật lý [2]

Tác nhân hóa học gây đột biến:

Có thể được chia ra làm 4 nhóm:

 Nhóm base đồng đẳng

- Bromouracil (BU) là hợp chất nhân tạo dùng rộng rãi trong nghiên cứu Giống với thymin ( có nguyên tử Br thay cho nhóm methyl) và sẽ gắn vào ADN và bắt cặp với adenin giống như thymin Có nhiều khả năng hỗ biến thành dạng enol(

BU∗)và có khả năng bắt cặp với guanin Như vậy, BU có thể xâm nhập và bắt cặp

bổ sung với adenin và thay cho thymin tạo A – BU và ở vòng sao chép tiếp theo BU

hỗn biến thành BU∗ và bắt cặp với guanin tạo BU∗ - G, do đó A –T được thay thế

thành G – C Trong khi đó BU∗ lại có thể xâm nhập sai, khi gắn thay chỗ cho

Cytosin tạo G - BU∗, sau đó BU∗ lại hỗn biến thành BU và tiếp theo bắt cặp với

adenin tạo A – BU và ở vòng sao chép tiếp theo adenin bắt cặp với thymin thành A – T

- Aminopurin là đồng đẳng của adenin, có thể bắt cặp với thymin hoặc với cytosin, gây chuyển vị A – T thành G – C hoặc G – C thành A – T Các đồng đẳng base gây chuyển vị như gây hỗn biến tự phát

 Các chất hóa học thay đổi cấu trúc và đặc tính bắt cặp của các base, gồm: Các chất khử amin và các chất alkyl hóa

- Các chất khử amin Ví dụ điển hình : các acid nitrơ tạo bởi sự phân giải các nitrit (chất bảo quản) trong thực phẩm làm cytosin thành uracil, methylcytosin thành thymin, và adenin thành hypoxanthin khử amin, hypoxanthin trong ADN bắt cặp với C gây chuyển vị Methylcytosin có mặt trong các gen của vi sinh vật bậc cao có thể ảnh hưởng đến hoạt tính phiên mã Các base ngoại như xanthin, hypoxanthin và uracil có thể khởi động cơ chế sửa chữa Thymin, dẫn xuất từ methylcytocin nội sinh và nhiều sự chuyển vị có thể xảy ra theo cách này Các gốc 5 – methylcytosin, sau đó trở thành “điểm nóng” của sự đột biến Hydroxylamin (NH2OH) chỉ khử amin của cytosin, do đó tác động rất giới hạn:

Cytosin NH2OH 4-N- Hydroxycytosin, bắt cặp với adenin

- Chất alkyl hóa Ví dụ điển hình: Nitrosoguanin (NTG), methyl methan sulfonat (MMS), ethyl methan sulfonat (EMS ) là các tác nhân hóa học gây đột biến

phản ứng với các base và thêm nhóm ethyl hoặc methyl gọi là các tác nhân alkyl hóa Tùy yếu tố bị tác động, chúng có thể gây đột biến ít nhất bằng 3 cách:

 Thêm nhóm methyl (-CH3) hay ethyl (-C2H5) vào guanin tạo base đồng đẳng của adenin dẫn tới sự bắt cặp bổ sung sai

 Mất purin do guanin đã bị alkyl hóa tạo lỗ hổng trên ADN , khi sao chép có thể làm đứt mạch

 Liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các phân tử ADN khác nhau làm mất nucleotid

 Nhóm chèn vào ADN (tác nhân làm lệch khung)

Nhóm này gồm các chất proflavin, cam Acridin, ethidiumbromide dùng trong phòng thí nghiệm làm chất nhuộm Tất cả đều là các phân tử đa vòng phẳng tương tác với các base của ADN và chèn vào giữa chúng Sự chèn này làm” dãn “ sợi đôi ADN và ADN polymerase bị “đánh lừa” chèn base vào đối diện nhiều hơn bình thường, làm lệch khung ADN tạo thành

 Các tác nhân thay đổi cấu trúc ADN

- Các chất hóa học gây đứt ADN ví dụ như các peroxid

- Các hydrocarbon đa vòng Ví dụ các benzypyrene có trong xăng

Tác nhân vật lý gây đột biến

Các bức xạ có bước sóng khác nhau như là tia X, tia gamma, hạt phóng xạ α, β gây ra đột biến khác nhau Nhưng ảnh hưởng của chúng lên ADN thông qua các gốc tự do và tác động trực tiếp:

