(LUẬN văn THẠC sĩ) đánh giá một số đặc tính sinh học của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG 04 sau bảo quản

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VŨ THỊ NGỌC ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT VG – 04 SAU BẢO QUẢN Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng 12 năm 2016 Tác giả luận văn Vũ Thị Ngọc i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Bá Hiên tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2016 Tác giả luận văn Vũ Thị Ngọc ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .2 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu bệnh dịch tả vịt virus gây bệnh dịch tả vịt 2.1.1 Lịch sử phân bố bệnh 2.1.2 Truyền nhiễm học 2.1.3 Triệu chứng bệnh tích .6 2.1.4 Biện pháp can thiệp phòng bệnh dịch tả vịt .7 2.1.5 Chẩn đoán 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh dịch tả vịt .14 2.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh dịch tả vịt Việt Nam .14 2.2.2 Những nghiên cứu bệnh dịch tả vịt nước 16 2.3 Virus gây bệnh dịch tả vịt 18 2.3.1 Hình thái kích thước 18 2.3.2 Cấu trúc .18 2.3.3 Sức đề kháng .20 2.3.4 Độc lực 20 2.3.5 Đặc tính ni cấy .21 2.4 Miễn dịch chống virus dịch tả vịt 22 2.4.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 22 iii download by : skknchat@gmail.com 2.4.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu .23 2.4.3 Độ dài miễn dịch .24 Phần Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 27 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 27 3.3 Nội dung nghiên cứu 27 3.3.1 Kiểm tra số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 lưu giữ dạng nước trứng bệnh phẩm -860C sau 10 năm 27 3.3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học phân tử chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Phương pháp xác định khả thích ứng ổn định chủng virus .28 3.4.2 Phương pháp xác định số ELD50 (liều gây chết 50% phôi) chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 .29 3.4.3 Phương pháp xác định số EID50 (liều gây nhiễm 50% phôi) chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 .29 3.4.4 Phương pháp xác định số LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) vịt chủng VG - 04 30 3.4.5 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vịt chủng virus cường độc dịch tả 31 3.4.6 Phương pháp tách chiết DNA tổng số virus 34 3.4.7 Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gene US7 34 3.4.8 Giải trình tự gene xây dựng phả hệ 35 3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 35 Phần Kết thảo luận 36 4.1 Kết kiễm tra số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 36 4.1.1 Kết kiểm tra khả thích ứng ổn định chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 phôi vịt 36 4.1.2 Kết đánh giá số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 41 4.1.3 Kết đánh giá số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 46 iv download by : skknchat@gmail.com 4.1.4 Kết đánh giá số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 49 4.1.5 Kết nghiên cứu biến đổi bệnh lý vịt virus cường độc dịch tả vịt chủng VG – 04 gây 53 4.2 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 56 4.2.1 Kết khuếch đại trình tự đoạn gene US7 .56 4.2.2 Kết phân tích trình tự gene US7 57 4.2.3 Kết phân tích phả hệ (phylogenetic tree) dựa trình tự vùng .60 Phần Kết luận đề nghị 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Đề nghị 61 Tài liệu tham khảo .63 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair CPE : Cytopathogenic effect Cs : cộng DEF : Duck Embryo Fibroblast DEV : Duck enteritis virus DNA : Deoxy ribonucleic acid EID50 : 50 percent Embryo Infectious Dose ELD50 : 50 percent Embryo Lethal Dose FAO : Food and