CHƯƠNG 2. ĐỘT BIẾN GEN MÃ HÓA CYP2D6
2.2. NHỮNG ĐỘT BIẾN GEN CYP2D6
2.2.1. Những allen của gen CYP2D6
Có ít nhất 74 đột biến allen khác nhau của CYP2D6 ( *2 tới *75 ) và một loạt các đột biến nhỏ đã được tìm ra và miêu tả bởi hiệp hội Human Cytochrome P450 Allele Nomen-clature. Và có 196 đa hình đơn nucleotid của CYP2D6 đã được miêu tả ở cơ sở dữ liệu National Center for Biotechnology Information SNP với ít nhất 52 đa hình đơn nucleotid không đồng nghĩa đã được báo cáo có thể có tác động lên protein [128]. Xét theo chức năng, những allen của CYP2D6 có thể được phân loại thành 3 nhóm: những allen gây tăng hoạt tính, những allen gây ra mất hoặc giảm chức năng và những allen có chức năng bình thường. Những biến đổi này được hình thành từ những kiểu đột biến quan trọng như: mất hoặc thêm, sắp xếp lại gen, xóa gen, lặp lại một hoặc nhiều lần gen CYP2D6. Sự phân bố của những allen này vào các quần thể khác nhau là rất khác nhau. *1A được xem như là allen bình thường dùng để đối chiếu với các allen khác.
a. Những allen CYP2D6 vô nghĩa
Những allen vô nghĩa không tạo ra các protein hoặc có tạo ra protein nhưng không tìm thấy vùng có hoạt tính enzym. Những allen *3, *4, *5, *6, *7, *8, *11,
*13, *14, *15, *16, *18, *19, *20, *21, *38, *40, *42, *44, *56, *62 mã hóa ra các protein không có hoạt tính enzym. Chúng gây ra kiểu hình PM khi ở kiểu hình đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Những allen này là gây ra những hậu quả lâm sàng rõ rệt như thay đổi độ thanh thải của thuốc và đáp ứng thuốc. Trong những allen vô nghĩa thì *3, *4, *5, *6 chiếm tỷ lệ gần 97% tất cả những allen gây ra kiểu hình PM ở người da trắng [101].
Cơ chế của việc các allen vô nghĩa này làm mất toàn bộ chức năng của enzym là :
Đột biến một base hoặc chèn / xóa một đoạn nhỏ cái phá vỡ khung đọc hoặc ngăn cản việc ghép nối đúng, dẫn tới sớm tổng hợp protein cuối cùng / stop codon ( Ví dụ: CYP2D6*3, *4, *6, *7, *8, *11, *15, *19, *20, *38, *40, *42, *44, *56 và
*62 [52].
Mất chức năng toàn bộ chiều dài allen mã hóa ( Ví dụ: CYP2D6 *12, *14 và
*18) [25].
Xóa toàn bộ một đoạn gen hoặc xóa một chuỗi rất lớn ( Ví dụ: CYP2D6 *5 ).
Hình thành một gen lai ( Ví dụ: *13 và *16 có sự mất một đoạn chuỗi lớn là hậu quả của gen lai CYP2D7- 2D6) [30].
Allen vô nghĩa do đột biến một base hoặc chèn / xóa một đoạn nhỏ
CYP2D6*3A đã được khám phá ở những người da trắng có kiểu hình PM đối với debrisoquin [52, 111]. Đột biến allen *3 dẫn tới xóa base A ở vị trí 2549 trên exon 5, gây ra sự phá vỡ khung đọc, và sẽ giải thích được sự mất chức năng và mất CYP2D6 ở kiểu hình PM do sớm tổng hợp protein kết thúc ở những cá thể dị hợp
tử. CYP2D6∗3B chứa thêm một đột biến 1749 A>G gây ra một trường hợp N166D
(Asparagin được thay bằng Asparatic ở vị trí 166 trên protein) [72]. Ảnh hưởng chức năng của allen này vẫn chưa được biết đến.
