Chủng Thời
gian
Đối chứng G1 G2 G3
COD H% COD H% COD H% COD H%
COD ĐẦU VÀO: 400mg/L
24 giờ 405,22 -1,31 312,67 21,83 326,22 18,45 360,67 9,83
48 giờ 370,67 7,33 182,33 54,42 233,67 41,58 267,33 33,17
72 giờ 322,23 19,44 53,67 86,58 153,33 61,67 127,33 68,17
96 giờ 357,67 10,58 60,33 84,92 124,05 68,99 110,25 72,44
Hình 3.8 Hiệu suất xử lý của các hỗn hợp giống
Có thể thấy, hiệu xuất xử lý tốt nhất đến từ nhóm G1 (5 chủng vi sinh vật có hiệu xuất xử lý riêng lẻ cao nhất) với hiệu xuất xử lý cao gấp 4 lần đối chứng. Trong 3 nhóm phối hợp thử nghiệm, không có sự chênh lệch quá lớn
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Đối chứng G1 G2 G3
Hiệu suất xử lý của các hỗn hợp giống
24h 48h 72h 96h
về hiệu suất ở thời gian 72 giờ và 96 giờ. Nhóm G2 và G3 cho hiệu suất xử lý gần như tương đồng nhau và gấp khoảng 3 lần so với đối chứng chứng tỏ khả năng xử lý của hỗn hợp 10 chủng vi khuẩn chủ yếu là do 5 chủng chịu mặn tốt nhất tạo nên trong khi 5 chủng còn lại đóng vai trò không quá quan trọng trong quá trình xử lý nước thải nhiễm mặn. Dựa trên kết quả này, chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm G1 (1B1, 2B1, 3B3, 4A1, 4B6) và bổ sung thêm 1 chủng chịu mặn cao nhất là 1C2 để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2.4 Thăm dò khả năng xử lý nước thải của hỗn hợp gồm 1 chủng vi sinh vật chịu mặn được tuyển chọn với bùn hoạt tính của nước thải
Kết quả hiệu suất xử lý nước thải và COD của nước thải đầu ra khi xử lý bằng hỗn hợp 1 chủng vi sinh vật trong 10 chủng tuyển chọn khi kết hợp với hỗn hợp vi sinh vật có sẵn trong bùn hoạt tính ban đầu được thể hiện trong bảng 3.12 và Hình 3.9. Trong đó: • Bình 1: Chủng 1B1 + Bùn hoạt tính • Bình 2: Chủng 2B1 + Bùn hoạt tính • Bình 3: Chủng 3B3 + Bùn hoạt tính • Bình 4: Chủng 4A1 + Bùn hoạt tính • Bình 5: Chủng 4B6 + Bùn hoạt tính
• Đối chứng 1: Mẫu nước thải (không bổ sung vi sinh vật và bùn hoạt tính) • Đối chứng 2: bùn hoạt tính không bổ sung chủng vi sinh vật phân lập
được.
Kết quả cho thấy:
- Đối chứng 1: không bổ sung vi sinh vật và bùn hoạt tính có hiệu suất xử lý thấp nhất.
- Đối chứng 2: có bổ sung bùn hoạt tính: hiệu suất xử lý cao (83,31%) vào 24 giờ so với các chủng là 72 giờ. Thời gian thích nghi của vi sinh vật
trong bùn hoạt tính đang hoạt động nhanh, nên sau 24 giờ đã thể hiện hiệu suất xử lý cao nhất, trong khi các hỗn hợp khác phải sau 48-72 giờ. - Các hỗn hợp V1 đến V5 có thời gian xử lý tốt nhất vào 72 giờ, Hiệu suất
cao nhất là 91,42% của V4 (bổ sung chủng 4A1 và Bùn hoạt tính).