Agriculture Organization Kb : Kilo base LD50 : 50 percent Lethal Dose MEM : Minimum essential medium NI : Neutralization Index OIE : World Organisation for Animal Health P : page PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase chain reaction RT-PCR : Reverse Transcription – Polymerase chain reaction SN : Serum Neutralization Tr : trang US : Unique Short VN : Virus Neutralization VSV-TN : Vi sinh vật - Truyền nhiễm vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu .35 Bảng 4.1 Kết cấy truyền chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 phôi vịt 38 Bảng 4.2 Kết qua kiểm tra bệnh tích đại thể phơi vịt sau gây nhiễm 39 Bảng 4.3 Kết qua kiểm tra bệnh tích đại thể phơi vịt sau gây nhiễm virus cường 40 Bảng 4.4 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt 42 Bảng 4.5 Kết xác định số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 sau bảo quản dạng nước trứng 43 Bảng 4.6 Chỉ số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước sau bảo quản .45 Bảng 4.7 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 sau bảo quản dạng bệnh phẩm 47 Bảng 4.8 Kết xác định số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản dạng nước trứng .48 Bảng 4.9 Chỉ số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước sau bảo quản .49 Bảng 4.10 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản dạng bệnh phẩm .51 Bảng 4.11 Kết xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 sau bảo quản dạng nước trứng 52 Bảng 4.12 Chỉ số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 trước sau bảo quản .53 Bảng 4.13 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide vùng gene US7 chủng virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới .58 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Các giai đoạn phản ứng PCR 13 Hình 2.2 Hệ gen virus dich tả vịt .19 Hình 4.1 Phơi vịt bị nhiễm virus dịch tả vịt (bên trái) xuất huyết da .41 Hình 4.2 Vịt ủ rũ, bỏ ăn, khó thở, liệt chân 54 Hình 4.3 Vịt sưng mặt, chảy nước mắt, nước mũi 54 Hình 4.4 Phân lỗng, màu trắng xanh 54 Hình 4.5 Xuất huyết thực quản, khí quản .54 Hình 4.6 Gan xuất huyết hoại tử 55 Hình 4.7 Ruột xuất huyết hình vịng nhẫn 55 Hình 4.8 Dạ dày dày tuyến xuất huyết 55 Hình 4.9 Gan thối hóa mỡ (HE40X) .56 Hình 4.10 Sung huyết biểu mơ khí quản bong tróc (HE40X) .56 Hình 4.11 Tế bào biểu mơ khí quản bong tróc (HE10X) 56 Hình 4.12 Xuất huyết hạ niêm mạc khí quản (HE40X) 56 Hình 4.13 Kết kiểm tra sản phảm PCR gel Agarose 57 Hình 4.14 So sánh trình tự vùng gene US7 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới 59 Hình 4.15 Mối quan hệ di truyền chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới dựa trình tự gene US7 .60 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Vũ Thị Ngọc Tên Luận văn: “Đánh giá số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản” Ngành: Thú Y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu nhằm đánh giá số đặc tính sinh học sinh học phân tử chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 sau thời gian bảo quản dạng lưu trữ khác Phương pháp nghiên cứu Trong nghiên cứu chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 khảo sát số đặc tính sinh học sinh học phân tử Khả thích ứng ổn định truyền đời qua phôi vịt chủng virus cường độc VG - 04 đánh giá phương pháp tiêm truyền trứng vịt có phôi 13 ngày tuổi Các số liều virus gây chết 50% phôi trứng (ELD50), liều virus gây nhiễm 50% phôi trứng (EID50) liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) xác định theo phương pháp Reed Muench (1938) DNA tổng số virus tách chiết bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng kit AccuPower PCR PreMix (BIONEER) Kit chứa DNA taqpolymerase thành phần cần thiết