Đột biến ở allen *4 xảy ra với tần suất 22% và chiếm nhiều hơn 75% các đột biến ở người Thụy Điển da trắng [14]. Tuy nhiên allen này xảy ra ở tần suất thấp ở người Trung Quốc (~ 1%) [129] và người châu Phi ( 3.9%) và đây là lý do của việc tỷ lệ thấp của kiểu hình PM ở người Trung Quốc (~1%) và châu Phi (0-5%) [74, 108], trong khi tỷ lệ này ở người da trắng là 5-10%. Gaedigk và cộng sự xác định một trường hợp allen CYP2D6*4 không có đa hình đơn nucleotid 100C>T và 4180G>C [31]. Thể đa hình di truyền 4180G>C được phát hiện ở tất cả các allen CYP2D6*4 ngoại trừ CYP2D6*4J. Trường hợp này là một kiểu hình PM với kiểu
gen CYP2D6∗4/∗4, người đã được xác nhận có bộ gen dị hợp tử có đột biến
100C>T.
CYP2D6*7 có sự biến đổi ở vị trí 2935A>C trên exon 6 của gen CYP2D6 gây ra sự thay thế H324P [26]. Những đột biến này liên quan tới kiểu hình PM đối với spartein và xảy ra ở người da trắng với tần suất gần 1%. Khi sự thay đổi H324P được hình thành từ cDNA bởi vị trí đột biến gene trực tiếp, không có phổ CYP nào có khả năng phát hiện được tạo thành và không có hoạt tính chuyển hóa bufuralol và spartein được phát hiện.Hơn nữa, trái với dạng protein tự nhiên, protein đột biến hầu như chỉ nằm ở vùng chất ly giải không tan của mảnh vỡ tế bào. Những kết quả này khẳng định rằng sự thay thế H324P chịu trách nhiệm về kiểu hình PM trong cơ thể sống có liên quan đến allen CYP2D6*7 bằng cách ngăn cản sự gấp nếp bình thường của protein và sự sát nhập với nhân hem.
CYP2D6*11 được xác định từ quần thể người Pháp chứa các đột biến 883G>C, 1661G>C, 2850C>T và 4180G>C [73]. Đột biến 883G>C làm phá hủy vùng tiếp nối, gây hậu quả thiếu hụt enzym. Sự chuyển vị ở 2850C>T và 4180G>C gây ra sự thay đổi R296C và S486T.
CYP3D6*19 với sự xoá 4 base từ 2539 đến 2542 (AACT), được xác định từ quần thể người da trắng [72]. Sự xóa này làm phá vỡ cấu trúc ở vị trí 255 trên protein và tạo ra một enzym mất hoạt tính. CYP2D6*20 là một allen hiếm với sự chèn G vào giữa vị trí 1973 và 1974 gây phá vỡ cấu trúc ở vị trí 211 trên protein.
Đột biến này dẫn tới kiểu hình PM [70].
CYP2D6*56 được xác định có sự thay đổi ở 3201C>T trên exon 7. Theo qui luật nó sẽ tạo ra Arg344 (CGA), nhưng bây giờ được thay thế bởi một stop codon (TGA) và gây ra một CYP2D6 thiếu 153 amino acid ở cuối [64]. Hậu quả là enzym bị mất hoạt tính.
CYP2D6*62 là allen đột biến trong đó xảy ra sự thay thế 4044C>T và gây ra sự biến đổi R441C trên protein, làm mất sự gắn kết với nhân hem. Các cá thể có đột biến này được chứng minh giảm hoạt tính oxy hóa spartein [58].
Những allen mã hóa không còn chức năng đầy đủ
CYP2D6*12 là allen được phát hiện từ quần thể người Pháp, chứa các đột biến 124G>A, 1661G>C, 2850C>T và 4180G>C [71]. Sự chuyển vị 124G>A, 2850C>T và 4180G>C theo thứ tự gây ra các biến đổi G42R, R296C và S486T trên protein. Protein bị đột biến bị mất hoàn toàn hoạt tính chuyển hóa spratein, dẫn tới kiểu hình PM.