Bảng 3.12 Hiệu suất xử lý nước thải và COD của nước thải đầu ra khi xử lý bằng hỗn hợp 1 chủng vi sinh vật trong 10 chủng tuyển chọn khi kết hợp với
hỗn hợp vi sinh vật có sẵn trong bùn hoạt tính ban đầu
Thời gian (giờ)
24 48 72 96
COD H% COD H% COD H% COD H%
Đối chứng 1 405,22 -1,31 370,67 7,33 322,23 19,44 317,67 20,58 Đối chứng 2 205,25 48,69 66,75 83,31 183,12 54,22 196,02 51,00 V1 (Bùn+1B1) 106,33 73,42 27,67 93,08 48,32 87,92 189,92 52,52 V2 (Bùn+2B1) 109,67 72,58 42,33 89,42 62,67 84,33 101,32 74,67 V3 (Bùn+3B3) 195,02 51,25 56,67 85,83 54,33 86,42 72,22 81,95 V4 (Bùn+4A1) 91,66 77,09 14,52 96,37 26,33 93,42 185,67 53,58 V5 (Bùn+4B6) 122,06 69,49 21,33 94,67 44,07 88,98 153,21 61,70
Hình 3.9 Hiệu suất xử lý nước thải của các chủng đơn lẻ khi kết hợp với hệ vi sinh vật có sẵn trong bùn và nước thải
Bảng 3.13 So sánh hiệu suất xử lý nước thải nhiễm mặn của các nghiệm thức phối hợp bùn hoạt tính với các nghiệm thức xử lý riêng lẻ (%)
Thời gian (giờ) 24 48 72 96
1B1 71,67 79,17 90,10 73,33 1B1 + Bùn 73,42 93,08 87,92 52,52 2B1 46,67 73,44 81,22 74,58 2B1 + Bùn 72,58 89,42 84,33 74,67 3B3 73,33 75,19 86,67 73,33 3B3 + Bùn 51,25 85,83 86,42 81,95 4A1 73,86 79,46 92,19 86,67 4A1 + Bùn 77,09 96,37 93,42 53,58 4B6 59,34 75,70 89,74 81,99 4B6 + Bùn 69,49 94,67 88,98 61,7 T/B các chủng riêng lẻ 64,97 76,59 87,98 77,98 T/B các hỗn hợp 68,77 91,87 88,21 64,88 -20 0 20 40 60 80 100 120 24h 48h 72h 96h
H% các chủng phối hợp với bùn Hoạt tính
Đối chứng 1 Đối chứng 2 V1 V2 V3 V4 V5
Hình 3.10 Kết quả so sánh giữa nghiệm thức xử lý riêng lẻ và bổ sung bùn hoạt tính
Khi so sánh với các nghiệm thức xử lý riêng lẻ (Mục 3.4.2.2 – Bước 2) ở trên, kết quả được thể hiện trong bảng 3.13 và hình 3.10 có thể thấy:
- Hỗn hợp có bổ sung bùn hoạt tính có hiệu suất xử lý cao hơn các chủng riêng lẻ.
- Thời gian xử lý tốt nhất là 48-72 giờ ở cả nghiệm thức xử lý riêng lẻ và bổ sung bùn hoạt tính. Tuy nhiên, hiệu suất không chênh lệch hiều so với thời điểm 48 giờ.
- Thời điểm 24 giờ, hiệu suất của tất cả các hỗn hợp bổ sung bùn hoạt tính đều cao hơn so với riêng lẻ. Tuy nhiên, giai đoạn 96 giờ lại có hiệu suất thấp hơn. Điều này có thể do mật độ vi sinh vật có sẵn trong bùn hoạt tính nên thích nghi nhanh vào giai đoạn đầu, nhưng đồng thời cũng nhanh chóng bước vào giai đoạn suy vong khi hàm lượng dinh dưỡng trong môi trường giảm mạnh.
- Hiệu suất trung bình thời điểm 48 giờ của các chủng có bổ sung bùn hoạt
- 020 040 060 080 100 120 1B1 1B1 + Bùn 2B1 2B1 + Bùn 3B3 3B3 + Bùn 4A1 4A1 + Bùn 4B6 4B6 + Bùn H% so sánh giữa xử lý riêng lẻ và bổ sung bùn hoạt tính
24h 48h 72h 96h
tính cao hơn so với riêng lẻ. Ở thời điểm 72 giờ thì không có sự khác biệt.
