2.5.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên quá trình phát triển của vi sinh vật
Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian tăng sinh để thu được sinh khối nhiều nhất, tiết kiệm thời gian và chi phí cho sản xuất đồng thời dự đoán được thời gian thích nghi của VSV khi đưa vào môi trường nước thải. Thí nghiệm được thực hiện bằng các phương pháp:
- Phân phối mỗi chủng vào môi trường lỏng, nuôi cấy lắc 12-72 giờ, 30oC.
- Kiểm tra mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD650nm và sử dụng buồng đếm Neubauer như trình bày trong phần 2.4.3.
- Kết quả, số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Excel.
2.5.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ muối lên quá trình phát triển của vi sinh vật
Thí nghiệm nhằm mục đích thỏa mãn các điều kiện cơ bản khi nuôi cấy vi sinh vật trong các hệ thống lên men. Tìm được các khoảng giá trị tối ưu sẽ thu được lượng sinh khối tối ưu sau lên men đồng thời tiết kiệm được nhiều thời gian, kinh phí. Thí nghiệm được thực hiện bằng các phương pháp:
- Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng, thu nhận cùng độ tuổi giống, phân phối vào các nghiệm thức theo tỷ lệ thể tích sau cho mật độ ban đầu là tương đương nhau. Xác định giá trị OD ở
bước sóng 600nm sau các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ (cho tới khi giá trị OD giảm) Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và lấy giá trị OD trung bình. Tốc độ tăng trưởng được tính dựa trên giá trị OD ở thời điểm t0 và thời điểm OD cao nhất (ODmax).
- Các nghiệm thức được thực hiện trong các điều kiện:
o Nhiệt độ 30oC, 32oC, 35oC và 40oC.
o pH = 5, 6, 7, 8
o Nồng độ muối NaCl 7.5‰, 8‰, 8.5‰, 9‰, 9.5‰
Đây là các khoảng chỉ tiêu phổ biến trong nuôi cấy vi sinh vật chịu mặn nói chung và trong điều kiện lên men công nghiệp nói riêng.
- Kết quả, số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Excel.
2.5.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng C và N lên quá trình phát triển của vi sinh vật
- Thí nghiệm nhằm mục đích chọn được nguồn C và N rẻ nhất, cho hiệu suất lên men tốt nhất. Kết quả này sẽ giúp làm giảm chi phí của quá trình sản xuất chế phẩm ở quy mô công nghiệp.
- Môi trường BMS được bổ sung nguồn đường và protein để khảo sát ảnh hưởng của nguồn cung cấp dinh dưỡng. Nguồn đường bao gồm manitol, glucose và lactose. Nguồn protein bao gồm peptone, cao nấm men và cao thịt. Thành phần 9 loại môi trường khảo sát được liệt kê ở bảng 2.3.
- Các chủng vi khuẩn sau khi đồng nhất về tuổi giống, được phân phối vào các môi trường từ MT1 đến MT9. Thành phần cụ thể của từng môi trường được thể hiện trong Phụ lục 8. Xác định giá trị OD ở bước sóng 600nm sau các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4, 5, 6 giờ. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và lấy giá trị OD trung bình. Tốc độ tăng trưởng được tính dựa trên giá trị OD ở thời điểm t0 và thời điểm OD cao nhất (ODmax).
Kết quả, số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Excel.
Bảng 2.3 Thành phần đường và protein trong từng môi trường khảo sát
Môi trường
Nguồn đường Nguồn protein
Manitol Glucose Lactose Peptone Cao nấm men Cao thịt MT1 x x MT2 x x MT3 x x MT4 x x MT5 x x MT6 x x MT7 x x MT8 x x MT9 x x
2.6 Nội dung 6: Tạo chế phẩm vi sinh
2.6.1 Nội dung nghiên cứu
- Giữ giống và nhân giống quy mô nhỏ để đạt thể tích nuôi cấy
- Lên men quy mô lớn trong các bioreactor để thu nhận đủ sinh khối tạo chế phẩm.
2.6.2 Phạm vi nghiên cứu
- Sử dụng 6 chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn ở Nội dung 4 để tiến hành sản xuất chế phẩm.