cho trình khuếch đại DNA Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose gửi sang cơng ty Macrogen Hàn Quốc để giải trình tự gene Trình tự gene US7 sau giải trình tự phân tích phần mềm BioEdit DNAstar tiến hành so sánh với trình tự gene tham chiếu khác công bố ngân hàng GenBank Cây phả hệ (phylogentic tree) xây dựng phần mềm MEGA6 sử dụng thuật toán Maximum Likelyhood Kết kết luận Kết nghiên cứu cho thấy chủng virus VG-04 có khả nhân lên gây chết phôi vịt, số ELD50 EID50 virus sau bảo quản -860C dạng bảo quản (bệnh phẩm nước trứng tươi) phôi vịt tương ứng 105,29/0,2 ml; 107,56 /0,2 ml 105,27/0,2 ml 107,46/0,2ml Kết gây nhiễm virus vịt cho thấy chủng ix download by : skknchat@gmail.com chết có số triệu chứng: vịt có biểu lờ đờ, khơng thích vận động, ủ rũ, bỏ ăn, tách đàn; vịt đứng không vững, liệt chân, sưng mắt, chảy nước mắt, nước mũi, khó thở, thở khị khè (hình 4.2); số vịt có biểu phù đầu (hình 4.3) Vịt bị bệnh thường khát nước, sau vài ngày thấy ỉa chảy, phân lỗng, màu trắng xanh (hình 4.4), thối khắm, hậu mơn bẩn, lơng xung quanh dính bết phân, phân có mùi khắm Trong phân lẫn vệt máu Kết mổ khám lâm sàng để kiểm tra bệnh tích đại thể vịt chết cho thấy vịt mắc bệnh có bệnh tích đặc trưng bệnh như: niêm mạc hầu, họng, thực quản viêm, xuất huyết, đơi chỗ có vết lt phủ màng giả màu vàng xám thượng bì niêm mạc tróc ra; gan xuất huyết hoại tử (hình 4.6), thực quản khí quản xuất huyết (hình 4.5) Hình 4.2 Vịt ủ rũ, bỏ ăn, khó thở, liệt chân Hình 4.3 Vịt sưng mặt, chảy nước mắt, nước mũi Hình 4.4 Phân lỗng, màu trắng xanh Hình 4.5 Xuất huyết thực quản, khí quản 54 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.7 Ruột xuất huyết hình vịng nhẫn Hình 4.6 Gan xuất huyết hoại tử Hình 4.8 Dạ dày dày tuyến xuất huyết Ruột xuất huyết hình vịng nhẫn (hình 4.7) Dạ dày tuyến phủ nhiều dịch nhớt giống mủ, gạt lớp niêm dịch thấy niêm mạc xuất huyết (hình 4.8) Dạ dày xuất huyết nặng (hình 4.8) Kết mổ khám cho thấy tim xuất huyết, niêm mạc hậu môn tụ huyết, xuất huyết loét, thận tụ huyết, tuyến tụy xuất huyết Hậu môn, trực tràng xuất huyết thành vệt màu đỏ, xen kẽ vết loét màu vàng Kết kiểm tra bệnh tích vi thể cho thấy gan thái hóa mỡ (hình 4.9); sung huyết biểu mơ khí quản (hình 4.10), tế bào biểu mơ khí quản bong tróc (hình 4.11), xuất huyết hạ niêm mạc khí quản (hình 4.12) 55 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.9 Gan thối hóa mỡ Hình 4.10 Sung huyết biểu mơ (HE40X) khí quản bong tróc (HE40X) Hình 4.11 Tế bào biểu mơ khí quản bong tróc (HE10X) Hình 4.12 Xuất huyết hạ niêm mạc khí quản (HE40X) 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT VG-04 4.2.1 Kết khuếch đại trình tự đoạn gene US7 Trong nghiên cứu sinh học phân tử phản ứng PCR công cụ hữu hiệu dùng để chẩn đoán khuếch đại gene khác virus dịch tả vịt (Hansen et al., 1999; Hu et al., 2009; Zhang et al., 2011) Trong nghiên cứu mẫu DNA virus cường độc dịch tả vịt VG-04 tách chiết dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại vùng gene US7 Kết chạy điện di gel agarose cho thấy sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi DEV56 download by : skknchat@gmail.com US7F/DEV-US7R đặc hiệu cho gene US7 có kích thước khoảng 557 bp, với kích thước công bố trước (Nguyễn Bá Hiên cs., 2016) (hình 4.13) M Hình 4.13 Kết kiểm tra sản phảm PCR gel Agarose Giếng M: Marker DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen); Giếng 1: Gene US7 (557 bp) 4.2.2 Kết phân tích trình tự gene US7 Theo Wu et al., (2012), gene US7 cho gene có mức độ đa dạng cao genome virus dịch tả vịt Trong nghiên cứu gene US7 chủng virus VG - 04 giải trình tự so sánh trình tự nucleotide với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác Kết bảng 4.13 cho