3.4.2.5 Khảo sát khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của một số chế phẩm hiện có trên thị trường
Kết quả hiệu suất xử lý nước thải và COD của nước thải đầu ra khi xử lý bằng các chế phẩm có/không phối hợp với hỗn hợp giống được thể hiện trong bảng 3.14 và hình 3.9. Trong đó:
• Bình 1: 5.000ml nước thải + Chế phẩm A
• Bình 2: 5.000ml nước thải + Chế phẩm A + hỗn hợp giống • Bình 3: 5.000ml nước thải + Chế phẩm B
• Bình 4: 5.000ml nước thải + Chế phẩm B + hỗn hợp giống • Bình 5: 5.000ml nước thải + Chế phẩm C
• Bình 6: 5.000ml nước thải + Chế phẩm C + hỗn hợp giống
Bảng 3.14 Khả năng xử lý nước thải nhiễm mặn của một số chế phẩm hiện có trên thị trường
Thời gian (giờ)
24 48 72 96
COD H% COD H% COD H% COD H%
Bình 1 201,00 49,75 105,33 73,67 185,11 53,72 207,67 48,08 Bình 2 205,33 48,67 66,75 83,31 44,02 89,00 109,13 72,72 Bình 3 101,33 74,67 55,13 86,22 48,32 87,92 208,03 47,99 Bình 4 109,67 72,58 36,11 90,97 52,33 86,92 42,57 89,36 Bình 5 296,17 25,96 115,99 71,00 156,23 60,94 217,02 45,75 Bình 6 196,33 50,92 92,77 76,81 102,67 74,33 188,33 52,92
Hình 3.11 Hiệu suất so sánh giữa các chế phẩm trên thị trường
Từ hình 3.11 có thể thấy, bình có chế phẩm có thời gian xử lý tốt bắt đầu sau 24 giờ. Các bình có bổ sung chế phẩm và hỗn hợp giống cho hiệu suất xử lý nước thải cao hơn bình không bổ sung giống. Chế phẩm B (EcoCleanTM) có hiệu quả xứ lý cao nhất: đây là chế phẩm chuyên dùng cho xử lý nước mặn có bổ sung enzyme.
3.5 Nội dung 5: Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối
3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Trên môi trường BMS lỏng, kết quả xác định OD sau 6 khoảng thời gian được trình bày ở bảng 3.15 và hình 3.12 cho thấy cả 6 chủng đều có kết quả OD tăng dần từ 12 giờ đến 36 giờ, sau đó giảm dần đến 72 giờ.
Tại thời điểm đầu tiên 12 giờ, giá trị OD thấp nhất là 0,062 (chủng 4B6), cao nhất là 0,119 (chủng 3B3). Tại thời điểm cuối cùng 72 giờ, có 3 giá trị OD âm tính (chủng 1C2, 2B1 và 4B6). Giá trị âm tính chứng tỏ đây là thời gian tế bào vi sinh vật chết nhiều, làm tăng độ đục vượt mức giá trị cân bằng xác định ban đầu. Như vậy, cũng bước đầu cho thấy, trong nuôi cấy trên môi
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Bình 5 Bình 6
H% so sánh với các chế phẩm trên thị trường
24h 48h 72h 96h
trường lỏng, thời gian 72 giờ là đủ để theo dõi sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Bảng 3.15 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD
Chủng 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 12 giờ 0,092 0,078 0,083 0,119 0,205 0,062 24 giờ 0,151 0,247 0,162 0,259 0,198 0,172 36 giờ 0,199 0,282 0,297 0,302 0,366 0,277 48 giờ 0,084 0,117 0,118 0,125 0,146 0,107 60 giờ 0,076 0,053 0,062 0,096 0,052 0,008 72 giờ 0,053 -0,015 -0,002 0,018 0,003 -0,012
Hình 3.12 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo OD
-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 12h 24h 36h 48h 60h 72h
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy theo OD
Song song với các thời điểm xác định OD, việc xác định mật độ tế bào trên buồng đếm Neubauer giúp xây dựng sự tương quan giữa 2 giá trị. Kết quả định lượng trình bày trong bảng 3.16 và hình 3.13.