 Đứt một hoặc cả hai sợi

 Phá hủy các base

 Liên kết chéo trong ADN

2.2 NHỮNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6

2.2.1 Những allen của gen CYP2D6

Có ít nhất 74 đột biến allen khác nhau của CYP2D6 ( *2 tới *75 ) và một loạt

các đột biến nhỏ đã được tìm ra và miêu tả bởi hiệp hội Human Cytochrome P450

Allele Nomen-clature Và có 196 đa hình đơn nucleotid của CYP2D6 đã được miêu

tả ở cơ sở dữ liệu National Center for Biotechnology Information SNP với ít nhất 52

đa hình đơn nucleotid không đồng nghĩa đã được báo cáo có thể có tác động lên

protein [128] Xét theo chức năng, những allen của CYP2D6 có thể được phân loại

thành 3 nhóm: những allen gây tăng hoạt tính, những allen gây ra mất hoặc giảm chức năng và những allen có chức năng bình thường Những biến đổi này được hình thành từ những kiểu đột biến quan trọng như: mất hoặc thêm, sắp xếp lại gen, xóa

gen, lặp lại một hoặc nhiều lần gen CYP2D6 Sự phân bố của những allen này vào các quần thể khác nhau là rất khác nhau *1A được xem như là allen bình thường

dùng để đối chiếu với các allen khác

a Những allen CYP2D6 vô nghĩa

Những allen vô nghĩa không tạo ra các protein hoặc có tạo ra protein nhưng

không tìm thấy vùng có hoạt tính enzym Những allen *3, *4, *5, *6, *7, *8, *11,

*13, *14, *15, *16, *18, *19, *20, *21, *38, *40, *42, *44, *56, *62 mã hóa ra các

protein không có hoạt tính enzym Chúng gây ra kiểu hình PM khi ở kiểu hình đồng hợp tử hoặc dị hợp tử Những allen này là gây ra những hậu quả lâm sàng rõ rệt như thay đổi độ thanh thải của thuốc và đáp ứng thuốc Trong những allen vô

nghĩa thì *3, *4, *5, *6 chiếm tỷ lệ gần 97% tất cả những allen gây ra kiểu hình PM

ở người da trắng [101]

Cơ chế của việc các allen vô nghĩa này làm mất toàn bộ chức năng của enzym là :

 Đột biến một base hoặc chèn / xóa một đoạn nhỏ cái phá vỡ khung đọc hoặc ngăn cản việc ghép nối đúng, dẫn tới sớm tổng hợp protein cuối cùng / stop codon (

Ví dụ: CYP2D6*3, *4, *6, *7, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *56 và

*62 [52]

 Mất chức năng toàn bộ chiều dài allen mã hóa ( Ví dụ: CYP2D6 *12, *14 và

*18) [25].

 Xóa toàn bộ một đoạn gen hoặc xóa một chuỗi rất lớn ( Ví dụ: CYP2D6 *5 )

 Hình thành một gen lai ( Ví dụ: *13 và *16 có sự mất một đoạn chuỗi lớn là hậu quả của gen lai CYP2D7- 2D6) [30]

Allen vô nghĩa do đột biến một base hoặc chèn / xóa một đoạn nhỏ

 CYP2D6*3A đã được khám phá ở những người da trắng có kiểu hình PM đối với debrisoquin [52, 111] Đột biến allen *3 dẫn tới xóa base A ở vị trí 2549 trên

exon 5, gây ra sự phá vỡ khung đọc, và sẽ giải thích được sự mất chức năng và mất CYP2D6 ở kiểu hình PM do sớm tổng hợp protein kết thúc ở những cá thể dị hợp

tử CYP2D6 ∗3B chứa thêm một đột biến 1749 A>G gây ra một trường hợp N166D

(Asparagin được thay bằng Asparatic ở vị trí 166 trên protein) [72] Ảnh hưởng chức năng của allen này vẫn chưa được biết đến

