Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng
3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên quá trình phát triển
Trên môi trường BMS lỏng, kết quả xác định OD sau 6 khoảng thời gian được trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.12 cho thấy cả 6 chủng đều có kết quả OD tăng dần từ 12 giờ đến 36 giờ, sau đó giảm dần đến 72 giờ.
Tại thời điểm đầu tiên 12 giờ, giá trị OD thấp nhất là 0,062 (chủng 4B6), cao nhất là 0,119 (chủng 3B3). Tại thời điểm cuối cùng 72 giờ, có 3 giá trị OD âm tính (chủng 1C2, 2B1 và 4B6). Giá trị âm tính chứng tỏ đây là thời gian tế bào vi sinh vật chết nhiều, làm tăng độ đục vượt mức giá trị cân bằng xác định ban đầu. Như vậy, cũng bước đầu cho thấy, trong nuôi cấy trên môi
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5 Bình 6
H% so sánh với các chế phẩm trên thị trường
24h 48h 72h 96h
trường lỏng, thời gian 72 giờ là đủ để theo dõi sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD
Chủng 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 12 giờ 0,092 0,078 0,083 0,119 0,205 0,062 24 giờ 0,151 0,247 0,162 0,259 0,198 0,172 36 giờ 0,199 0,282 0,297 0,302 0,366 0,277 48 giờ 0,084 0,117 0,118 0,125 0,146 0,107 60 giờ 0,076 0,053 0,062 0,096 0,052 0,008 72 giờ 0,053 -0,015 -0,002 0,018 0,003 -0,012
Hình 3.12 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD
-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 12h 24h 36h 48h 60h 72h
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy theo OD
Song song với các thời điểm xác định OD, việc xác định mật độ tế bào trên buồng đếm Neubauer giúp xây dựng sự tương quan giữa 2 giá trị. Kết quả định lượng trình bày trong bảng 3.16 và hình 3.13.
Mật độ tế bào của 6 chủng có các giá trị dao động trong khoảng 106 tế bào/mL. Thời điểm 12 giờ, chủng có mật độ cao nhất là 4B6, chủng thấp nhất là 2B1. Mật độ tăng dần đến 36 và 48 giờ, sau đó giảm đến 72 giờ. Có 2 chủng 1C2 và 3B3 có mật độ cao nhất vào 48 giờ. Các chủng còn lại đạt cao nhất vào 36 giờ. Mật độ trung bình cao nhất của chủng 4B6, thấp nhất của chủng 2B1. Như vậy, so với giá trị OD, kết quả định lượng có sự khác biệt.
Mặc dù không xác định mật độ tế bào vào thời điểm 0 giờ, nhưng bắt đầu từ 12-36 giờ, đồ thị các chủng thể hiện rõ độ dốc tăng đứng, tương ứng giai đoạn lũy thừa. Chỉ có 2 chủng 1C2 và 3B3 đỉnh dốc nằm ở giai đoạn 48 giờ. Sau đó, đồ thị giảm dần qua giai đoạn suy vong. Chỉ có chủng 3B3 và 4A1 thể hiện trên mật độ tế bào có giai đoạn cân bằng ngắn từ 36-48 giờ trước khi bước vào giai đoạn giảm mạnh do suy vong. Quá trình cân bằng diễn ra trong thời gian ngắn có thể vì thể tích nuôi cấy trong quá trình khảo sát ít, giới hạn trong các erlen 250ml. Điều này làm giảm không gian sống, việc tích lũy các độc chất nhanh hơn. Mặt khác, các chủng này thuộc nhóm chịu mặn, môi trường khảo sát có nồng độ NaCl 5%, các ion này phân ly trong dung dịch nuôi cấy cũng ảnh hường đến quá trình hấp thụ dinh dưỡng lên bề mặt tế bào. Các nghiên cứu cũng chứng minh tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn chịu mặn chậm hơn và dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường xung quanh nhiều hơn so với các chủng vi khuẩn thông thường.
Bảng 3.16 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào Chủng Mật độ tế bào (*106 tế bào/ml) 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 12 giờ 102,33 90,05 40,05 68,02 92,13 192,78 24 giờ 192,05 172,52 78,21 108,93 165,99 180,03 36 giờ 285,21 207,68 140,33 192,67 292,05 277,19 48 giờ 135,75 266,13 118,5 205,33 255,75 160,75 60 giờ 111,5 108,25 114,25 170,75 124,5 122,04 72 giờ 10,22 15,62 7,25 101,25 17,13 18,75
Hình 3.13 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào
Tại thời điểm phát triển tốt nhất (36-48 giờ), so sánh mật độ tế bào và OD của 6 chủng cho thấy chủng 4A1 có sinh khối tế bào cao nhất. Chủng này được định danh là Bacillus subtilis. Chủng 2B1 có OD thấp nhất nhưng mật độ tế bào tương đối đồng đều với 1C2 và 3B3. Chủng 2B1 được định danh là
0 50 100 150 200 250 300 350 12h 24h 36h 48h 60h 72h
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy theo mật độ tế bào
Bacillus lichenniformis. Riêng 2 chủng 1C2 (Micrococcus luteus) và 3B3 (Lactobacillus pentosus) có thời điểm cuối giai đoạn lũy thừa là 48 giờ, kết quả mật độ tế bào không có sự chênh lệch nhiều so với thời điểm 36 giờ (Hình 3.14).
Hình 3.14 Kết quả OD và mật độ tế bào tại thời điểm tối ưu 36 giờ
Như vậy, kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng theo kết quả đo OD, thể hiện độ đục của dung dịch tương quan với số lượng tế bào và theo kết quả đếm mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm Neubauer trong các khoảng thời gian khảo sát có sự tương đồng với nhau. Giai đoạn tiềm phát trong khoảng 0- 12 giờ, giai đoạn lũy thừa từ 12-48 giờ, giai đoạn cân bằng và suy vong từ 48- 72 giờ. Dựa vào các kết quả trên, chùng tôi chọn mốc thời gian 36 giờ để thu nhận sinh khối tế bào trong điều kiện lên men thể tích lớn.