CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6
3.5. KỸ THUẬT PCR PHỨC HỢP
Sự xóa toàn bộ đoạn gen thường được phát hiện bởi kỹ thuật Southern blot hoặc sử dụng các mẫu dò TaqMan. Những phương pháp này thường đắt, phức tạp, tốn thời gian. Và một trong những khó khăn trong việc chuẩn đoán kiểu gen CYP2D6 là do nó có mối liên hệ đồng đẳng với pseudogen CYP2D7P. Thí nghiệm long-PCR đặc biệt đã được thực hiện để phân tích những mẫu ADN của người da trắng tạo ra những sản phẩm cụ thể từ những vùng biến dị gây ra bởi sự xóa toàn bộ gen [84]. Mặc dù kỹ thuật này khá hữu ích nhưng gần đây người ta phát hiện ra rằng
nhiều mẫu ADN mang gen CYP2D6 bị chẩn đoán nhầm là kiểu gen CYP2D6∗5 ở
quần thể người Nhật. Do vậy kỹ thuật PCR phức hợp đã được thiết kế để kiểm tra sự hiện diện của gen CYP2D6 sử dụng. Những phân tích đã chỉ ra nhiều khả năng là kỹ thuật PCR trước đây đã chẩn đoán nhầm đột biến CYP2D6*10 thành CYP2D6*5.
3.5.1. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên kỹ thuật PCR cơ bản, trong đó có nhiều cải tiến về thiết kế các mồi, điều kiện phản ứng. Trong đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng.
3.5.2. Ưu điểm - Giá thành thấp.
- Đơn giản.
- Tiết kiệm thời gian.
- Rất hiệu quả trong việc chẩn đoán chính xác các đột biến.
3.5.3. Nhược điểm
- Giống như các kỹ thuật PCR khác, kỹ thuật PCR phức hợp rất dễ nhiễm tạp ADN do đó yêu cầu thao tác phải rất cẩn trọng.
3.5.4. Áp dụng trên CYP2D6 giúp chẩn đoán allen *5 và allen*10
Hình 20. Các allen CYP2D6 [84]
((A) Gen CYP2D6 bình thường, (B) Gen CYP2D6*5, (C) Gen CYP2D6*10D; Vị trí các mồi và vùng gen được khuếch đại, REP : vùng lặp lại; ’×’: Các mồi đó không bắt cặp và khuếch đại; F: mồi xuôi, R: mồi ngược; Ô màu xám và nửa xám lần lượt
là gen CYP2D6 và những vùng có nguồn gốc từ CYP2D7).
Những mẫu ADN đã được cung cấp từ mẫu ADN của người Nhật còn lại đã được thu thập từ những nghiên cứu trước đó. Việc chẩn đoán kiểu gen CYP2D6 của
những mẫu này đã được thực hiện từ trước bằng cách giải trình tự trực tiếp. Nồng độ ADN của mẫu là 50ng/μL.
- Các thí nghiệm PCR trước đây: đệm PCR, 1mM MgSO4, 0.2 mM dNTPs,1μM primer F1, 1μM primer R2, 0.4 đơn vị KOD-Plus-DNA polymerase (Toyobo, Osaka, Japan) và 1.5 μL ADN trong tổng 20μL. Các điều kiện PCR ở
94℃ trong 1 phút, theo sau đó là 30 chu kì ở 98℃ trong 20s và 68℃ trong 6 phút,
72℃ trong 10 phút và sau đó là 4℃. Sản phẩm PCR được phân tách bởi điện di gel
agarose 0.7% .
- Thí nghiệm PCR trong thí nghiệm này: đệm LA-PCR, 2.5mM MgCl2, 0.3 mM dNTPs, 0.1μM primer F1, 0.1 μm primer R2, 1μM F3, 1 đơn vị LA Taq DNA polymerase (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) và 1.6μL ADN trong tổng 20μL. Các điều
kiện phản ứng ở 94℃ trong 1 phút, theo sau bởi 25 chu kì ở 98℃ trong 20s và 70℃
trong 6 phút, 70℃ trong 6 phút, cuối cùng là 4℃. Sản phẩm PCR được điện di trên
gel agarose 0.7%.
- Trình tự các mồi đã dùng là :
F1: 5′-ACCGGGCACCTGTACTCCTCA-3′
R2: 5′-GCATGAGCTAAGGCACCCAGAC-3′
F3: 5′-AAGGAGTGTCAGGGCCGGA-3′
- Kết quả băng điện di. Hình 21.
Hình 21. Chẩn đoán kiểu gen bằng kỹ thuật PCR truyền thống và PCR phức hợp [84]
(Hình ảnh phổ điện di: (A) PCR truyền thống, (B) PCR phức hợp, Giếng 1:
CYP2D6*1/*1, giếng 2: CYP2D6*1/*5, giếng 3: CYP2D6*5/*5, giếng 4:
CYP2D6*1/*10D)
Hình ảnh về phổ điện di gel từ các kỹ thuật PCR truyền thống đối với đột biến gen CYP2D6 được thể hiện ở hình A: mẫu ADN 1 không tạo ra băng nào được chẩn đoán kiểu gen CYP2D6*1/*1, mẫu AND 2 – 4 tạo ra mảnh có chiều dài 3.5kb nên được chẩn đoán là kiểu gen CYP2D6*5 . Trong khi đó kỹ thuật PCR phức hợp (hình
B) đã cho thấy mẫu ADN 4 mang đột biến CYP2D6∗10D bởi vì ngoài tạo ra băng
3.5kb nó còn tạo ra băng 6.2kb. Nguyên nhân của sự nhầm lẫn này là do
CYP2D6*10D cũng có sự xuất hiện của vùng lặp lại được đặt tên là REP7/6 (hình 20 C) tương tự như của CYP2D6*5 và các mồi truyền thống F1/R2 được thiết kế để phát hiện vùng này. Băng 6.2kb có nguồn gốc từ sự bắt cặp mồi F3/R2. Do đó điều này có thể kết luận là đột biến CYP2D6*10D có thể bị chẩn đoán nhầm như là CYP2D6*5 trong những phản ứng PCR truyền thống chỉ sử dụng mồi F1/R2 [84].