Bảng 2.1 Vị trí và ký hiệu mẫu nước thu nhận phân lập vi khuẩn chịu mặn
Hệ thống Vị trí thu mẫu Ký hiệu mẫu Ngày thu mẫu
Hệ thống xử lý nước thải cảng cá
Vàm Láng
Hố gom nước thải rửa sơ chế 1A 6/2018 1B 6/2018 1C 3/2019 Cửa xả sau xử lý 2A 6/2018 2B 6/2018 2C 3/2019 Hệ thống xử lý nước thải Công ty
Minh Thắng
Hố gom nước thải rửa sơ chế
3A 6/2018
3B 3/2019
Cửa xả sau xử lý 4A 6/2018
4B 3/2019
- Mẫu nước thu nhận theo TCVN 6663-1:2011 (ISO 5667-2:2006), Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 1: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu.
- Mẫu được bảo quản theo TCVN 6663-3:2003 (ISO 5667-3:1985) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 3: Hướng dẫn bảo quản và xử lý mẫu. 2.2.3.2 Phân tích, đánh giá chất lượng nước thải phân lập vi sinh vật
- Mẫu được thu thập trong chai sạch vô trùng và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Độ mặn, nhiệt độ và pH của nước mặt được xác định ngay lập tức tại điểm lấy mẫu bằng bộ kiểm tra nước đa năng Horiba U-10.
- Tại phòng thí nghiệm, các chỉ tiêu hóa lí được phân tích theo Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết phân tích.
Bảng 2.2 Chỉ tiêu và phương pháp phân tích tính chất mẫu nước phân lập vi khuẩn chịu mặn Stt/ No. Chỉ tiêu/ Parameters Phương pháp phân tích/ Testing method Đơn vị tính/ Unit 01 pH (*) TCVN 6492 : 2011 -
02 Độ mặn (Salinity) Đo bằng thiệt bị Handylab 200 ‰
03 DO (*) SMEWW 4500.O.C : 2012 mg/L
04 Độ dẫn
(Conductivity)
Đo bằng thiệt bị Handylab 200 mS/cm 05 Độ đục (Tubidity) (*) SMEWW 2130 B : 2012 NTU
06 Tổng N (*) TCVN 6638 : 2000 mg/L
07 N-NH3(*) TCVN 5988 : 1995 mg/L
08 N-NO3-(*) (I) SMEWW4500 (NO3-)-E : 2012 mg/L
09 N-NO2-(*) (I) TCVN 6178 : 1996 mg/L
10 Tổng P (*) SMEWW 4500-P (E) : 2012 mg/L
11 Photphat (*) SMEWW 4500-P (E) : 2012 mg/L
12 TSS (*) SMEWW 2540 D-2012 mg/L
13 BOD5 (*) SMEWW 5210 B : 2012 mg/L
14 Cl- (*) SMEWW 4500 Cl- B : 2012 mg/L
15 TDS (*) SMEWW 2540.C-2012 mg/L
2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn
2.3.1 Nội dung nghiên cứu
- Phân lập VSV từ mẫu nước thải đã thu thập và nuôi cấy VSV - Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng VSV phân lập được - Định danh đến loài các chủng VSV phân lập.
- Tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phát triển trên môi trường đặc trưng từ nguồn nước thải nhiễm mặn tại địa phương.
2.3.2 Phạm vi nghiên cứu
- Các mẫu nước và bùn thải được thu nhận như trong phần 2.1.3
- Vi khuẩn chịu mặn được phân lập, tuyển chọn tại Phòng thí nghiệm Sinh học môi trường, trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
- Các chủng vi khuẩn được định danh tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM.
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3.1 Phân lập vi sinh vật từ mẫu nước thải đã thu và nuôi cấy vi sinh vật - Mẫu được thu thập trong chai sạch vô trùng và vận chuyển đến phòng
thí nghiệm để phân lập vi khuẩn trong vòng 24 giờ.
- Chuẩn bị môi trường phân lập dùng cho vi sinh chịu mặn [7]: Môi trường BMS (Basal Mineral Salts): 3 g/L NaNO3, 1 g/L KH2PO4, 0,5 g/L MgSO4, 0,5 g/L KCl, 5 g/L NaCl, 1 g/L Cao nấm men, 20% agar, pH 7.
- Tiến hành pha loãng mẫu nước theo phương pháp pha loãng bậc 10 với dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng.