thấy, mức độ tương đồng trình tự nucleotide vùng gene US7 chủng virus VG – 04 chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác dao động khoảng từ 96,5% - 99,6% Kết phân tíchvề trình tự gene US7 cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG - 04 có mức độ tương đồng 100% so sánh với chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 (Nguyễn Bá Hiên cs., 2016) Khi so sánh với chủng virus dịch tả vịt cường độc CV CHv Trung Quốc (mã số truy cập tương ứng ngân hàng GenBank: JQ673560 JQ647509)(Wu et al., 2012; Yang et al., 2014), tỷ lệ tương đồng trình tự gen US7 99,4% Tương 57 download by : skknchat@gmail.com tự so sánh với chủng virus vacxin DEV03 VAC (mã số truy cập tương ứng ngân hàng GenBank: HQ009801 EU082088) (Li et al., 2009) Trung Quốc, tỷ lệ tương đồng trình tự gen US7 tương ứng 99,6% 96,5% Bảng 4.13 Mức độ tương đồng trình tự nucleotide vùng gene US7 chủng virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới STT Chủng virus DP-EG-2000 VG-04 100 JQ673560 CV/China 99.4 99.4 KF487736 K/China 99.4 99.4 100 JQ647509 CHv/China 99.4 99.4 100 100 KF263690 C-KCE/China 99.6 99.6 99.8 99.8 99.8 JF999965 2085/Germany 99.1 99.1 99.6 99.6 99.6 99.4 HQ009801 DEV03/China 99.6 99.6 99.8 99.8 99.8 100 99.4 EU082088 VAC/China 96.5 96.5 96.7 96.7 96.7 96.9 96.4 96.9 Kết phân tích trình tự nucleotide vùng gene US7 cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 hoàn toàn đồng với chủng virus vacxin dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 Việt Nam (Nguyễn Bá Hiên cs., 2016) sai khác so với chủng virus tham chiếu lại vị trí: 193 (T↔C) 396 (T↔A) Bên cạnh đó, chủng virus VG-04 có sai khác so chủng CV (mã số truy cập ngân hàng GenBank: JQ673560) (Yang et al., 2014), chủng K (mã số truy cập ngân hàng GenBank: KF487736) (Yang et al., 2013), chủng CHv (mã số truy cập ngân hàng GenBank: JQ647509) (Wu et al., 2012) chủng 2085 (mã số truy cập ngân hàng GenBank: JF999965) (Wang et al., 2011) vị trí 555 (T↔G) Ngoài ra, sai khác chủng virus VG-04 chủng 2085 cịn xuất thêm vị trí 288 (A↔G) 512 (C↔A) Khác biệt trình tự nucleotide chủng virus VG-04 chủng virus vacxin VAC (Li et al., 2009) sử dụng Trung Quốc xảy vị trí nucleotide 159 (T↔G), 204 (G↔T), 214 (G↔T), 229 (T↔C), 231 (C↔T), 250 (G↔C), 260 (T↔C), 262 (G↔A), 265 (A↔T), 269 (G↔C), 277 (T↔C), 283 (T↔C), 285 (A↔T), 287 (A↔T), 302 (A↔C), 318 (G↔T) Đặc biệt, chủng virus vacxin VAC xuất đột biến thêm T vị trị 314 làm thay đổi khung đọc vùng gene US7 chủng so với chủng khác (hình 4.14) 58 download by : skknchat@gmail.com 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China GAAGCCTGTGACCGTTCCTACGACTAACAATTACACAACATTATCTGATGATATGCAGCCTACGCATAATGATACCAATAGTGGACTTAA DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China TATCTTTGACAAAATTCCAAATATCTATCTTATCCCAGCTGTAATGTTTGTGGTACTACCGCTGACCATATTCATCGTGTTGATGTGCTC G DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China TCCTCTTAAACGTAAATTATGTCGTTGTTGTACGAAACGACGTGTTTATACAGGTTCTACCACAAGCGTGATCAACCAATCGGCACTGGA C C C C C C C T .T C.T C .C.A T C DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China TAATCCTCCTTCTCAAGACGCTCTGGAATCAAAACATCCGGAG-CTAGATGGTACCCTAATGAGAAAGCTGGAGGAAAAACTGGCAGCGT - - - - - .G .