CYP2D6*14A là allen chứa các đột biến 100C>T, 1758G>A, 2850C>T và 4180G>C, được tìm thấy đầu tiên ở người Trung Quốc và sau đó là quần thể người châu Á [61, 130]. Có 4 acid amin bị thay đổi ở CYP2D6.14 là: P34S, G169R, R296C, và S486T, với G169R là biến đổi duy nhất chỉ gặp ở protein đột biến này [16, 130]. Hai sự thay đổi P34S và S486T có sự trùng hợp với sự thay đổi ở CYP2D6.10. Một người Trung Quốc có kiểu gen CYP2D6*5/*14 đã được chỉ ra là có kiểu hình PM với tỷ lệ chuyển hóa MR >12 đối với debrisoquin [130]. Một nghiên cứu chức năng gần đây cho thấy không phát hiện được hoạt tính của CYP2D6.14A khi chuyển hóa bufuralol và dextromethorphan [102]. CYP2D6*14B cũng chứa intron 1 hoán đổi với CYP2D7 (base nucleotid từ 215- 245) ngoài 4 SNP trong CYP2D6 ở phía trên. Allen này được tìm thấy ở người Trung Quốc với tần
suất 2.0% . Allen *14B khác với những allen ∗14 khác đó là sự thiếu chuyển vị
188C>T thay vào đó 1749G>C được thêm vào. Trái với allen *14A, allen *14B có hoạt tính enzym đáng kể, đấy có thể là do sự vắng mặt của sự thay thế P34S [50].
Allen CYP2D6*18 là allen có 9 base được chèn vào ( GTGCCCACT) từ 4125 tới 4133 trên exon 9 và được tìm thấy đầu tiên ở quần thể người Nhật. Allen
này liên qua đến kiểu hình PM. Hằng số Km đối với sự hydroxyl hóa bufuralol thực hiện bởi CYP2D6.18 cao gấp 236 lần so với mức bình thường (990 so với 4.2μmol/L ) [102, 134].
Sự xóa toàn bộ đoạn gen
CYP2D6*5 là đột biến xóa toàn bộ đoạn gen và có tần suất tương tự nhau ở các quần thể khác nhau ( 4 – 7% ) [30, 116]. Đây là đột biến bất hoạt allen phổ biến thứ hai ở người Anh và tần suất của nó ở quần thể người da trắng là 4% [81]. Đối với người Trung Quốc tần số xuất hiện đột biến này là 7.2% [50]. Gaedigk và cộng sự đã xác định sự xóa toàn bộ đoạn gen dài 11.5kb trên gen trong đó có chứa CYP2D6 và không tìm thấy CYP2D6 trong gan [30].
Hình thành gen lai
CYP2D6*13 là allen lai chứa exon 1 của CYP2D7 và exon 2 – 9 của gen CYP2D6 được xác định đầu tiên ở quần thể người Pháp, gây ra kiểu hình PM [92].
Allen CYP2D6*16 cũng là một gen lai chứa exon 1 – 7 của CYP2D7 và exon 8 - 9 của CYP2D6 [17].
Cả hai gen lai này đều tạo ra sự xóa một đoạn lớn gen do sự trao đổi chéo bất thường hoặc cơ chế mất sự móc nối.
Hình 10. Hình thành gen lai [33]
b. Allen mất chức năng một phần
Những allen CYP2D6*10, *14, *17, *18, *36, *41, *47, *49, *50, *51, *54,
*55, *57 gây ra sự giảm đáng kể hoạt tính enzym. Nguyên nhân là do sự giảm tính ổn định của protein, phá vỡ cấu trúc vùng gắn cơ chất, hoặc giảm ái lực cơ chất – enzym. Sự thay đổi hoạt tính enzym có thể phụ thuộc cơ chất đối với vài allen như
*17. Các trường hợp cụ thể có thể gây ra kiểu hình PM hoặc IM.