- Cho 0,1 mL mẫu đã pha loãng vào các đĩa môi trường BMS, trải đều đến khi khô. Ủ các đĩa môi trường ở 30ºC trong 24 – 48 giờ để vi khuẩn phát triển trên bề mặt môi trường thạch.
- Chọn các khuẩn lạc vi sinh độc lập trên đĩa petri đã phân lập để tách rời và làm thuần các chủng vi sinh vật qua thạch nghiêng.
- Cấy truyền liên tục 1-3 lần để tạo các dòng thuần.
2.3.3.2 Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh phân lập được - Cấy ria các chủng trên môi trường BMS có bổ sung NaCl theo các
nồng độ 1, 3, 5 và 7%.
- Đánh giá khả năng phát triển của khuẩn lạc trên bề mặt môi trường 2.3.3.3 Tuyển chọn, giữ giống và định danh
- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn tốt (các chủng có khả năng phát triển tốt trên môi trường có từ 5% NaCl trở lên). Các chủng không thích nghi hoặc phát triển kém sẽ được loại bỏ.
- Các giống VSV sau lựa chọn được tiến hành giữ giống bằng phương pháp đông khô theo TCVN 9298:2014. Cụ thể, các chủng VSV được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường BMS lỏng để đạt mật độ ít nhất 108 tế bào/ml sau đó dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch huyền phù cho vào các lọ đông khô. Qúa trình đông khô được tiến hành như sau:
• Pha 1: Hạ băng: Từ 20oC xuống -35oC trong 3 giờ. • Pha 2: Đông khô: Từ -35oC đến -10oC trong 18 giờ.
Từ -10oC đến 25oC trong 4 giờ. • Pha 3: Làm kiệt: Duy trì ở 25oC trong 4 giờ
Mẫu đông khô được lưu trữ bằng cách bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-10oC. Định kỳ sau 1-5 năm kiểm tra độ phần trăm sống sót và đặc tính sinh học của mẫu giống.
- Các chủng vi khuẩn được chọn sẽ được nuôi cấy trên môi trường BMS trong 24 giờ, sau đó được định danh bằng phương pháp MALDI-TOF: sử dụng công nghệ khối phổ protein giúp định danh vi sinh vật bằng dấu ấn phân tử. So sánh sự tương đồng của phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với cơ sở dữ liệu của gần 6000 chủng vi sinh vật khác
nhau cho phép định danh chính xác loài vi sinh vật, bao gồm Vi khuẩn Gram dương, Gram âm, vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí, nấm men, mycobacter, nấm sợi. [32]
2.4 Nội dung 4. Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn chủng vi sinh vật tuyển chọn
2.4.1 Nội dung nghiên cứu
- Tăng sinh khối các chủng VSV chịu mặn cao
- Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của các chủng VSV tuyển chọn
• Lựa chọn, phân tích chỉ tiêu chất lượng đầu vào của 2 loại nước thải thủy sản
• Thăm dò khả năng xử lý nước thải của từng chủng VSV chịu mặn nêu trên
• Thăm dò khả năng xử lý nước thải của hỗn hợp các chủng VSV chịu mặn.
• Thăm dò khả năng xử lý nước thải của hỗn hợp gồm 1 chủng VSV chịu mặn được tuyển chọn với hỗn hợp VSV có sẵn trong bùn hoạt tính của nước thải.
• Khảo sát khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của một số chế phẩm hiện có trên thị trường
2.4.2 Phạm vi nghiên cứu
- Sử dụng 10 chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn được lựa chọn ở Nội dung 3 để tiến hành tăng sinh, đánh giá hoạt tính xử lý nước thải.
- Các mẫu nước và bùn thải nhiễm mặn thu nhận tại 2 địa điểm: Cảng cá Vàm Láng và Công ty TNHH Minh Thắng trong thời gian từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2019 được sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá khả năng xử lý nước mặn của các chủng tuyển chọn.