Mật độ tế bào của 6 chủng có các giá trị dao động trong khoảng 106 tế bào/mL. Thời điểm 12 giờ, chủng có mật độ cao nhất là 4B6, chủng thấp nhất là 2B1. Mật độ tăng dần đến 36 và 48 giờ, sau đó giảm đến 72 giờ. Có 2 chủng 1C2 và 3B3 có mật độ cao nhất vào 48 giờ. Các chủng còn lại đạt cao nhất vào 36 giờ. Mật độ trung bình cao nhất của chủng 4B6, thấp nhất của chủng 2B1. Như vậy, so với giá trị OD, kết quả định lượng có sự khác biệt.
Mặc dù không xác định mật độ tế bào vào thời điểm 0 giờ, nhưng bắt đầu từ 12-36 giờ, đồ thị các chủng thể hiện rõ độ dốc tăng đứng, tương ứng giai đoạn lũy thừa. Chỉ có 2 chủng 1C2 và 3B3 đỉnh dốc nằm ở giai đoạn 48 giờ. Sau đó, đồ thị giảm dần qua giai đoạn suy vong. Chỉ có chủng 3B3 và 4A1 thể hiện trên mật độ tế bào có giai đoạn cân bằng ngắn từ 36-48 giờ trước khi bước vào giai đoạn giảm mạnh do suy vong. Quá trình cân bằng diễn ra trong thời gian ngắn có thể vì thể tích nuôi cấy trong quá trình khảo sát ít, giới hạn trong các erlen 250ml. Điều này làm giảm không gian sống, việc tích lũy các độc chất nhanh hơn. Mặt khác, các chủng này thuộc nhóm chịu mặn, môi trường khảo sát có nồng độ NaCl 5%, các ion này phân ly trong dung dịch nuôi cấy cũng ảnh hường đến quá trình hấp thụ dinh dưỡng lên bề mặt tế bào. Các nghiên cứu cũng chứng minh tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn chịu mặn chậm hơn và dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường xung quanh nhiều hơn so với các chủng vi khuẩn thông thường.
Bảng 3.16 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào Chủng Mật độ tế bào (*106 tế bào/ml) 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 12 giờ 102,33 90,05 40,05 68,02 92,13 192,78 24 giờ 192,05 172,52 78,21 108,93 165,99 180,03 36 giờ 285,21 207,68 140,33 192,67 292,05 277,19 48 giờ 135,75 266,13 118,5 205,33 255,75 160,75 60 giờ 111,5 108,25 114,25 170,75 124,5 122,04 72 giờ 10,22 15,62 7,25 101,25 17,13 18,75
Hình 3.13 Kết quả khảo sát thời gian tăng trưởng tối ưu theo mật độ tế bào
Tại thời điểm phát triển tốt nhất (36-48 giờ), so sánh mật độ tế bào và OD của 6 chủng cho thấy chủng 4A1 có sinh khối tế bào cao nhất. Chủng này được định danh là Bacillus subtilis. Chủng 2B1 có OD thấp nhất nhưng mật độ tế bào tương đối đồng đều với 1C2 và 3B3. Chủng 2B1 được định danh là
0 50 100 150 200 250 300 350 12h 24h 36h 48h 60h 72h
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy theo mật độ tế bào
Bacillus lichenniformis. Riêng 2 chủng 1C2 (Micrococcus luteus) và 3B3 (Lactobacillus pentosus) có thời điểm cuối giai đoạn lũy thừa là 48 giờ, kết quả mật độ tế bào không có sự chênh lệch nhiều so với thời điểm 36 giờ (Hình 3.14).