Allen *10 xảy ra với tần số 33 – 43 % đối với người châu Á bao gồm người Nhật, Hàn Quốc và Trung Quốc [11, 48, 50]. Tuy nhiên tần số này ở người da trắng
và người Mỹ gốc Phi và những quần thể khác (ví dụ như Ấn Độ) là 2 – 5% [63].
Allen *10A chứa đa hình đơn nucleotid 100C>T gây ra sự thay đổi P34S ở vùng giàu Prolin (‘PPGP) gần nhóm NH2 cuối cùng của protein và liên quan tới tỷ lệ thanh thải thấp spartein (MR > 1.5) trong các thử nghiệm in vivo [135]. Những cá thể đồng hợp tử *10/*10 yêu cầu mức liều metoprolol và nortriptylin thấp hơn cá thể có kiểu gen *1/*1 để tạo ra hiệu quả lâm sàng tương tự [45, 137]. Vị trí P34 có thể hoạt động như bản lề giữa vùng màng kị nước và vùng liên kết với nhân hem của enzym. Đa hình đơn nucleotid 100C>T tạo ra một protein không ổn định có hoạt tính enzym giảm đối với chuyển hóa debrisoquin, bufuralol và dextromethorphan. Allen này cũng chứa các đột biến 1661G>C và 4180G>C gây ra đột biến S486T trên protein [102]. Shen và cộng sự đã khám phá ra hoạt tính xúc tác của CYP2D6.10 đối với một loạt các cơ chất. Ông đã tìm ra rằng giá trị CLint
của sự hydroxyl hóa bufuralol tại vị trí carbon 1 (bufuralol 1’ – hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi dextromethorphan qua cầu nối oxy (dextromethorphan O- demethylation), hydroxyl hóa debrisoquin ở vị trí carbon 4 (debrisoquin 4- hydroxylation), hydroxyl hóa atomoxetin ở carbon 4 (atomoxetin 4- hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi S-fluoxetin qua cầu nối ni tơ (S-fluoxetin N-demethylation), hydroxyl hóa nortriptylin ở carbon 10 (nortriptylin 10-hydroxylation), cắt nhóm methyl khỏi tramadol qua cầu nối oxy (tramadol O-demethylation) và cắt nhóm methyl khỏi codein qua cầu nối oxy (codein O-demethylation) bởi CYP2D6.10 đã lần lượt giảm xuống còn 3.65%, 5.29%, 11,84%, 8.58%, 7.54%, 1.32%, 6.90% và 27.86% so với protein bình thường.
Sự nhân đôi allen CYP2D6*10 (*10 × 2 ) đã được tìm thấy đầu tiên ở quần thể người Trung Quốc nhưng hoạt tính của enzym lại giảm [35, 50]. Tần số của allen này ở người Nhật Bản khá thấp (0.6%) [78].
Allen *17 xảy ra với tần số cao ở người Châu Phi và người Mỹ gốc Phi nhưng lại hầu như không xuất hiện ở người da trắng [11]. Tần số của allen này ở quần thể người Zimbabwe là 34% [75], người Tanzania là 17% [131], người Ghana là 28% [40]. Hơn 10% người Zimbabwe có kiểu gen đồng hợp tử với allen này.
Những biến đổi này đã giải thích tại sao người Châu Phi có chỉ số MR trung bình cao hơn người da trắng [63].