- - C C.T.T C T T DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China ATGACAGCTCTGGGGATCATAAAACAGAATAATTCTCATCAGTATGACTAAAAGTAAATGTTTTTGTTATGATTGACTGTTTGCCTTTCA .A A A A A A A DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China TTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGGAGCTATAGATCTGTACTAATTTAAGTGTGCAGCCTGGTTAACTG A DP-EG-2000 VG-04 JQ673560 CV/China KF487736 K/China JQ647509 CHv/China KF263690 C-KCE/China JF999965 2085/Germany HQ009801 DEV03/China EU082088 VAC/China TATTATGCGCGGAGTTTG G G G G 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 190 200 210 220 230 240 250 260 270 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 280 290 300 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 370 380 390 400 410 420 430 440 450 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 460 470 480 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | | | | | | | 550 | | | Hình 4.14 So sánh trình tự vùng gene US7 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới 59 download by : skknchat@gmail.com 4.2.3 Kết phân tích phả hệ (phylogenetic tree) dựa trình tự vùng gene US7 Trình tự nucleotide vùng gene US7 sử dụng để xây dựng phả hệ nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền chủng virus dịch tả vịt VG-04 với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới Hình 4.15 Mối quan hệ di truyền chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 nghiên cứu với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác giới dựa trình tự gene US7 Kết phân tích phả hệ hình 4.15 cho thấy chủng virus VG-04 có mối quan hệ di truyền gần gũi với chủng virus dịch tả vịt phân lập từ thực địa Trung Quốc năm gần (chủng K, CV, CHv) Kết phân tích cịn cho thấy chủng virus VG-04 nằm nhánh với chủng virus vacxin dịch tả vịt nhược độc DP – EG – 2000 Việt Nam (Nguyễn Bá Hiên cs., 2016) nằm khác nhánh với chủng virus vacxin VAC Trung Quốc (Li et al., 2009) 60 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau 10 năm bảo quản -860C dạng nước trứng tươi bệnh phẩm, chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 ổn định số đặc tính sinh học: - Có tính thích ứng cao ổn định phôi vịt 13 ngày tuổi Virus nhân lên phôi, gây chết phôi với bệnh tích đặc trưng, số phơi chết tập trung khoảng thời gian từ 73 - 120 - Chỉ số ELD50 EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản -860C dạng bệnh phẩm nước trứng tươi tương đối ổn định + Chỉ số ELD50 EID50 trung bình sau bảo quản dạng bệnh phẩm qua lần chuẩn độ tương ứng là: 105,29ELD50/0,2 ml 107,56 EID50/0,2 ml + Chỉ số ELD50 EID50 trung bình sau bảo quản dạng nước trứng tươi qua lần chuẩn độ tương ứng là: 105,39ELD50/0,2 ml 107,63 EID50/0,2 ml - Kết gây nhiễm virus vịt cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 có khả nhân lên gây chết vịt thí nghiệm với triệu chứng bệnh tích đặc trưng Chỉ số LD50 trung bình chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản -860C dạng bệnh phẩm nước trứng tươi tương đối ổn định tương ứng là: 109,13/0,5 ml 109,23/0,5 ml Như vậy, sau 10 năm bảo quản -860C chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 dạng bệnh phẩm nước trứng thích ứng ổn định phơi vịt, vịt; hiệu giá độc lực virus đạt mức cao Kết phân tích trình tự nucleotide đoạn gene US7 cho thấy chủng virus VG-04 có mức độ tương đồng cao so sánh với chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác thu thập ngân hàng GenBank, tỷ lệ tương đồng nucleotide đạt từ 96,5 – 99,6% 5.2 ĐỀ NGHỊ Kết thu từ nghiên cứu cho thấy sử dụng chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 phân lập Việt Nam cho thí nghiệm cơng 61 download by : skknchat@gmail.com cường độc để đánh giá hiệu lực vacxin dịch tả vịt cho mục đích giảng dạy nghiên cứu khác Để chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 có chất lượng tốt, số sinh học đặc tính kháng ngun ổn định nên bảo quản khoảng thời gian 10 năm, sau 10 năm phải tiến hành gây nhiễm virus động vật lần Cần nghiên cứu thêm biện pháp bảo quản khác 62 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005) Quyết định Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn số 63/2005/QĐ - BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 việc Ban hành Quy định tiêm