 Đột biến ở allen *4 xảy ra với tần suất 22% và chiếm nhiều hơn 75% các đột

biến ở người Thụy Điển da trắng [14] Tuy nhiên allen này xảy ra ở tần suất thấp ở người Trung Quốc (~ 1%) [129] và người châu Phi ( 3.9%) và đây là lý do của việc

tỷ lệ thấp của kiểu hình PM ở người Trung Quốc (~1%) và châu Phi (0-5%) [74, 108], trong khi tỷ lệ này ở người da trắng là 5-10% Gaedigk và cộng sự xác định

một trường hợp allen CYP2D6*4 không có đa hình đơn nucleotid 100C>T và

4180G>C [31] Thể đa hình di truyền 4180G>C được phát hiện ở tất cả các allen

CYP2D6*4 ngoại trừ CYP2D6*4J Trường hợp này là một kiểu hình PM với kiểu

gen CYP2D6 ∗4/∗4, người đã được xác nhận có bộ gen dị hợp tử có đột biến

100C>T

 CYP2D6*7 có sự biến đổi ở vị trí 2935A>C trên exon 6 của gen CYP2D6

gây ra sự thay thế H324P [26] Những đột biến này liên quan tới kiểu hình PM đối với spartein và xảy ra ở người da trắng với tần suất gần 1% Khi sự thay đổi H324P được hình thành từ cDNA bởi vị trí đột biến gene trực tiếp, không có phổ CYP nào

có khả năng phát hiện được tạo thành và không có hoạt tính chuyển hóa bufuralol

và spartein được phát hiện.Hơn nữa, trái với dạng protein tự nhiên, protein đột biến hầu như chỉ nằm ở vùng chất ly giải không tan của mảnh vỡ tế bào Những kết quả này khẳng định rằng sự thay thế H324P chịu trách nhiệm về kiểu hình PM trong cơ

thể sống có liên quan đến allen CYP2D6*7 bằng cách ngăn cản sự gấp nếp bình

thường của protein và sự sát nhập với nhân hem

 CYP2D6*11 được xác định từ quần thể người Pháp chứa các đột biến

883G>C, 1661G>C, 2850C>T và 4180G>C [73] Đột biến 883G>C làm phá hủy vùng tiếp nối, gây hậu quả thiếu hụt enzym Sự chuyển vị ở 2850C>T và 4180G>C gây ra sự thay đổi R296C và S486T

 CYP3D6*19 với sự xoá 4 base từ 2539 đến 2542 (AACT), được xác định từ

quần thể người da trắng [72] Sự xóa này làm phá vỡ cấu trúc ở vị trí 255 trên

protein và tạo ra một enzym mất hoạt tính CYP2D6*20 là một allen hiếm với sự

chèn G vào giữa vị trí 1973 và 1974 gây phá vỡ cấu trúc ở vị trí 211 trên protein Đột biến này dẫn tới kiểu hình PM [70]

 CYP2D6*56 được xác định có sự thay đổi ở 3201C>T trên exon 7 Theo qui

luật nó sẽ tạo ra Arg344 (CGA), nhưng bây giờ được thay thế bởi một stop codon (TGA) và gây ra một CYP2D6 thiếu 153 amino acid ở cuối [64] Hậu quả là enzym

bị mất hoạt tính

 CYP2D6*62 là allen đột biến trong đó xảy ra sự thay thế 4044C>T và gây ra

sự biến đổi R441C trên protein, làm mất sự gắn kết với nhân hem Các cá thể có đột biến này được chứng minh giảm hoạt tính oxy hóa spartein [58]

Những allen mã hóa không còn chức năng đầy đủ

 CYP2D6*12 là allen được phát hiện từ quần thể người Pháp, chứa các đột

biến 124G>A, 1661G>C, 2850C>T và 4180G>C [71] Sự chuyển vị 124G>A, 2850C>T và 4180G>C theo thứ tự gây ra các biến đổi G42R, R296C và S486T trên protein Protein bị đột biến bị mất hoàn toàn hoạt tính chuyển hóa spratein, dẫn tới kiểu hình PM

 CYP2D6*14A là allen chứa các đột biến 100C>T, 1758G>A, 2850C>T và

4180G>C, được tìm thấy đầu tiên ở người Trung Quốc và sau đó là quần thể người châu Á [61, 130] Có 4 acid amin bị thay đổi ở CYP2D6.14 là: P34S, G169R, R296C, và S486T, với G169R là biến đổi duy nhất chỉ gặp ở protein đột biến này [16, 130] Hai sự thay đổi P34S và S486T có sự trùng hợp với sự thay đổi ở

CYP2D6.10 Một người Trung Quốc có kiểu gen CYP2D6*5/*14 đã được chỉ ra là

có kiểu hình PM với tỷ lệ chuyển hóa MR >12 đối với debrisoquin [130] Một nghiên cứu chức năng gần đây cho thấy không phát hiện được hoạt tính của