Allen CYP2D6*17 chứa 4 SNP là : 1023C>T trên exon 2; 1661G>C trên exon 3 (một SNP đồng nghĩa); 2850C>T trên exon 6 và 4180G>C trên exon 9. Kết quả khi dịch mã lần lượt gây ra các sự thay thế: T107I, R296C và S486T [75]. So sánh với CYP2D6*2 thì CYPD6*17 có thêm 1 sự thay đổi T107I. Sự thay đổi này xảy ra ở vùng β – helix và vị trí 107 có thể liên quan đến vùng nhận cơ chất. Một thí nghiệm in vivo đã chỉ ra rằng allen này gây ra sự giảm hoạt tính phản ứng hydroxyl hóa debrisoquin [75]. Sự biểu hiện của cADN trong COS-1 cell đã tiết lộ enzym CYP2D6.17 thể hiện chỉ 20% hoạt tính so với dạng tự nhiên, trong khi sự thay đổi một mình T107I không có ảnh hưởng đáng kể đến chức năng enzym [88]. Enzym chứa cả đột biến T107I và R296C có chỉ số Km đối với bufuralol cao hơn 5 lần so kiểu hình bình thường, trong khi đó đột biến S486T không gây ra ảnh hưởng. Trái lại khi codein được dùng làm cơ chất, đột biến T107I một mình nó cũng đủ gây ra sự tăng hằng số Km biểu kiến, điều này chỉ ra rằng ảnh hưởng khác biệt của các đột biến này phụ thuộc vào cơ chất của CYP2D6 được sử dụng. CYP2D6.17 có hằng số Km biểu kiến đối với codein cao gấp 5-10 lần so với enzym bình thường. Shen và cộng sự đã khám phá ra hoạt tính xúc tác của CYP2D6.17 đối với một loạt cơ chất. Ông đã chỉ ra rằng giá trị CLint của sự hydroxyl hóa bufuralol, cắt nhóm methyl khỏi dextromethorphan, hydroxyl hóa debrisoquin, hydroxyl hóa atomoxetin, cắt nhóm methyl khỏi S-fluoxetin, hydroxyl hóa nortriptylin, cắt nhóm methyl khỏi tramadol và cắt nhóm methyl khỏi codein thực hiện bởi CYP2D6.17 đã giảm lần lượt 22.69%, 16.69%, 64.25%, 21.89%, 8.17%, 7.33%, 35.70% và 80.35% so với enzym bình thường. Allen *17 có thể tạo ra một protein với cơ chế xúc tác khác thường bởi sự tương tác cơ chất – enzym có thể thay đổi rất khác nhau tùy thuộc cơ chất [106].
CYP2D6*36 thường được gọi *10C liên quan với kiểu hình PM.Allen này chứa rất nhiều đột biến đa dạng như : –1426C>T, -1235A>G, -1000G>A, 100C>T, 310G>T, 843T>G, 1039C>T, 1661G>C, 2097A>G, 3384A>C, 3582A>G và gen
hoán đổi với CYP2D7 ở exon 9 [31]. Các protein đột biến bao gồm: P34S, P469A, T470A, H478S, G479A, F481V, A482S và S486T. Sự biến đổi 100C>T (P34S) ở
CYP2D6∗36 là nguyên nhân chính tạo ra sự mất ổn định protein và 6 acid amin
khác ở exon 9 không có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính enzym. Cả CYP2D6.10 và CYP2D6.36 đều đã được khẳng định sự giảm độ thanh thải của venlafaxin in vivo do sự giảm tạo thành protein và tăng hằng số Km của cơ chất [29]. Giá trị Km của CYP2D6.1, CYP2D6.10A và CYP2D6.10C lần lượt là 1.7, 8.5 và 49.7 μmol/L đối với sự hydroxyl hóa bufuralol; và lần lượt là 9.0, 51,9 và 117.4 μmol/L đối với sự cắt nhóm methyl khỏi venlafaxin. Những kết quả trên đã chỉ ra rằng sự giảm CLint do CYP2D6.10 và CYP2D6.36 được gây ra không chỉ bởi hoạt tính protein thấp mà còn bởi sự tăng giá trị Km do giảm ái lực đối với enzym. Khi được miêu tả ở trong COS-7 cells, CYP2D6.36 đã thể hiện hoạt tính nghèo nàn đối với chuyển hóa bufuralol và dextromethorphan [102].