phòng bắt buộc vacxin cho gia súc, gia cầm Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2005) Quyết định Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn số 64/2005/QĐ - BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 việc Ban hành Danh mục bệnh phải công bố dịch, bệnh nguy hiểm động vật, bệnh phải áp dụng biện pháp phòng bệnh bắt buộc Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn (2006) Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 8152006, Quy trình chẩn đốn bệnh dịch tả vịt, Hà Nội Kim Văn Phúc, Trần Đình Từ, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Chung Leigh Nind (1999) Phân lập – Giám định virus dịch tả vịt số tỉnh Nam Bộ, Báo cáo hội nghị khoa học kỹ thuật chăn nuôi – thú y, Bộ NN&PTNT Lê Thanh Hoà (2002) Sinh học phân tử: Nguyên lý ứng dụng Tài liệu giảng dạy sau đại học Lê Văn Lãnh (1991) Khảo sát số đặc tính sinh học giống virus vacxin Jansen chế vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu KHKT Nơng nghiệp 1986-1991, NXB Nông nghiệp, tr 120-121 Lê Hồng Mận (1999) Bệnh vịt biện pháp phịng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Lê Hồng Mận (2005) Nuôi ngan vịt siêu thịt, NXB Thanh Hố Lê Chí Minh, Hồ Đình Chúc Bùi Quý Huy (1999) Kết điều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm tỉnh phía bắc (1995-1997), Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, hội thú y Việt Nam, tập 6, số 3- Trang 75 10 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Nguyễn Xn Bình, Trần Xn Hạnh Tơ Thị Phấn (2006) 43 bệnh gia cầm cách phịng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Ngọc Điểm (2005) Tình hình bệnh dịch tả vịt đàn vịt nuôi ngoại thành Hà Nội số tỉnh lân cận Phân lập, khảo sát đặc tính sinh học chủng virus 63 download by : skknchat@gmail.com cường độc, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội 13 Nguyễn Bá Hiên (2005) Khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 14 Nguyễn Bá Hiên (2009) Khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Hội Thú y Việt Nam tập XVI, số 5-2009, tr 5-10 15 Nguyễn Bá Hiên Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2013) Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế, NXB Nông nghiệp, tr-241 16 Nguyễn Bá Hiên, Lê Văn Phan, Đặng Hữu Anh, Lê Huỳnh Thanh Phương (2016) Một số đặc điểm sinh học sinh học phân tử chủng virus vacccine nhược độc dịch tả vịt DP – EG – 2000, Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXIII, số 1, trang 39 - 49 17 Nguyễn Đức Hiền (1999) Chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt Cần Thơ, Khoa học Kỹ thuật Thú y, (1), Hội Thú y Việt Nam, tr 24-31 18 Nguyễn Đức Hiền (2005) Bệnh tích đại thể, vi thể siêu vi thể bệnh dịch tả vịt thủy cầm gây bệnh thực nghiệm, Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 3/2005, Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh 19 Nguyễn Đức Hiền (2012) Một số đặc điểm bệnh lý dịch tả vịt vịt xiêm (ngan) Tạp chí KHKT thú y, Hội Thú y Việt Nam, tập XIX, số 1, năm 2012 20 Nguyễn Ngọc Huân (2006) Quy trình thú y an tồn dịch bệnh áp dụng cho gà, vịt nông hộ, Báo Nông nghiệp Việt Nam số 17 ngày 24/1/2006 21 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (2001) Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 22 Nguyễn Thát (1975), Bệnh gia cầm, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 23 Nguyễn Văn Tốn (2014) Ngành chăn nuôi gia cầm Việt Nam trước thách thức TPP Vụ Nông nghiệp, Ban Kinh tế Trung ương Thứ ba, Ngày 01/11/2016 https://kinhtetrunguong.vn/nghien-cuu-trao-doi/-/view_content/content/192344/ 24 nganh-chan-nuoi-gia-cam-viet-nam-truoc-thach-thuc-tpp 25 Phạm Quang Hùng (2003) Con vịt với người nông dân, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 