C, D: Đỉnh cuống bào tử và bào tư chủng A.niger Ex2006-1.
3.3.1Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết chitosan
E, F: Khuẩn lạc chủng Rhizopus sp.BG và A.niger Ex2006-1 trên thạch PDA sau 48 giờ nuôi cấy.
3.3.1Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết chitosan
Khảo sát 3 phương pháp tách chiết chitosan xử lý kiềm sau đó xử lý axit axetic và chlohydric lỗng với việc sử dụng 5 gam sinh khối khô hệ sợi Rhizopus sp.BG, kết quả thể hiện ở bảng 3.11. Coi hiệu suất tách chiết ở phương pháp 2 là 100% thì phương pháp 1 chỉ đạt 80,5% và phương pháp 3 chỉ đạt 93,2%
Bảng 3.11: ảnh hưởng của phương pháp tách chiết đến hiệu suất thu hồi chitosan
Phương pháp tách chiết Hiệu suất thu hồi
chitosan (%)
Phương pháp 1:
Xử lý kiềm : NaOH 2% (1:30 ) 90OC/ 2h Xử lý acid : Acid acetic 2% (1:40) 60OC, 6h chỉnh pH=9, ly tâm, rửa,sấy 20OC/30 phút
80,5
Phương pháp 2:
Xử lý kiềm : NaOH 1M (1:30 ) 121OC/15 phút Xử lý acid : Acid acetic 2% (1:40) 95OC, 8h chỉnh pH=10, ly tâm, rửa,sấy 60OC /5 phút 100,0 Phương pháp 3: Xử lý kiềm : NaOH 1M (1:30 ) 100OC/90 phút Xử lý acid : Acid HCl 1M (1:40) 90OC, 5h chỉnh pH=8,5, ly tâm, rửa,sấy 60OC /5 phút 93,2
Từ kết quả trên lựa chọn phương pháp 2 làm phương pháp tách chiết chitosan từ sinh khối nấm sợi.
3.3.2 Nghiên cứu các điều kiện tách chiết glucosamine từ sinh khối nấm sợi Rhizopus sp.BG Rhizopus sp.BG
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện tách chiết glucosamine với sinh khối của chủng Rhizopus sp.BG, đây là chủng có khả năng sinh tổng hợp
chitosan tốt nhất.
Các điều kiện khảo sát như biện pháp xử lý sinh khối, loại acid, nồng độ acid , nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ phối trộn giữa sinh khối và acid ảnh hưởng như thế nào đến hiệu suất thu hồi glucosamine được đánh giá qua kết quả phân tích bằng phương pháp đo quang. Các thí nghiệm thăm dị đều dùng cùng lượng sinh khối như nhau và bằng 60 g (hàm ẩm 75% ).Điều kiện thủy phân ban đầu: Nhiệt độ 90OC, thời gian 8 giờ, tỷ lệ giữa sinh khối và acid 1:2 (khối lượng/thể tích).
Sau khi thủy phân, lọc qua màng lọc tách cặn, thu được dung dịch chứa glucosamine, kết tủa bằng cồn, sấy khô ở 40OC và đem phân tích.
3.3.2.1 Nghiên cứu lựa chọn biện pháp xử lý sinh khối thích hợp
Sinh khối được xử lý trước khi tiến hành thủy phân bằng acid đặc thu glucosamine. Cần chú ý rằng sử dụng xút lỗng nhằm mục đích loại protein và lipid, còn sử dụng acid lỗng ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ chỉ để phá thành tế bào, loại khoáng và glucan chứ không tách chitosan ra khỏi hỗn hợp chitin- chitosan (khác với phương pháp sử dụng acid lỗng có nâng nhiệt độ mục 3.3.1 ở trên) . Cuối cùng, thực hiện kết tủa, sấy khơ và phân tích xác định hàm lượng glucosamine.
- Cách I : Sinh khối được rửa sạch bằng nước cất
- Cách II : Sinh khối được xử lý NaOH 4% ở 121OC trong 15 phút.
- Cách III: Sinh khối được xử lý NaOH 4% ở 121OC trong 15 phút và acid HCl lỗng 2% ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ
Bảng 3.12: Lựa chọn biện pháp xử lý sinh khối thích hợp
* Nhận xét : 84)Biện pháp xử lý sinh khối 85)Glucosamine (mg/g) 86)I 87)159,8 88)II 89)198,2 90)III 91)220,9
- Hàm lượng glucosamine thu được từ phương pháp III cho kết quả tốt nhất, cao hơn xử lý sinh khối theo phương pháp I và phương pháp II. Chúng tôi chọn phương pháp III làm phương pháp xử lý sinh khối trước khi thủy phân bằng acid đặc để thu glucosamine.