CYP2D6.14A khi chuyển hóa bufuralol và dextromethorphan [102] CYP2D6*14B cũng chứa intron 1 hoán đổi với CYP2D7 (base nucleotid từ 215- 245) ngoài 4 SNP trong CYP2D6 ở phía trên Allen này được tìm thấy ở người Trung Quốc với tần

suất 2.0% Allen *14B khác với những allen ∗14 khác đó là sự thiếu chuyển vị

188C>T thay vào đó 1749G>C được thêm vào Trái với allen *14A, allen *14B có

hoạt tính enzym đáng kể, đấy có thể là do sự vắng mặt của sự thay thế P34S [50]

 Allen CYP2D6*18 là allen có 9 base được chèn vào ( GTGCCCACT) từ

4125 tới 4133 trên exon 9 và được tìm thấy đầu tiên ở quần thể người Nhật Allen

này liên qua đến kiểu hình PM Hằng số Km đối với sự hydroxyl hóa bufuralol thực hiện bởi CYP2D6.18 cao gấp 236 lần so với mức bình thường (990 so với 4.2μmol/L ) [102, 134]

Sự xóa toàn bộ đoạn gen

 CYP2D6*5 là đột biến xóa toàn bộ đoạn gen và có tần suất tương tự nhau ở

các quần thể khác nhau ( 4 – 7% ) [30, 116] Đây là đột biến bất hoạt allen phổ biến thứ hai ở người Anh và tần suất của nó ở quần thể người da trắng là 4% [81] Đối với người Trung Quốc tần số xuất hiện đột biến này là 7.2% [50] Gaedigk và cộng

sự đã xác định sự xóa toàn bộ đoạn gen dài 11.5kb trên gen trong đó có chứa

CYP2D6 và không tìm thấy CYP2D6 trong gan [30]

Hình thành gen lai

 CYP2D6*13 là allen lai chứa exon 1 của CYP2D7 và exon 2 – 9 của gen CYP2D6 được xác định đầu tiên ở quần thể người Pháp, gây ra kiểu hình PM [92]

 Allen CYP2D6*16 cũng là một gen lai chứa exon 1 – 7 của CYP2D7 và

exon 8 - 9 của CYP2D6 [17]

Cả hai gen lai này đều tạo ra sự xóa một đoạn lớn gen do sự trao đổi chéo bất thường hoặc cơ chế mất sự móc nối

Hình 10 Hình thành gen lai [33]

b Allen mất chức năng một phần

Những allen CYP2D6*10, *14, *17, *18, *36, *41, *47, *49, *50, *51, *54,

*55, *57 gây ra sự giảm đáng kể hoạt tính enzym Nguyên nhân là do sự giảm tính

ổn định của protein, phá vỡ cấu trúc vùng gắn cơ chất, hoặc giảm ái lực cơ chất – enzym Sự thay đổi hoạt tính enzym có thể phụ thuộc cơ chất đối với vài allen như

*17 Các trường hợp cụ thể có thể gây ra kiểu hình PM hoặc IM

 Allen *10 xảy ra với tần số 33 – 43 % đối với người châu Á bao gồm người

Nhật, Hàn Quốc và Trung Quốc [11, 48, 50] Tuy nhiên tần số này ở người da trắng

và người Mỹ gốc Phi và những quần thể khác (ví dụ như Ấn Độ) là 2 – 5% [63]

Allen *10A chứa đa hình đơn nucleotid 100C>T gây ra sự thay đổi P34S ở vùng

giàu Prolin (‘PPGP) gần nhóm NH2 cuối cùng của protein và liên quan tới tỷ lệ

thanh thải thấp spartein (MR > 1.5) trong các thử nghiệm in vivo [135] Những cá thể đồng hợp tử *10/*10 yêu cầu mức liều metoprolol và nortriptylin thấp hơn cá thể có kiểu gen *1/*1 để tạo ra hiệu quả lâm sàng tương tự [45, 137] Vị trí P34 có

thể hoạt động như bản lề giữa vùng màng kị nước và vùng liên kết với nhân hem của enzym Đa hình đơn nucleotid 100C>T tạo ra một protein không ổn định có hoạt tính enzym giảm đối với chuyển hóa debrisoquin, bufuralol và dextromethorphan Allen này cũng chứa các đột biến 1661G>C và 4180G>C gây ra đột biến S486T trên protein [102] Shen và cộng sự đã khám phá ra hoạt tính xúc tác của CYP2D6.10 đối với một loạt các cơ chất Ông đã tìm ra rằng giá trị CLint