Hình 3.14 Kết quả OD và mật độ tế bào tại thời điểm tối ưu 36 giờ
Như vậy, kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng theo kết quả đo OD, thể hiện độ đục của dung dịch tương quan với số lượng tế bào và theo kết quả đếm mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm Neubauer trong các khoảng thời gian khảo sát có sự tương đồng với nhau. Giai đoạn tiềm phát trong khoảng 0- 12 giờ, giai đoạn lũy thừa từ 12-48 giờ, giai đoạn cân bằng và suy vong từ 48- 72 giờ. Dựa vào các kết quả trên, chùng tôi chọn mốc thời gian 36 giờ để thu nhận sinh khối tế bào trong điều kiện lên men thể tích lớn.
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ muối lên sự phát triển của vi sinh vật sự phát triển của vi sinh vật
3.5.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi sinh vật
Khoảng giá trị nhiệt độ từ 30 oC đến 40oC là khoảng tương đối tốt cho sự phát triển của hầu hết các chủng vi khuẩn. Ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn đều có thể ức chế, làm chậm tốc độ phát triển, hoặc làm chết vi khuẩn.
0,199 0,282 0,297 0,302 0,366 0,277 285,21 207,68 140,33 192,67 292,05 277,19 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 1B1 1C2 2B1 3B3 4A1 4B6 OD Mật độ tế bào
Tất cả các chủng đều sinh trưởng tốt trong môi trường có nhiệt độ từ 30OC đến 40OC (Bảng 3.17 và hình 3.15). Trong đó chủng 1B1 sinh trưởng tốt trong hầu hết các môi trường MSA tốt nhất trong khoảng 32OC với giá trị ODmax đạt mức cao nhất là 0,296 đạt trong thời gian t=5 trong khoảng thời gian khoảng 6 tiếng theo dõi. Trong khi đó chủng 1C2 lại sinh trưởng tốt nhất ở khoảng nhiệt độ là 40OC với tốc độ tăng trưởng so với thời điểm ban đầu là tăng 0,299. 1C2 đạt tốc độ sinh trưởng với giá trị ODmax=0,448 gấp gần 3 lần và với khoảng nhiệt độ là 35OC thì cũng phát triển tốt ở giờ thứ 5 với OD=0,368 gấp 2,4 lần so với tốc độ sinh trưởng của chủng trong khoảng thời gian sinh trưởng đầu tiên với thời gian sinh trưởng tối ưu là 4-5 giờ.
Chủng 2B1 sinh trưởng tốt nhất ở khoảng nhiệt độ là 35OC với tốc độ tăng trưởng so với thời điểm ban đầu là tăng 0,07 ở khoảng thời gian khoảng 5 tiếng theo dõi. Chủng 2B1 đạt tốc độ sinh trưởng với giá trị ODmax = 0,3815 gấp gần 2,5 lần so với việc nuôi cấy ở 30OC và với khoảng nhiệt độ là 40OC và t=5, OD=0.3545 gấp 2,3 lần so với tốc độ sinh trưởng ban đầu của chủng. Trong khi đó chủng 3B3 phát triển tốt nhất ở 35OC tại t=6 thì ODmax đạt 1,171 và cũng là thời điểm chủng này phát triển mạnh nhất. Chủng 4A1 và 4B6 thì sinh trưởng tốt trong môi trường có nhiệt độ là 35OC và 32OC so với thời điểm ban đàu thì chủng 4A1 tăng 2.033 so với thời điểm nuôi cấy ban đầu và chủng 4B6 thì tăng 1,314. Nếu so giữa thời điểm t=5 thì với nhiệt độ 400C thì chủng 4A1 đạt tốc độ sinh trưởng với giá trị ODmax=0,516 gấp gần 2,4 lần và với khoảng nhiệt độ là 35OC thì cũng phát triển tốt ở giờ thứ 5 với OD=0,316 gấp 1,4 lần và chủng 4B6 đạt tốc độ sinh trưởng với giá trị ODmax=0,4665 gấp gần 2,7 lần và với khoảng nhiệt độ là 35OC thì cũng phát