- Các điều kiện nuôi cấy dựa trên dữ liệu được tối ưu hóa ở Nội dung 5. - Các đơn vị phối hợp thử nghiệm kiểm tra khả năng xử lý nước thải
nhiễm mặn thực tế của chế phẩm:
• Nhà máy Thành Thành Công, Chi nhánh Công ty Cổ phần Xuất nhập khẩu Betrimex - địa chỉ: Lô K, Cụm CN-TTCN Phong Nẫm, Xã Phong Nẫm, Huyện Giồng Trôm, Tỉnh Bến Tre.
• Công ty TNHH Đất Hợp - địa chỉ: số 2 đường số 4, Khu đô thị Vạn Phúc, phường Hiệp Bình Phước, Thủ Đức, Tp. HCM - Các thí nghiệm kiểm tra chất lượng chế phẩm sau 6 tháng bảo quản
được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
- Chế phẩm sau khi thu nhận cùng quy trình công nghệ tuyển chọn chủng và quy trình sản xuất chế phẩm hoàn toàn có thể chuyển giao cho các Trung tâm và doanh nghiệp để nhân rộng và đưa sản phẩm ra thị trường. Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học là một đối tác nhận chuyển giao. Ngoài ra Công ty PG VINA cũng là một đối tác sẳn sàng nhận chuyển giao để thương mại hóa sản phẩm. Bên cạnh đó hệ thống các doanh nghiệp hoạt động trong lĩnh vực công nghệ môi trường là Hội đồng Tư vấn – Kết nối doanh nghiệp của Viện Khoa học Công nghệ và Quản lý Môi trường cũng là các doanh nghiệp sẵn sàng ứng dụng kết quả nghiên cứu của đề tài để triển khai các công trình xử lý.
2.6.3 Phương pháp nghiên cứu 2.6.3.1 Sản xuất giống 2.6.3.1 Sản xuất giống
- Từ các chủng vi sinh vật tuyển chọn được ở Nội dung 5, lưu giữ mỗi chủng 3 ống giống cấp 1 dưới dạng đông khô như trình bày trong mục 2.2.3.3. Khi sử dụng, hoạt hóa chủng bằng cách nuôi cấy trên môi trường tối ưu xác định ở nội dung 5.
- Chọn một khuẩn lạc đơn trên môi trường hoạt hóa cho mỗi chủng VSV, nuôi cấy lắc trong môi trường ở nhiệt độ phòng với thể tích 50 ml, 100 ml tạo giống cấp 2 và cấp 3 cho đến khi mật độ nuôi cấy đạt yêu cầu 109 CFU/ml.
- Kiểm tra mật độ và độ thuần của các giống sau mỗi cấp bằng phương pháp đo OD và quan sát dưới kính hiển vi.
2.6.3.2 Lên men thu nhận sinh khối
- Sử dụng các ống giống cấp 3 của mỗi chủng, bổ sung vào các bioreactor 10 L theo tỉ lệ 5% thể tích sau đó lên men thu sinh khối theo các tiêu chuẩn đã tối ưu hóa ở Nội dung 5.
- Kiểm tra mật độ vi sinh vật hữu hiệu trong các bioreactor. Chế phẩm đạt khi mật độ vi sinh vật hữu hiệu trên 109 CFU/ml và không tạp nhiễm.
- Ly tâm thu nhận sinh khối, tiến hành đông khô tĩnh và phối trộn 6 chủng vi khuẩn mục tiêu theo tỉ lệ 1:1:1:1:1:1 để tạo chế phẩm.
Chi tiết các bước sản xuất, thu nhận sinh khối và tạo chế phẩm được trình bày cụ thể như hình 2.8. Tất cả các bước được thực hiện trong điều kiện vô trùng và áp dụng cho từng chủng giống riêng biệt.
2.6.3.3 Kiểm tra chế phẩm sau thu nhận
- Kiểm tra khả năng tồn tại và mật độ của các chủng vi sinh vật chịu mặn trong sản phẩm chế phẩm sinh học sau thời gian bảo quản (6 tháng)
bằng phương pháp pha loãng, đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa môi trường MSA và định danh lại bằng phương pháp MALDI-TOF.
- Kiểm tra khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn thực tế của chế phẩm: Chế phẩm được pha loãng 10, 50, 100, 500 lần, bổ sung vào nước thải có COD đầu vào 400 mg/L theo tỷ lệ 1:10 (v/v). Tiến hành đo COD tại nhà máy xử lý nước, so sánh hiệu suất làm giàm COD của chế phẩm. Mẫu đối chứng là hỗn hợp các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy tại phòng thí nghiệm trong các điều kiện tối ưu đã khảo sát.