3.3.2.2 Nghiên cứu lựa chọn acid thủy phân thích hợp
Tiến hành thí nghiệm với hai loại acid dùng để thủy phân sinh khối là acid HCl và acid H3PO4 ở cùng một nồng độ là 20%. Cũng giống như acid HCl và H2SO4 , việc sử dụng acid H3PO4 để thủy phân tạo ra sản phẩm là muối glucosamine phosphate, muối này có đặc tính sinh học giống như glucosamine chlorid và glucosamine sulfat.[ 32 ]Kết quả thể hiện ở bảng 3.13
Bảng 3.13 Lựa chọn acid thủy phân thích hợp
92)Dung môi 93)Glucosamine (mg/g)
94)HCl 20% 95)215,4
96)H3PO4 20% 97)207,8
*Nhận xét :
- Các thông số thu được cho thấy acid H3PO4 20% cho kết quả phân tích glucosamine gần tương đương với acid HCl ở cùng nồng độ, tuy nhiên đối với acid H3PO4, có thể tiếp tục khảo sát ở nồng độ cao hơn, trong khi đó nồng độ tối đa của HCl là 35,5%, ở nồng độ này HCl bay hơi và ăn mòn mạnh. Xét đến mức độ an tồn, kinh tế và tính hiệu quả chúng tơi chọn H3PO4 cho các khảo sát tiếp theo.
ảnh 3.5 : Mẫu đường chuẩn và mẫu phân tích glucosamine
3.3.2.3 Nghiên cứu lựa chọn nồng độ acid thủy phân thích hợp
Tiến hành khảo sát acid H3PO4 theo các nồng độ 10%, 20%, 30%, 40%, 50% để xét khả năng cắt mạch thu glucosamine. Kết quả thể hiện ở bảng 3.14
Bảng 3.14 Lựa chọn nồng độ acid thủy phân thích hợp
*Nhận xét :
Khi tăng nồng độ acid thì hàm lượng glucosamine thu được và hiệu suất chuyển hóa tăng lên, ở nồng độ 40, 50% lượng glucosamine thu được cao hơn so với glucosamne thu được ở nồng độ 10%, 20%, 30% . ở nồng độ 40, 50% sự sai khác giữa hàm lượng glucosamine thu được là không đáng kể. Để đảm bảo hiệu suất thủy phân tốt và tiết kiệm dung môi một cách hợp lý, chúng tôi lựa chọn acid H3PO4 ở nồng độ 40% để thủy phân cắt mạch thu glucosamine.
3.3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
98)Nồng độ 99)Glucosamine (mg/g) 100) 10% 101) 47,3 102) 20% 103) 210,1 104) 30% 105) 215,4 106) 40% 107) 259,9 108) 50% 109) 260,8
Để thực hiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng thủy phân của acid, chúng tôi tiến hành ở ba mức nhiệt độ 80,90,100OC . Các điều kiện khác : H3PO4 40%, thời gian 8 giờ, tỷ lệ giữa sinh khối và acid 1: 2(khối lượng/thể tích) Kết quả thể hiện ở bảng 3.15
Bảng 3.15 Lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
*Nhận xét :
- Qua kết quả thể hiện ở bảng số liệu chúng tơi có nhận xét khả năng cắt mạch tăng lên cùng với sự tăng nhiệt độ, nhưng ở nhiệt độ 1000C thì hàm lượng glucosamine giảm xuống.Do đó chúng tơi chọn nhiệt độ để tiến hành khảo sát là 90O .
3.3.2.5 Nghiên cứu lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp
Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất chuyển hóa glucosamine , chúng tơi cố định định tỷ lệ sinh khối trên thể tích dung dịch HCl là 1 : 2, nhiệt độ là 90 OC và nồng độ dung dịch H3PO4 là 40%. Các thời gian tiến hành khảo sát là 6, 7 , 8 , 9 và 10 giờ..Kết quả thể hiện ở bảng 3.16
Bảng 3.16 Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp
110) Nhiệt độ thủy phân 111) Hàm lượng glucosamine (mg/g) 112) 80 113) 239,3 114) 90 115) 268,9 116) 100 117) 252,4
• Nhận xét :
- Dựa vào kết quả thu được chúng tôi nhận thấy, hiệu suất điều chế tăng theo thời gian và tăng không đáng kể khi thời gian cắt mạch trên 8 giờ. Do đó, chúng tơi chọn thời gian để thủy phân thu glụcosamine là 8 giờ
3.3.2.6 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ sinh khối và acid thủy phân thích hợp
Lượng thể tích acid tiêu tốn để thực hiện quá trình thủy phân cần phải hợp lý, điều này không những liên quan đến hiệu suất cắt mạch mà còn giảm bớt lượng acid không cần thiết, tiết kiệm chi phí trong q trình chun hóa glucosamine. Thí nghiệm được tiến hành dựa trên các điều kiện thủy phân tối ưu : nhiệt độ là 90 OC và nồng độ dung dịch H3PO4 là 40%. thời gian là 8 giờ. Các tỷ lệ giữa sinh khối và dung môi khảo sát là : 1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1 : 5 .Kết quả thể hiện ở bảng 3.17
Bảng 3.17: Lựa chọn tỷ lệ sinh khối và acid thủy phân thích hợp
gian thủy phân
120) 6 giờ 121) 228.6 122) 7 giờ 123) 253,9 124) 8 giờ 125) 271,5 126) 9 giờ 127) 272,1 128) 10 giờ 129) 272,4
*Nhận xét
-Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn tỷ lệ giữa sinh khối và dung mơi thích hợp là 1 : 3, khi thể tích acid tămg hơn nữa, lượng glucosamine thu được là không đổi.