của sự hydroxyl hóa bufuralol tại vị trí carbon 1 (bufuralol 1’ – hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi dextromethorphan qua cầu nối oxy (dextromethorphan O-demethylation), hydroxyl hóa debrisoquin ở vị trí carbon 4 (debrisoquin 4- hydroxylation), hydroxyl hóa atomoxetin ở carbon 4 (atomoxetin 4- hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi S-fluoxetin qua cầu nối ni tơ (S-fluoxetin N-demethylation), hydroxyl hóa nortriptylin ở carbon 10 (nortriptylin 10-hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi tramadol qua cầu nối oxy (tramadol O-demethylation) và cắt nhóm methyl khỏi codein qua cầu nối oxy (codein O-demethylation) bởi CYP2D6.10 đã lần lượt giảm xuống còn 3.65%, 5.29%, 11,84%, 8.58%, 7.54%, 1.32%, 6.90% và 27.86% so với protein bình thường

Sự nhân đôi allen CYP2D6*10 (*10 × 2 ) đã được tìm thấy đầu tiên ở quần thể

người Trung Quốc nhưng hoạt tính của enzym lại giảm [35, 50] Tần số của allen này ở người Nhật Bản khá thấp (0.6%) [78]

 Allen *17 xảy ra với tần số cao ở người Châu Phi và người Mỹ gốc Phi

nhưng lại hầu như không xuất hiện ở người da trắng [11] Tần số của allen này ở quần thể người Zimbabwe là 34% [75], người Tanzania là 17% [131], người Ghana

là 28% [40] Hơn 10% người Zimbabwe có kiểu gen đồng hợp tử với allen này

Những biến đổi này đã giải thích tại sao người Châu Phi có chỉ số MR trung bình cao hơn người da trắng [63]

Allen CYP2D6*17 chứa 4 SNP là : 1023C>T trên exon 2; 1661G>C trên exon

3 (một SNP đồng nghĩa); 2850C>T trên exon 6 và 4180G>C trên exon 9 Kết quả khi dịch mã lần lượt gây ra các sự thay thế: T107I, R296C và S486T [75] So sánh

với CYP2D6*2 thì CYPD6*17 có thêm 1 sự thay đổi T107I Sự thay đổi này xảy ra

ở vùng β – helix và vị trí 107 có thể liên quan đến vùng nhận cơ chất Một thí

nghiệm in vivo đã chỉ ra rằng allen này gây ra sự giảm hoạt tính phản ứng hydroxyl

hóa debrisoquin [75] Sự biểu hiện của cADN trong COS-1 cell đã tiết lộ enzym CYP2D6.17 thể hiện chỉ 20% hoạt tính so với dạng tự nhiên, trong khi sự thay đổi một mình T107I không có ảnh hưởng đáng kể đến chức năng enzym [88] Enzym chứa cả đột biến T107I và R296C có chỉ số Km đối với bufuralol cao hơn 5 lần so kiểu hình bình thường, trong khi đó đột biến S486T không gây ra ảnh hưởng Trái lại khi codein được dùng làm cơ chất, đột biến T107I một mình nó cũng đủ gây ra

sự tăng hằng số Km biểu kiến, điều này chỉ ra rằng ảnh hưởng khác biệt của các đột biến này phụ thuộc vào cơ chất của CYP2D6 được sử dụng CYP2D6.17 có hằng

số Km biểu kiến đối với codein cao gấp 5-10 lần so với enzym bình thường Shen

và cộng sự đã khám phá ra hoạt tính xúc tác của CYP2D6.17 đối với một loạt cơ chất Ông đã chỉ ra rằng giá trị CLint của sự hydroxyl hóa bufuralol, cắt nhóm methyl khỏi dextromethorphan, hydroxyl hóa debrisoquin, hydroxyl hóa atomoxetin, cắt nhóm methyl khỏi S-fluoxetin, hydroxyl hóa nortriptylin, cắt nhóm methyl khỏi tramadol và cắt nhóm methyl khỏi codein thực hiện bởi CYP2D6.17

đã giảm lần lượt 22.69%, 16.69%, 64.25%, 21.89%, 8.17%, 7.33%, 35.70% và

80.35% so với enzym bình thường Allen *17 có thể tạo ra một protein với cơ chế

xúc tác khác thường bởi sự tương tác cơ chất – enzym có thể thay đổi rất khác nhau tùy thuộc cơ chất [106]

 CYP2D6*36 thường được gọi *10C liên quan với kiểu hình PM.Allen này chứa rất nhiều đột biến đa dạng như : –1426C>T, -1235A>G, -1000G>A, 100C>T, 310G>T, 843T>G, 1039C>T, 1661G>C, 2097A>G, 3384A>C, 3582A>G và gen