Allen CYP2D6*41 là một biến đổi của allen CYP2D6*2 với thêm một đột biến 1548G>C, cả hai allen này đều gây ra hai sự thay đổi acid amin ( R296C và S486T). Hai ca nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng 1584G>C gây ra sự thiếu kết nối của phân tử mARN [121]. Tuy nhiên, những cá thể đồng hợp tử CYP2D6*41 có kiểu hình tương tự IM do sự khiếm khuyết allen CYP2D6 [97]. CYP2D6*2 và CYP2D6*41 là hai trường hợp thường có sự lặp lại một hoặc nhiều lần gen CYP2D6, nó được xem như là sự biến đổi có chọn lọc thường xảy ra ở vùng bắc Phi [46].
CYP2D6*47, *51 và *57 là những allen mã hóa cho những enzym đột biến với hoạt tính còn lại bé hơn 5% so với thông thường [102]. Allen CYP2D6*47 lần đầu tiên được xác định ở quần thể người Nhật, nó bao gồm các thay đổi R25W, P34S và S486. Người ta cho rằng những cá thể có kiểu gen *47 sẽ gây ra kiểu hình
PM [114]. Allen *51 đã được báo cáo bởi Soyama và cộng sự. Nó liên quan đến sự thay đổi R296C, E334A, S486. Glu334 nằm ở helix J và đặc trưng trong các CYP, gợi ý tới vai trò đặc biệt quan trọng của nó trong chuyển hóa [100]. Allen *57 được xác định bởi Soyama và nó chứa các biến đổi P34S, R62W, P469A, T470A, H478S, G479A, F481V, A482S và S486T [115]. Sự mất gần hết hoạt tính của CYP2D6.51 là do sự xuất hiện của P34S, điều này cũng được thể hiện ở những protein được mã hóa bởi gen *47, *36. Có sự liên hệ mật thiết giữa CYP2D6.10 và CYP2D6.57 và vì vậy chúng thường được so sánh với nhau. Ảnh hưởng chức năng của *51, *57 vẫn chưa được rõ ràng nhưng người ta cho rằng nó gây ra kiểu hình PM.
Allen CYP2D6*10, *18,*49, *50, *54 và *55 được xác định lần đầu tiên ở quần thể người Nhật, nó mã hóa các protein chỉ còn 7 – 36% hoạt tính so với protein bình thường. Những allen này được cho là liên quan đến kiểu hình PM và nhiều khả năng hơn nữa là IM. CYP2D6.50 chứa E156A, CYP2D6.54 chứa P34S, T216I và S486I; CYP2D6.55 chứa các đột biến R296C, K404Q và S486T.
CYP2D6.2 và CYP2D6.10, CYP2D6.14, CYP2D6.18 và CYP2D6.55 được miêu tả trong COS-7 cells đã chỉ ra sự tăng đáng kể giá trị biểu kiến Km, trong khi đó CYP2D6.49, CYP2D6.50 và CYP2D6.53 lại có giá trị Km biểu kiến thấp hơn so với dạng protein bình thường. Giá trị Vmax của CYP2D6.10, CYP2D6.49, CYP2D6.54 lần lượt là 20%, 17% và 6% so với dạng bình thường [102].
c. Những allen gây tăng nhẹ hoạt tính
Những nghiên cứu chức năng không chứng minh được sự biến đổi đáng kể giữa hoạt tính enzym và một số allen CYP2D6, bao gồm cả *2A, *17×2, *27, *35, *39,
*41×2 và *48. Marez và cộng sự nghiên cứu ở người châu Âu và không tìm thấy ảnh hưởng chức năng của những allen này, hay nói cách khác thì hoạt tính enzym mà nó mã hóa tương tự với loại bình thường. Họ cũng xác định được các allen CYP2D6*2B, *2C, *2D, *2E, *2F, *2G, *2H và *2K [72]. Gaedigk và cộng sự xác nhận thêm được 2 allen nữa trong chuỗi *2 là :*2L và *2M . Hai allen này chứa nhiều đột biến đa dạng (ví dụ: 310G>T, 746C>G và 843T>G). Những đột biến - 1584C>G, -1235A>G, -740C>T và -678G>A có thể tìm thấy phổ biến ở các nhóm