- Các chế phẩm sinh học sử dụng để đánh giá, so sánh được thể hiện trong Hình 2.4:
o Chế phẩm A: Chế phẩm sinh học Bio-EM chứa hỗn hợp vi sinh vật gồm: Bacillus sp., Lactobacillus sp., Streptomyces sp., Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Nitrobacter sp., Nitrosomonas sp. có vai trò phân hủy mạnh chất hữu cơ như: xenluloze, tinh bột, protein, lipit, pectin, kitin giúp tăng cường hiệu quả trong các hệ thống xử lý nước thải.
o Chế phẩm B: EcoCleanTM 102 là chế phẩm vi sinh xử lý nước thải độ mặn cao với vi sinh vật được chọn lọc với mật độ 109 tế bào/gam và enzyme hoạt tính (Protease, Lipase, Amylase, Urease, Cellulase) nhằm xử lý các chất ô nhiễm trong môi trường nước mặn thông qua cơ chế cạnh tranh thức ăn.
o Chế phẩm C: Jumbo-A là chế phẩm sinh học chứa hỗn hợp các chủng vi sinh vật gồm Bacillus subtilus, Saccharomyces, Nitrosomonas và Nitrobacter có khả năng phân hủy chất hữu cơ trong môi trường nước. Ngoài ra, chế phẩm Jumbo-A còn chứa thành phần enzyme giúp thúc đẩy khả năng phân hủy các chất ô nhiễm có trong nước thải
2.4.3 Phương pháp nghiên cứu
2.4.3.1 Tạo sinh khối các chủng vi sinh vật chịu mặn cao
- Phân phối mỗi chủng vào môi trường BMS lỏng, nuôi cấy lắc 24-48 giờ, 30OC, kiểm tra sinh khối tế bào bằng buồng đếm Neubauer
- Phương pháp định lượng mật độ vi sinh vật bằng buồng đếm Neubauer dựa trên sự phân bố xác suất thống kê của các vi sinh vật trong mẫu. Thông thường, việc định lượng được thực hiện bằng cách đếm số tế bào vi sinh vật trong năm ô vuông lớn, chứa 16 ô vuông nhỏ. Việc tính toán mật độ vi khuẩn được thực hiện theo công thức (2.1) và (2.2):
• Thể tích 1 ô nhỏ: ; 4000000 1 4000 1 1 , 0 . 400 1 3 0 mm mL V = = = (2.1)
• Mật độ vi sinh vật trong 1 mL mẫu:
0 0 . .CV N n n= (tế bào/mL); (2.2)
Trong đó: n: mật độ tế bào vi sinh vật trong 1 mL mẫu;
N: số ô đếm;
n0: tổng số tế bào vi sinh vật đếm được;
C: độ pha loãng mẫu.
Hình 2.5 Buồng đếm Neubauer
- Tăng sinh các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường chọn lọc đến khi mật độ đạt trên 109 cfu/ml.
2.4.3.2 Đánh giá khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
- Phân tích các chỉ tiêu chất lượng đầu vào của 2 loại nước thải bằng các phương pháp đã liệt kê trong bảng 2.1 trước khi sử dụng cho thí nghiệm đánh giá khả năng xử lý của các chủng tuyển chọn.
- Thăm dò khả năng xử lý nước thải của từng chủng vi sinh vật chịu mặn nêu trên theo ba bước
o Phân phối từng chủng vào các erlen chứa nước thải Vàm Láng với các tỷ lệ lần lượt là: 1:5, 1:10, 1:15 và 1:20, cung cấp oxi thông qua bộ sục khí, đo nồng độ COD sau 96 giờ. Tiến hành thí nghiệm song song với mẫu đối chứng không bổ sung vi sinh vật. Xác định tỷ lệ giống tối ưu nhất đối với từng chủng để bổ sung vào hệ thống xử lý.
o Thiết kế mô hình bể sinh học hiếu khí SBR như hình 2.6 có thể tích 0,5 m3 được sát trùng bằng chlorine. Phủ dưới đáy bể lớp bùn khoảng 5 cm được lấy từ cảng cá Vàm Láng được xử lý bằng cách tiệt trùng ướt ở nhiệt độ 121℃ khoảng 15 – 20 phút bằng nồi hấp tiệt trùng. Thể tích nước thải khi khảo sát sẽ được bơm vào bể. Hiệu quả xử lý thực tế của VSV đối với COD trong nước thải được tính theo công thức (2.3):
𝐻 = 𝐶𝑂𝐷𝑣à𝑜−𝐶𝑂𝐷𝑟𝑎
𝐶𝑂𝐷𝑣à𝑜 . 100% (2.3)
Trong đó:
• H: hiệu quả của VSV đối với nước thải tại mốc thời gian. • CODvào: nồng độ COD nước thải đầu vào.
Hình 2.6 Mô hình bể SBR
o Khảo sát khả năng xử lý riêng lẻ của từng chủng trên mẫu nước thải Vàm Láng, ở 2 nồng độ COD đầu vào là 200 mg/L và 400 mg/L. So sánh với đối chứng là mẫu nước thải không bổ sung vi sinh vật. Xác định COD sau 24, 48, 72 và 96 giờ.
