- Cách tiến hành: Mở nắp hộp nhôm cho vào sấy ở nhiệt độ 105oC trong 3 giờ Sau đó đậy nắp làm nguội trong bình hút ẩm 15 phút và cân khối lượng
2.3.3 Phương pháp xử lý hỗn hợp chitin, thu nhận chitosan,chitin và glucosamine
glucosamine
2.3.3.1 Phương pháp loại protein và các hợp chất vơ cơ khỏi hỗn hợp chitin
- Q trình loại protein, lipid.. được thực hiện như sau: Sử dụng NaOH 1M và nhiệt độ và thời gian thủy phân bằng kiềm lần lượt là 121 độ và 15 phút cho hiệu quả tốt nhất.
- Để loại bỏ các hợp chất vô cơ, glucan và tạp chất sau khi loại protein chúng tôi ngâm sinh khối trong acid lỗng nồng độ 2% ở nhiết độ phịng ( 25-30 độ) trong thời gian ngắn là 24 h để giảm thiểu sự phá vỡ mạch polymer của chitin
2.3.3.2 Phương pháp thu nhận và định lượng chitosan, chitin
Phương pháp thu nhận chitosan, chitin
Để thu nhận chitosan, chitin từ thành tế bào nấm sợi tiến hành theo các bước như sau :
- Xử lý sinh khối nấm sợi bằng NaOH loãng để loại protein, lipit và các hợp chất tan trong kiềm. Rửa sinh khối bằng nước cất, ly tâm loại bỏ dịch thu được hỗn hợp chitin, chitosan và hợp chất glucan không tan trong kiềm.
- Dựa trên đặc tính hịa tan của chitosan trong acid loãng nên thực hiện việc tách chitosan từ thành tế bào bằng axit loãng kết hợp với dùng nhiệt (từ 90- 95OC) theo thời gian đã định.
- Ly tâm hoặc lọc để giữ lại chitin, thu dịch - Đưa dung dịch keo về pH kiềm để tủa chitosan.
- Để lắng trong 24 giờ hoặc làm lắng nhanh bằng cách hạ nhiệt độ khối dịch xuống thấp.
- Ly tâm, loại bỏ dịch thu chitosan dạng sệt.
Phương pháp định lượng
Chitosan, chitin thu được đem sấy khơ và định lượng bằng cân phân tích. *Dựa trên 3 quy trình thu chitosan, chitin theo sơ đồ 1.4, 1.5 và 1.6 nêu ở phần tổng quan, chúng tơi thử nghiệm và chọn ra 1 quy trình phù hợp để thực hiện các khảo sát.
2.3.3.3 Phương pháp thu nhận và phân tích glucosamine
Phương pháp thu nhận glucosamine
Dung dịch thu được sau khi nhiệt thủy phân bằng acid đặc, để hạ xuống nhiệt độ phòng, tiến hành lọc qua màng lọc để loại bỏ cặn cịn sót. Dịch sau lọc
được kết tinh bằng cồn. Ly tâm bỏ phần dịch, phần lắng phía dưới tiếp tục được rửa qua cồn, ly tâm thu lại lần nữa rồi đem sấy khô thu được tinh thể glucosamine.
Phương pháp phân tích glucosamine
Phân tích hàm lượng glucosamine bằng phương pháp đo quang
- Mẫu chuẩn gồm các ống nghiệm chứa 0, 3 , 5, 8,10, 12 microlitre từ dung dịch gốc 1,5 mg/ml, thêm nước cất đến 300 microlitre, thêm 300 microlitre HCl 4N, tiếp tục bước 4 như quy trình dưới :
Sơ đồ 2.1 : Các bước phân tích glucosamine
Cân mẫu Glucosamine cho vào ống nghiệm nút xoáy
Bố sung 0,6 ml HCl 2N, xoáy chặt nắp Giữ nhiệt 100OC trong 16h
Bổ sung 0,4 ml Na2CO3 2M
Lắc đều mẫu trong 5 phút Thêm 0,5 ml hỗn hợp X (Acetyl
acetone 2% và 1,5 M Na2CO3)
Vặn chặt nút, đun cách thủy 20 phút Làm nguội, thêm 1 ml cồn 99.9% Thêm 0,5 dung dịch Ehrlichs Reagent
Lắc đuổi hết khí CO2
Màu xuất hiện sau 5 phút, ổn định sau
1-2 giờ Đo OD ở bước sóng 530 nm 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2` 1