3.3.2.7 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp
Sau khi dùng cồn để kết tủa glucosamine, tiến hành kiểm tra mức độ kết lắng ở các nhiệt độ : Nhiệt độ phòng (25OC), OOC, 4OC sau thời gian để lắng là 5 tiếng. Kết quả thể hiện ở bảng 3.18
Bảng 3.18 Lựa nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp
130) Tỷ lệ
giữa sinh khối và dung môi 131) Hàm lượng glucosamine (mg/g) 132) 1 : 1 133) 106,5 134) 1 : 2 135) 260 136) 1 :3 137) 283,3 138) 1 : 4 139) 282,5 140) 1 : 5 141) 283,9
*Nhận xét :
- Nhiệt độ để glucosamine kết lắng tốt nhất là OOC, chúng tôi chọn đây là nhiệt độ thích hợp trong q trình thu hồi glucosamine.
3.3.2.8 Nghiên cứu lựa chọn thời gian kết lắng glucosamine thích hợp
Cũng giống như chọn nhiệt độ kết lắng, thời gian kết lắng cũng rất quan trọng. Yếu tố công nghệ này giúp việc thu hồi glucosamine được đảm bảo về mặt thời gian để tiến hành thực hiện các bước kế tiếp trong quy trình một cách ngắn nhất. Các thời gian lựa chọn để kiểm tra mức độ kết lắng là : 2,3,4,5 và 6 giờ ở OOC. Kết quả thể hiện ở bảng 3.19
Bảng 3.19 Lựa nhiệt độ kết lắng glucosamine thích hợp
142) Nhiệ t độ kết lắng 143) Glucosamine (mg) 144) Nhiệ t độ phòng (25OC) 145) 845,4 146) 4OC 147) 1356,5 148) OOC 149) 1522,6 150) Thời gian để lắng 151) Glucosamine (mg) 152) 2 giờ 153) 810,3 154) 3 giờ 155) 1257,6 156) 4 giờ 157) 1521,3
• Nhận xét :
- Sau 4 giờ, nếu tiếp tục để lắng lượng glucosamine xấp xỉ bằng nhau. Chúng tôi lựa chọn 4 giờ là thời gian kêt lắng thích hợp.
3.3.2.9 Lựa chọn chế độ sấy thích hợp
Cùng một lượng mẫu như nhau, sự sai khác về hàm ẩm giữa các mẫu sau khi sấy sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến hàm lượng glucosamine có trong mẫu chất rắn khi phân tích. Để so sánh mức độ sai khác này, chúng tôi chọn 3 chế độ sấy mẫu : Để khơ ở nhiệt độ phịng, 40OC/30 phút, và sấy chân không ở 40OC/10
Bảng 3.20 Lựa chọn chế độ sấy thích hợp 158) 5 giờ 159) 1521,9 160) 6 giờ 161) 1523,4 162) Chê độ sấy 163) Hàm lượng glucosamine (mg/g) 164) Để khô ở nhiệt độ phòng 165) 275,9 166) Sấy ở tủ sấy 40OC/30 phút 167) 279,6 168) Sấy chân không 40OC/10 phút 169) 287,4
* Nhận xét
- Kết quả cho hiệu suất thu hồi glucosamine khi để khơ mẫu ở nhiệt độ phịng 275,9 mg/g thấp hơn khi sấy mẫu ở nhiệt độ 40OC : 279,6 mg/g và tốt nhất là thực hiện sấy chân không: 287,4 mg/g, điều này cho thấy việc lựa chọn chế độ sấy là quan trọng vì nó ảnh hưởng đến hàm lượng glucosamine có trong mẫu . Chúng tôi chọn chế độ sấy chân không 40OC/10phút để thu hồi glucosamine phục vụ cho quá trình tinh sạch kế tiếp.
KếT luận Và đề nghị Kết luận
Sau thời gian làm luận văn, đề tài đã đạt được những kết quả như sau :