- Thăm dò khả năng xử lý nước thải của hỗn hợp các chủng vi sinh vật chịu mặn bằng cách so sánh giữa 3 nhóm phối hợp:
o G1: 5 chủng có H% cao nhất: 1B1, 2B1, 3B3, 4A1, 4B6
o G2: 5 chủng chịu mặn tốt nhất: 1B1, 1C2, 2A2, 3A5, 4A7
o G3: hỗn hợp 10 chủng vi khuẩn
Mỗi nghiệm thức tiến hành nuôi cấy lắc các bình thí nghiệm trong vòng 24- 48 giờ, ở điều kiện nhiệt độ 30 - 32oC. Tỷ lệ phối trội đều nhau giữa các chủng. Phân tích chỉ tiêu COD tương tự như trên đối với mẫu nước thải sau đó so sánh, rút ra kết luận.
- Thăm dò khả năng xử lý nước thải của hỗn hợp gồm 1 chủng vi sinh vật chịu mặn được tuyển chọn cùng với hỗn hợp vi sinh vật có sẵn trong bùn hoạt tính của nước thải. 5 chủng có H% cao nhất lựa chọn được nhân giống và bổ sung vào hỗn hợp vi sinh vật có trong bùn hoạt tính thu nhận từ Công ty Minh Thắng. Các nghiệm thức được khảo sát trên mô hình SBR và ghi nhận chỉ tiêu COD sau 24, 48, 72 và 96 giờ. Các nghiệm thức bao gồm:
• Bình 1: Chủng 1B1 + Bùn hoạt tính • Bình 2: Chủng 2B1 + Bùn hoạt tính • Bình 3: Chủng 3B3 + Bùn hoạt tính • Bình 4: Chủng 4A1 + Bùn hoạt tính • Bình 5: Chủng 4B6 + Bùn hoạt tính
• Đối chứng 1: Mẫu nước thải (không bổ sung VSV và bùn hoạt tính)
• Đối chứng 2: bùn hoạt tính không bổ sung chủng vi sinh vật phân lập được.
- Khảo sát khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của 3 chế phẩm thương mại hóa hiện có trên thị trường được lựa chọn tiến hành thử nghiệm trên mô hình nhằm đối sánh hiệu quả. Các chế phẩm được sử dụng theo 6 nghiệm thức:
• Bình 1: 5.000ml nước thải + Chế phẩm A
• Bình 2: 5.000ml nước thải + Chế phẩm A + hỗn hợp giống • Bình 3: 5.000ml nước thải + Chế phẩm B
• Bình 4: 5.000ml nước thải + Chế phẩm B + hỗn hợp giống • Bình 5: 5.000ml nước thải + Chế phẩm C
• Bình 6: 5.000ml nước thải + Chế phẩm C + hỗn hợp giống
Hỗn hợp giống gồm 6 chủng tuyển chọn phân phối theo tỷ lệ bằng nhau. Lượng chế phẩm sử dụng trong thí nghiệm theo khuyến cáo của nhà cung cấp. Thí nghiệm được bố trí với mẫu nước thải nhiễm mặn thu nhận tại công ty Minh Thắng, Tiền Giang.
2.5 Nội dung 5: Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối
2.5.1 Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên quá trình phát triển của vi sinh vật
- Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ muối lên sự phát triển của vi sinh vật
- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng C và N lên sự phát triển của vi sinh vật
2.5.2 Phạm vi nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn chịu mặn tuyển chọn từ nội dung 4.
- Nghiên cứu liên quan đến các chủng Bacillus (2B1, 4A1, 4B6) trong nội dung này được thực hiện tại Khoa Kỹ thuật Y tế và Công nghệ sinh học, Đại học Ứng dụng Khoa học Jena, Đức do Thạc sĩ Trương Thị Thu Hương thực hiện và Giáo sư Michael Pfaff phụ trách hướng dẫn. Các kết quả hợp tác được tổng hợp cùng với các nghiên cứu liên quan đến các chủng còn lại được thực hiện tại Viện Khoa học Công nghệ và Quản lý Môi trường thuộc trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
2.5.3 Phương pháp nghiên cứu
- Môi trường BMS dùng để khảo sát các yếu tố thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH và nồng độ muối.
- Phương pháp nghiên cứu chính: phương pháp đo số lượng VSV bằng phương pháp đo độ đục. Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được lượng sinh khối vi sinh vật. Khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng.