Nghiên Cứu Tổng Hợp Và Tách Chiết Glucosamine Từ Sinh Khối Nấm Sợi Aspergillus, Mucor

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ TÁCH CHIẾT GLUCOSAMINE TỪ SINH KHỐI NẤM SỢI ASPERGILLUS, MUCOR NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ :23.04.3898 ĐINH SỸ MINH LĂNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀI TRÂM HÀ NỘI 2007 Mở đầu Chúng ta kỷ nguyên có tiến vượt bậc khoa học kỹ thuật, nhiều ứng dụng cơng nghệ phục vụ đời sống Dược phẩm lĩnh vực có nhiều thành tựu đáng kể Giờ sản phẩm cơng nghiệp dược ngồi loại thuốc để chữa bệnh cịn có nhiều dạng khác thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung để góp phần cải thiện sức khỏe, giảm q trình lão hóa, quan trọng cịn tạo nên biến đổi tích cực thể chất người qua hệ Trong thời gian tới, sản phẩm thuốc tổng hợp theo đường hóa học dần thay sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên chúng khơng độc có phản ứng phụ Glucosamine chất thể tự tổng hợp để tái tạo sụn, nhiên lớn tuổi, chức suy giảm gây nên triệu chứng khớp thối hóa, cứng khớp viêm khớp, người ta đưa từ bên vào thể dạng thuốc uống nhằm kích thích tăng sinh tế bào sụn, cung cấp dưỡng chất cho sụn khớp, tạo dịch nhày cho sụn khớp, làm tăng khả bôi trơn, tái tạo sụn Biện pháp hữu hiệu hay dùng thuốc giảm đau chống viêm tức thời steroid phisteroid uống tiêm trực tiếp vào ổ khớp, nguyên nhân dẫn đến tác dụng phụ nghiêm trọng viêm loét dày, tá tràng, xuất huyết, tiêu hố… tình trạng bệnh khơng không cải thiện mà bệnh nhân lệ thuộc vào thuốc nhiều Trên giới, chitin, chitosan glucosamine nghiên cứu ứng dụng thực tiễn từ lâu, sản lượng chitin-chitosan nguyên liệu để sản xuất glucosamine khoảng 12000 năm, đầu Nhật Bản (mỗi năm khoảng 7000 tấn), sau Mỹ, ấn độ, Trung Quốc… Hiện glucosamine thu đường tổng hợp hóa học đường tự nhiên : từ vỏ hải sản tôm cua, mô động vật hay từ tế bào nấm Nhiều cơng trình nghiên cứu ưu từ việc sản xuất glucosamine có nguồn gốc tự nhiên, sản xuất glucosamine từ tế bào nấm là thu từ hải sản hay từ mô động vật, ưu điểm lớn glucosamine từ nấm không chứa protein gây dị ứng thu từ vỏ hải sản, hàm lượng tro thấp, khơng có kim loại nặng, mức độ tinh sách cao hơn, chủ động nguồn thu không phụ thuộc vào mùa vụ từ nguyên liệu hải sản hay mô động vật Các nhà khoa học Mỹ, Brazil, Thái Lan nghiên cứu tổng hợp tách chiết chitin, chitosan glucosamine thành cơng từ nấm sợi, nấm men có nhiều cơng trình ứng dụng quy mơ sản xuất Việt nam, chitin, chitosan glucosamine sản xuất từ vỏ hải sản nhiên lại chưa có nghiên cứu đề cập đến nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật Xuất phát từ lợi ích thiết thực đó, PGS.TS Nguyễn Thị Hồi Trâm cộng thuộc Viện công nghiệp thực phẩm lựa chọn hướng nghiên cứu sản xuất glucosamine từ nấm sợi Dưới phần trình bày kết nghiên cứu phịng thí nghiệm tơi mong tiền đề để áp dụng vào sản xuất thực nghiệm quy mô lớn Hướng nghiên cứu đề tài : - Khảo sát, lựa chọn chủng nấm sợi có khả tổng hợp sinh khối chứa hàm lượng chitin, chitosan cao - Tìm điều kiện cơng nghệ thích hợp để lên men nấm sợi quy mơ phịng thí nghiệm (trên máy lắc thiết bị lít- chọn thành phần mơi trường, điều kiện ni cấy tối ưu) - Tìm điều kiện cơng nghệ để tách chiết chitin, chitosan; thu glucosamine từ sinh khối nấm sợi TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chitin, chitosan glucosamine Chitin, chitosan polymer hữu phổ biến thiên nhiên, đứng sau cellulose mặt số lượng, chúng tạo trung bình 20g năm/1m2 bề mặt trái đất Trong thiên nhiên chitin tồn động vật thực vật Chitin tồn trạng thái tự mà ln liên kết với chất protein, chất khoáng, chất màu, hợp chất hữu khác - động vật chitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun trịn Trong động vật thuỷ sản tơm cua ghẹ hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ cao : 14-35% trọng lượng khô - Trong giới thực vật, vi sinh vật chitin-chitosan có thành tế bào nấm Zygomyces, số tảo Chlorophiceae vi khuẩn.[3] Glucosamine nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp chất nhờn sụn khớp thể, tham gia vào chức giải độc gan, thận, chống viêm gan, dị ứng thiếu O2 máu Các chủng vi sinh vật vó khả tổng hợp glucosamine thường mang gene GFAI nagA Để nâng cao khả tổng hợp glucosamine, nhiều nhà nghiên cứu tìm cách chuyền gene vào nấm men Saccharomyces Cerevisiae vi khuẩn E.coli Khi thủy phân cắt mạch glucozid deacetyl hoá chitin chitosan thu sản phẩm glucosamine 1.2 Cấu tạo, tính chất 1.2.1 Chitin 1.2.1.1 Cấu tạo Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ đơn vị N–acetyl–β–D glucosamine nối với nhờ cầu nối β-1,4 glucozit Công thức phân tử chitin [C8H13O5]n, Mchitin = (203.09)n Trong đó: n thay đổi tùy thuộc vào loại nguyên liệu tôm Thẻ: n = 400÷500 tơm Hùm: n = 700÷800 Cua: n = 500÷600 Cơng thức cấu tạo CH2OH CH2OH H CH2OH H OH H H H H OH H HN-COCH3 H H H n H HN-COCH3 H OH H H H HN-COCH3 Hình 1.1: Cấu trúc hình học chitin 1.2.1.2 Tính chất vật lý Chitin có màu trắng trắng ngà, vơ định hình Chitin thể rắn, xốp nhẹ, không mầu, không mùi, không vị Chitin không tan nước, mơi trường kiềm, acid lỗng chất dung mơi hữu ether, rượu… lại hịa tan dung dịch đặc nóng muối thioxianat Liti (LiSCN) thioxianat canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin tương đối ổn định với chất oxy hóa khử, thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Ca(ClO)2 …lợi dụng tính chất người ta sử dụng chất oxy hóa để khử màu cho chitin [4] Chitin có độ đề axetyl hoá 50% tan tốt nước gọi chitin tan [20] Độ đề axetyl hoá (deacetylation) khả loại nhóm axetyl (-COCH3) khỏi cấu trúc chitin Chitin có khả hấp thụ tia hồng ngoại bước sóng: λ = 884ữ890 àm 1.2.1.3 Tớnh cht húa hc Khi un nóng acid HCl đậm đặc chitin bị thủy phân hoàn toàn tạo thành 88.5% D-Glucosamin 22.5% acid acetic, trình thủy phân bắt đầu xảy cầu nối glucozit, sau loại bỏ nhóm acetyl (–CO–CH3) (C32H54N4O21)x + 2(H2O)x (C28H50N4O19)x + 2(CH3 – COOH)x Khi đun nóng chitin dung dịch NaOH đậm đặc chitin bị gốc acetyl tạo thành chitosan Chitin + n NaOH (đậm đặc) Đun nóng Chitosan + n CH3COONa Chitin cấu trúc chặt chẽ mang nhóm chức axetyl (-CO-CH3) nên khó tham gia vào phản ứng hố học, ứng dụng chitin hạn chế.[4] 1.2.1.4 Tính chất sinh học Chitin khơng độc với người động vật thí nghiệm, Arai K cộng xác định LD50 = 16 g/kg thể trọng (LD50 “Lethal Dose”: Liều gây chết 50% số động vật thử nghiệm) [13] Chitin có khả phân huỷ sinh học Chitin khơng có tính kháng ngun, chúng hồ hợp với mơ sống, khơng gây dị ứng 1.2.2 Chitosan 1.2.2.1 Cấu tạo Chitosan polymer hữu có cấu trúc tuyến tính từ đơn vị β–D Glucosamin liên kết với liên kết β-1,4 glucozit Công thức phân tử: [C6H11O4N]n, MChitosan = (161.07)n Công thức cấu tạo CH2O H O CH2O O H H OH H O H H H OH H NH CH2O O H H O H NH O OH H n H O H H NH Hình 1.2: Cấu trúc hình học chitosan 1.2.2.2 Tính chất vật lý Chitosan dạng bột có màu trắng ngà, cịn dạng vẩy có màu trắng hay vàng, xốp nhẹ, không mùi, không vị, trọng lượng phân tử trung bình từ 10.000 500.000 Dalton tùy lại Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan nước, dung dịch kiềm acid đậm đặc, cồn, axeton dung môi hữu khác tan acid lỗng (pH=6) điển tan acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo (+), nhớt suốt, nhờ mà keo chitosan khơng bị kết tủa có mặt số ion kim loại nặng Pb, Hg…Độ nhớt dung dịch chitosan axit loãng phụ thuộc trọng lượng phân tử chitosan, nguồn gốc phương pháp điều chế Chitosan kết hợp với aldehyde điều kiện thích hợp, hình thành gel, sở để bẫy tế bào, enzyme [4] Do cấc trúc tinh thể chitosan có nhiều mao quản nên khả hấp thụ nước cao Chitosan polycation mạch thẳng nên có khả bám dính tốt vào bề mặt tích điện âm có khả hấp phụ nhiều ion kim loại 1.2.2.3 Tính chất hố học Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với dung dịch Lugon I2/KI chitosan cho màu nâu, màu nâu chuyển sang đỏ tím có mặt H2SO4 ( Phản ứng Van – wisselingh) Đây phản ứng đặc trưng chitosan, phản ứng không xảy với polysaccharid có số mắt xích nhỏ 6, phản ứng dùng để phân tích định tính chitosan [20] Ngồi kiểm tra có mặt chitosan phản ứng với KMNO4 acid acetic, dung dịch chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt hay phản ứng với Kali Cromat acid acetic xuất kết tủa màu vàng.[3,4] Phản ứng cắt mạch: trình làm đứt liên kết β-(1,4) - glucozit Có số phương pháp chủ yếu để cắt mạch [18]:  Cắt mạch phương pháp Enzyme: sử dụng enzyme chitosanase, papain…  Cắt mạch dung dịch NaNO2/H+…  Cắt mạch tác nhân oxy hoá như: H2O2… Phản ứng với H2SO4 tạo tinh thể cầu chitosan sunfat Phản ứng sunfat hoá: gây tác nhân SO3 N, N–dimetyl phormamid tạo thành sunfat este chitosan sunfat Phản ứng nitrat hoá: phản ứng xảy hỗn hợp anhydrit axetic/ axit axetic HNO3 đậm đặc tạo nitrat este Phản ứng với axit: nhóm amin tự có khả phản ứng với axit [3] 1.2.2.4 Tính chất sinh học Chitosan không độc với người động vật Arai K cộng xác định LD50 = 16g/kg thể trọng [13] Chitosan khơng gây độc cấp tính, độc tính chỗ, độc tính bán trường diễn, khơng ảnh hưởng đến chức sinh hoá quan tạo máu thể [8] Chitosan khơng có tính kháng ngun, hồ hợp với mơ sống, có khả phân huỷ sinh học Chitosan có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào, tăng khả tái tạo da, nhanh lành vết thương [29] Chitosan có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, đăc biệt chủng vi khuẩn bị nhờn thuốc [29] Hai số quan liên quan đến hoạt tính sinh học chitosan [13]: - Mức độ đề axetyl hoá: mức độ chuyển nhóm amino axetyl (-NH-CO-CH3) thành nhóm amin (-NH2) - Trọng lượng phân tử trung bình chitosan 1.2.3 Glucosamine 1.2.3.1Cấu tạo Hình 1.3 : Cấu trúc hình học glucosamine Glucosamine có cơng thức tổng qt là: C6H13NO5 gọi β-D glucosamine, dẫn xuất amin đường glucose 1.2.3.2 Tính chất vật lý Trọng lượng phân tử 170,17 g/mol Nhiệt độ nóng chảy 150oC 1.2.3.3 Tính chất hố học pH sinh lý nhóm amin phân tử glucosamine mang điện tích dương Muối glucosamine chứa anion nên trung hòa điện Trong trường hợp muối glucosamine glucosamine sunfat glucosamine hydrochlorid anion tương ứng sunfat chlorid Cả ba dạng muối glucosamine glucosaminesunfat, glucosamine hydrochlorid N-axetyl-glucosamine tan nước.[18] 1.2.3.4 Tính chất sinh học Glucosamine tổng hợp thể khơng độc hại với thể khơng gây rối loạn tiêu hóa Glucosamine aminomonosacharid, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan Khi vào thể kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường Kết trình trùng hợp tạo muco-polysacharid, thành phần tạo nên sụn khớp Nó đồng thời ức chế enzyme phá hủy sụn khớp collagenase, phospholipase A2 giảm gốc tự superoxid phá hủy tế bào sinh sụn, kích thích sinh sản mơ liên kết xương, giảm trình calcium xương[18] Do glucosamine làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả bôi trơn dịch khớp 76 - Hàm lượng glucosamine thu từ phương pháp III cho kết tốt nhất, cao xử lý sinh khối theo phương pháp I phương pháp II Chúng chọn phương pháp III làm phương pháp xử lý sinh khối trước thủy phân acid đặc để thu glucosamine 3.3.2.2 Nghiên cứu lựa chọn acid thủy phân thích hợp Tiến hành thí nghiệm với hai loại acid dùng để thủy phân sinh khối acid HCl acid H3PO4 nồng độ 20% Cũng giống acid HCl H2SO4 , việc sử dụng acid H3PO4 để thủy phân tạo sản phẩm muối glucosamine phosphate, muối có đặc tính sinh học giống glucosamine chlorid glucosamine sulfat.[ 32 ]Kết thể bảng 3.13 Bảng 3.13 Lựa chọn acid thủy phân thích hợp 92)Dung mơi 93)Glucosamine (mg/g) 94)HCl 20% 95)215,4 96)H3PO4 20% 97)207,8 *Nhận xét : - Các thông số thu cho thấy acid H3PO4 20% cho kết phân tích glucosamine gần tương đương với acid HCl nồng độ, nhiên acid H3PO4, tiếp tục khảo sát nồng độ cao hơn, nồng độ tối đa HCl 35,5%, nồng độ HCl bay ăn mịn mạnh Xét đến mức độ an tồn, kinh tế tính hiệu chúng tơi chọn H3PO4 cho khảo sát 77 ảnh 3.5 : Mẫu đường chuẩn mẫu phân tích glucosamine 3.3.2.3 Nghiên cứu lựa chọn nồng độ acid thủy phân thích hợp Tiến hành khảo sát acid H3PO4 theo nồng độ 10%, 20%, 30%, 40%, 50% để xét khả cắt mạch thu glucosamine Kết thể bảng 3.14 Bảng 3.14 Lựa chọn nồng độ acid thủy phân thích hợp 98)Nồng độ 99)Glucosamine (mg/g) 100) 10% 101) 47,3 102) 20% 103) 210,1 104) 30% 105) 215,4 106) 40% 107) 259,9 108) 50% 109) 260,8 *Nhận xét : Khi tăng nồng độ acid hàm lượng glucosamine thu hiệu suất chuyển hóa tăng lên, nồng độ 40, 50% lượng glucosamine thu cao so với glucosamne thu nồng độ 10%, 20%, 30% nồng độ 40, 50% sai khác hàm lượng glucosamine thu không đáng kể Để đảm bảo hiệu suất thủy phân tốt tiết kiệm dung môi cách hợp lý, lựa chọn acid H3PO4 nồng độ 40% để thủy phân cắt mạch thu glucosamine 3.3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp 78 Để thực khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới khả thủy phân acid, tiến hành ba mức nhiệt độ 80,90,100OC Các điều kiện khác : H3PO4 40%, thời gian giờ, tỷ lệ sinh khối acid 1: 2(khối lượng/thể tích) Kết thể bảng 3.15 Bảng 3.15 Lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp 110) Nhiệt 111) Hàm lượng glucosamine (mg/g) độ thủy phân 112) 80 113) 239,3 114) 90 115) 268,9 116) 100 117) 252,4 *Nhận xét : - Qua kết thể bảng số liệu chúng tơi có nhận xét khả cắt mạch tăng lên với tăng nhiệt độ, nhiệt độ 1000C hàm lượng glucosamine giảm xuống Do chúng tơi chọn nhiệt độ để tiến hành khảo sát 90O 3.3.2.5 Nghiên cứu lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp Để khảo sát ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hiệu suất chuyển hóa glucosamine , chúng tơi cố định định tỷ lệ sinh khối thể tích dung dịch HCl : 2, nhiệt độ 90 OC nồng độ dung dịch H3PO4 40% Các thời gian tiến hành khảo sát 6, , , 10 Kết thể bảng 3.16 Bảng 3.16 Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp 118) Thời 119) Hàm lượng glucosamine (mg/g) 79 gian thủy phân 120) 121) 228.6 122) 123) 253,9 124) 125) 271,5 126) 127) 272,1 10 129) 272,4 128) • Nhận xét : - Dựa vào kết thu nhận thấy, hiệu suất điều chế tăng theo thời gian tăng không đáng kể thời gian cắt mạch Do đó, chúng tơi chọn thời gian để thủy phân thu glụcosamine 3.3.2.6 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ sinh khối acid thủy phân thích hợp Lượng thể tích acid tiêu tốn để thực trình thủy phân cần phải hợp lý, điều liên quan đến hiệu suất cắt mạch mà cịn giảm bớt lượng acid khơng cần thiết, tiết kiệm chi phí q trình chun hóa glucosamine Thí nghiệm tiến hành dựa điều kiện thủy phân tối ưu : nhiệt độ 90 OC nồng độ dung dịch H3PO4 40% thời gian Các tỷ lệ sinh khối dung môi khảo sát : 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, : Kết thể bảng 3.17 Bảng 3.17: Lựa chọn tỷ lệ sinh khối acid thủy phân thích hợp 80 130) Tỷ lệ 131) Hàm lượng glucosamine (mg/g) sinh khối dung môi 132) 1:1 133) 134) 1:2 136) :3 137) 283,3 138) 1:4 139) 282,5 140) 1:5 141) 283,9 135) 106,5 260 *Nhận xét -Từ kết thu được, chọn tỷ lệ sinh khối dung mơi thích hợp : 3, thể tích acid tămg nữa, lượng glucosamine thu không đổi 3.3.2.7 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp Sau dùng cồn để kết tủa glucosamine, tiến hành kiểm tra mức độ kết lắng nhiệt độ : Nhiệt độ phòng (25OC), OOC, 4OC sau thời gian để lắng tiếng Kết thể bảng 3.18 Bảng 3.18 Lựa nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp 81 Nhiệ 142) 143) Glucosamine (mg) t độ kết lắng Nhiệ 144) 145) 845,4 t độ phòng (25OC) 146) 4OC 147) 1356,5 148) OOC 149) 1522,6 *Nhận xét : - Nhiệt độ để glucosamine kết lắng tốt OOC, chọn nhiệt độ thích hợp q trình thu hồi glucosamine 3.3.2.8 Nghiên cứu lựa chọn thời gian kết lắng glucosamine thích hợp Cũng giống chọn nhiệt độ kết lắng, thời gian kết lắng quan trọng Yếu tố công nghệ giúp việc thu hồi glucosamine đảm bảo mặt thời gian để tiến hành thực bước quy trình cách ngắn Các thời gian lựa chọn để kiểm tra mức độ kết lắng : 2,3,4,5 OOC Kết thể bảng 3.19 Bảng 3.19 Lựa nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp 150) Thời gian để 151) Glucosamine (mg) lắng 152) 153) 810,3 154) 155) 1257,6 156) 157) 1521,3 82 158) 159) 1521,9 160) 161) 1523,4 • Nhận xét : - Sau giờ, tiếp tục để lắng lượng glucosamine xấp xỉ Chúng lựa chọn thời gian kêt lắng thích hợp 3.3.2.9 Lựa chọn chế độ sấy thích hợp Cùng lượng mẫu nhau, sai khác hàm ẩm mẫu sau sấy ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng glucosamine có mẫu chất rắn phân tích Để so sánh mức độ sai khác này, chọn chế độ sấy mẫu : Để khô nhiệt độ phịng, 40OC/30 phút, sấy chân khơng 40OC/10 Bảng 3.20 Lựa chọn chế độ sấy thích hợp 162) Chê độ sấy 164) Để 163) Hàm lượng glucosamine (mg/g) 165) 275,9 167) 279,6 169) 287,4 khô nhiệt độ phòng 166) Sấy tủ sấy 40OC/30 phút 168) Sấy chân không 40OC/10 phút 83 * Nhận xét - Kết cho hiệu suất thu hồi glucosamine để khô mẫu nhiệt độ phòng 275,9 mg/g thấp sấy mẫu nhiệt độ 40OC : 279,6 mg/g tốt thực sấy chân không: 287,4 mg/g, điều cho thấy việc lựa chọn chế độ sấy quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng glucosamine có mẫu Chúng tơi chọn chế độ sấy chân không 40OC/10phút để thu hồi glucosamine phục vụ cho trình tinh KếT luận Và đề nghị Kết luận Sau thời gian làm luận văn, đề tài đạt kết sau : Từ chủng nhận từ sưu tập giống Viện Công nghiệp Thực phẩm lựa chọn chủng đại diện cho hai ngành phụ nấm túi nấm tiếp hợp có khả tổng hợp sinh khối chứa chitosan theo phương pháp lên men chìm: - A.niger Ex2006-1và A.oryzae Jo (ngành phụ nấm túi) tổng hợp sinh khối khô hệ sợi : 7,15 g/l - 8,37 g/l, hàm lượng chitosan : 18,03 mg/l - 123,97 mg/l 84 - B.trispora WH2 Rhizopus sp.BG (ngành nấm tiếp hợp) tổng hợp sinh khối khô hệ sợi : 5,71 g/l-4,55 g/l, hàm lượng chitosan 233,65 mg/l-282,47 mg/l Đã nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy chủng nấm sợi tổng hợp sinh khối hệ sợi chứa hàm lượng chitosan cao quy mô máy lắc thiết bị lên men lít : - A.oryzae Jo : Môi trường chứa pepton, sacaroza, thời gian nuôi cấy 48 giờ, pH=6,5; tốc độ lắc 250 vòng/phút, nhiệt độ nuôi cấy từ 28-30OC, tỉ lệ tiếp giống 5.105 bào tử/ml, sinh khối khô đạt 11,6 g/l, chitosan đạt 290,1 mg/l - Rhizopus sp.BG : Môi trường chứa cao nấm men, glucoza, thời gian nuôi cấy 64 giờ, pH=6,5-7; tốc độ lắc 250 vịng/phút, nhiệt độ ni cấy từ 28-30OC tỉ lệ tiếp giống 5.105, sinh khối khô đạt 8,4 g/l, chitosan đạt 997,1 mg/l - điều kiện ni cấy thiết bị lên men lít với lít mơi trường chứa cao nấm men, glucoza, thời gian nuôi cấy 64 giờ, pH=6,5-7; nhiệt độ nuôi cấy từ 28-30OC tỉ lệ tiếp giống 5.105, chế độ cấp khí 0,65-0,67 lít khơng khí/lít mơi trường/phút, sử dụng khuấy mái chèo với tốc độ 150-190 vòng/ phút sau 65 sinh khối khô đạt 12,8 g/l, chitosan đạt 1930,4 mg/l Khi nghiên cứu động học trình lên men chủng Rhizopus sp.BG, pH tăng cực đại 6,81 sau 36 nuôi cấy dao động không thay đổi đến kết thúc lên men 60-65 giờ, nhiên hàm lượng chitosan thời điểm 36 đạt 534,1 mg/l, tiếp tục tăng kéo dài thời gian nuôi cấy đạt cực đại 1927,2 mg/l sau 60 nuôi cấy Đã lựa chọn điều kiện tách chiết chitosan, glucosamine từ sinh khối nấm sợi Rhizopus sp.BG - Tách chiết chitosan : Xử lý kiềm loãng : NaOH 1M (1:30 ) 121OC/15 phút 85 Xử lý acid loãng : Acid acetic 2% (1:40) 95OC, 8h ; chỉnh pH=10, ly tâm, rửa,sấy 60OC /5 phút - Tách chiết glucosamine : + Xử lý sinh khối trước thủy phân: NaOH 4% 121OC 15 phút acid HCl lỗng 2% nhiệt độ phịng 24 giờ, thủy phân acid H3PO4 40%, nhiệt độ 90OC, thời gian , tỷ lệ sinh khối dung môi : : (khối lượng /thể tích) + Kết lắng cồn thu glucosamine theo điều kiện sau : Nhiệt độ kết lắng : OOC, thời gian kết lắng : giờ, sấy chân không 40OC/10 phút Đề nghị Đề tài luận văn phần đề tài Khoa học công nghệ cấp Nhà nước KC04.27.Sau thời gian nghiên cứu thu kết bước đầu điều kiện lên men, quy trình chiết tách chitin, chitosan glucosamine từ nấm sợi ứng dụng quy mơ phịng thí nghiệm Do thời gian có hạn nên tơi chưa thể thực những nghiên cứu tiếp, đặc biệt phần tinh 86 glucosamine kiêm tra tính an tồn sản phẩm, phần mà tơi quan tâm Nếu có điều kiện, tơi mong muốn tiếp tục nghiên lựa chọn thêm cải tạo chủng giống (sử dụng kỹ thuật đột biến, chuyển gene ), tìm hiểu nghiên cứu quy trình sản xuất để tối ưu hố q trình cơng nghệ lên men quy mô công nghiệp, nâng cao hiệu suất thu hồi tinh glucosamine, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày môt lớn thị trường, sản phẩm ngoại nhập giá thành lại đắt 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, Đào Thị Lương, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hồng Yến, chương trình vi sinh vật đại cương vi nấm (Internet : vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vinam01a.htm) Trần Thái Hòa Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình deacetyl cắt mạch chitin Tạp chí khoa học, đại học Huế, số 27, 2005 Trần Thị Luyến-Đại học Thủy sản Nha Trang- Tiềm phát triển công nghệ sản xuất chitozan sản phẩm công nghiệp từ vỏ tôm cua phế liệu thủy sản (Nguồn Internet) Trần Thị Luyến- Đỗ Minh Phụng - Nguyễn Anh Tuấn Sản xuất chế phẩm kỹ thuật y dược từ phế liệu thủy sản Nhà xuất nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh – 2005, trang 19- 44 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú Phương pháp enzym tách chiết chitin từ vỏ tơm Tạp chí Dược liệu, tập 11, số 2/2006, trang 77-80 Lưu Thị Lệ Thủy, Trần Thị Tuyết, Nghiên cứu tận dụng chế phảm nguyên liệu thủy sản (vỏ tôm,cua,…) đẻ chiết rút chitin-chitosan sử dụng công nghiệp Báo cáo đề tài Phân Viện công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, trang 11-16 Lê Anh Thư Thối hố khớp Tạp chí sức khoẻ đời sống số 36, tháng 2/1998, trang 28-29 Nguyễn Thị Ngọc Tú cộng sự: Báo cáo hội nghị khoa học - Viện Hoá học lần thứ II, Hà Nội (22/02/1995) Tuyển tập báo cáo khoa học, trang 17 Nguyễn Thị Ngọc Tú, Phạm Thị Mai (1995) Nghiên cứu ứng dụng chitosan dùng y tế Tạp chí Dược học, trang 14-15 88 10.Nguyễn Thị Ngọc Tú cộng Chitin/chitosan tách chiết từ vỏ tơm phế thải, ngun liệu có nhiều ứng dụng làm thuốc chữa bệnh Báo cáo toàn văn hội nghị khoa học bỏng lần thứ 3, ngày 2-3/12/1994, trang 24 11.Nguyễn Thị Hoài Trâm, Phạm Thị Thu, Đỗ Thị Thuỷ Lê Nghiên cứu khả tổng hợp β-carotene chủng nấm sợi Blakeslea trispora WH1 WH2 Tạp chí cơng nghệ sinh học (2), trang 193-204 12.Đào Tố Uyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào cộng Nghiên cứu thử nghiệm chitosan làm chất phụ gia sản xuất giò, bánh (Internet : vfa.gov.vn/Docs/bai912.doc) Tiếng Anh 13.Arai K, Fuijta T., Bullto Kai (1968) Reg Fish-res.lab : 56-89 14.Asako Hiai, Hiashi Odani (1991) Polymer bullectin 26 : 95-100 15.Brent Rogers Proposal for making a “Subsrantial Equivalence” notification for Non-shellfish Glucosamine Hydrochloride under Regulation (EC).(Internet : www.food.gov.uk/multimedia/pdfs/glucosamine1.pdf) 16.Dang Van Luyen, Dang Mai Huong (1996) Chitin and derivaties Polymeric Materials Encyclopodia CRC press, Inc, 2c : 49-52 17.Dr.Craig W.Martin (2004) Glucosamine: Review of its effectiveness in treating knee osteoarthritis.(Internet :www.worksafebc.com/health_care_providers/Assets/PDF/posterpresentations/glucosamine_review_knee_osteoarthritis.pdf) 18.E.Fosdick, J.A.Bohlmann, J.R.Tinkle, B.L.Ray (2004) Glucosamine and Method of making glucosamine from microbial US patent 0077055A1 89 19.Lawrence E.Fosdick, John A.Bohlmann,James R.Trinkle,Brenda L.Ray Glucosamine and method of making glucosamine from microbialbiomass US patent No 0077055 A1 2004 20.L de Oliveira Franco, Rita de Cassia C Maia, Ana Lucia F Porto, Arminda Sacconi Messias, Kazutaka Fukushima, Galba Maria de Campos Takaki Heavy metal biosorption by chitin and chitosan isolated from Cunninghammella elegans (IMF 46109) Brazilian Journal of Microbiology Vol 35 no.3 SãoPaolo July/Sept 2004 ISSM 1517-8382 21.Marin G Peter – University of Potsdam Chitin and chitosan in fungi : 123132 22 Neena Gandhi, James Kenneth Laider Preparation of glucosamine hydrochloride US patent No 6486307 B1 2002 23.P.Pochanavanich & W.Suntornsuk (2002) Fungal chitosan production and its characterization Letters in Applied Microbiology 35 : 17-21 24.Ricardo A.A, Mirzarelli (1996) Chitin Chemistry polymeric materials encyclopedia, 2(9) : P 1217-1223 25.Rosa Valeria daSilva Amorim, Wanderley de Souza, Kazutaka Fukushima, Galba Maria de Campos-Takaki Faster chitosan production by mucoralean strains in submerged culture ISSN 1517-8382 Brazilian Journal of Microbiology Vol 32 no.1 SãoPaolo Jan./Mar.2001 26.Stephen A.White, Peter R.Faria and Inge Iulton (1979) Production and Isolation of chitosan from Mucor rouxii Applied and Environmental Microbiology Aug.1979 38(2) : 323-328 27.Synnwiecky J., Al-Kateeb N.A.A.Q (1997) Mycelia of Mucor rouxii as a source of chitin and chitosan Food Chemistry 60 : 605-610 90 28.Takada.M (1993) Univ.Fish 14 (3) : 173 29.Trang Si Trung (2005) Chitin-chitosan production, regeneration and characterization from shrimp waste in Vietnam Oral presentaion of 9th Asean Food Conference, 8-10 August, 2005 Jakarta, Indonesia 30.W.Fan, J.A.Bohlmann, J.R.Trinkle, J.D.Steinke, K.O.Hwang, J.P.Henning Glucosamine and method of making glucosamine from microbial biomas US patent No7049433B2 2006, No 0148998 A1 2003, No 0181419 A1 2003 31 Wu T, Zivanovics S, Draughon FA, Convay WS, Sams CE (2005) Physicochemical properties and bioactivity of fungal chitin and chitosan J Agric Food Chem., 53 (10), 3888 -3894, 2005 32 W David A.Johnson; C.Gregory Sowell Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors US patent No 6113918 Sep.5,2000 ... pháp tách chiết chitin, chitosan, glucosamine từ sinh khối nấm sợi 1.6.1 Các phương pháp tách chiết hỗn hợp chitin-chitosan glucosamine Dưới hai quy trình tách chiết hợp chất chitin-chitosan glucosamine. .. bật nấm sợi có nhiều hình thức sinh sản, như: sinh sản hữu tính, sinh sản vơ tính sinh sản dinh dưỡng Nhưng chủ yếu nấm mốc sinh sản vô tính Nhiều tác giả nghiên cứu nấm sợi số lồi thuộc ngành nấm. .. phụ thuộc vào mùa vụ từ nguyên liệu hải sản hay mô động vật Các nhà khoa học Mỹ, Brazil, Thái Lan nghiên cứu tổng hợp tách chiết chitin, chitosan glucosamine thành cơng từ nấm sợi, nấm men có