26 Phạm Sỹ Lăng Nguyễn Thiện (2002) Một số bệnh virus gia súc, gia cầm nhập nội biện pháp phịng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 27 Phạm Gia Ninh Nguyễn Đức Tâm Sổ tay dịch bệnh động vật NXB LD Ringer 64 download by : skknchat@gmail.com Thống Nhất, Hà Nội 28 Phạm Thị Lan Thu Thân Thị Hạnh (1989) Kết bước đầu phân lập virus dịch tả vịt Phú Khánh, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y (1985-1989), Viện Thú y, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.40-41 29 Trần Kim Anh (2004) Kỹ thuật chăn nuôi vịt ngan nông hộ NXB Nông nghiệp, Hà Nội 30 Trần Minh Châu (1980) Chủng virus cường độc 769 sử dụng vacxin để phòng bệnh, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội 31 Trần Minh Châu (1987) Bệnh dịch tả vịt, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 32 Trần Minh Châu (1996) 100 câu hỏi bệnh chăn nuôi gia súc, gia cầm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 33 Vũ Triệu An (1997) Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội 34 Vũ Minh Thục (2004) Một số vấn đề dị ứng miễn dịch phân tử, NXB Y học, Hà Nội, tr 58-66 Tiếng Anh: 35 Baudet A.E.R.F (1923) Mortality in ducks in the Netherland caused by a filtertable virus, fowl plague, Tijdschr Diergeneeskd 50, pp 455-459 36 Boss A (1943) Some new cases of duck plague, Tijdschr Diergeneeskd 69, pp 372-381 37 Burgess E.C and T.M Yuill (1981) Increased cell culture incubation temperatures for duck plague virus isolation, Avian Dis 25, pp 222-224 38 Chanjuan Shen, Yufei Guo, Anchun Cheng, Mingshu Wang,#1,2 Yi Zhou,1 Dan Lin,1 Hongyi Xin,1 and Na Zhang (2009) Characterization of subcellular localization of duck enteritis virus UL51 protein, Virology Journal, 6: 92 39 Dardini A.H and W.R Hess (1968) A plague assay for duck plague virus, Can J Comp Med Sci 32, pp 505-510 40 Docherty D.E and Franson C.J (1992) Duck Virus Enteritis In: Veterinary Diagnostic Virology, Castro A.E & Heuschele W.P., eds Mosby Year Book, St Louis, Missouri, USA, 25–28 41 FAO (2004) http://www.fao.org/english/newsroom/news/2005, 25/05/2014 42 Fenner F., Mac Auslan R.R., Minus C.A., Sambrook J., White D (1974) The biology of animal viruses, Second edition, Academic press New York and London 43 Friend M and G.L Pearson (1973) Duck plague in wild waterfowl, US Dep Int 65 download by : skknchat@gmail.com Sport Fish Wild Bull, Washington D.C 44 Guiping, Z., 2007 Economics development research based on AHP method [D] Da Lian: DaLian Science University, 2007 45 Guiping Y., Anchun C., Mingshu W., Xiaoying H., Yi Z and Fei L (2007) Preliminary study on duck enteritis virus induced lymphocyte apoptosis in vivo, Avian Dis, 2007 Jun; 51(2): 546-9 46 Hansen W.R., Brown S.E., Nashold S.W and Knudson D.L (1999) Identification of duck plague virus by polymerase chain reaction, Avian Dis., 43, 106-115 47 Hess W.R and Dardini (1968) Some properties of duck plague, Arch Gesamte Virusforsch 24, pp 148-153 48 Jansen J (1964) Duck plague (a concise survey), Indian Vet J 41, pp 309-316 49 Jansen J (1968) Duck plague, J Am Vet Med Assoc 152, pp 1009-1016 50 Kaleta E.F., Kuczka A., Kuhnhold A., Bunzenthal C., Bonner B.M., Hanka K., Redmann T and Yilmaz A (2007) Outbreak of duck plague (duck herpesvirus enteritis) in numerous species of captive ducks and geese in temporal conjunction with enforced biosecurity (in-house keeping) due to the threat of avian influenza A virus of the subtype Asia H5N1, Dtsch Tierarztl Wochenschr 2007 Jan; 114(1): 3-11 51 Kidd, K.K., and Ruano, G., (1995) Optimizing PCR In PCR 2: A practical approach Edited by McPherso, M.J., Hames, B.D, and Taylor, G.R., Oxford University Press USA 52 Kunst H (1967) Isolation of duck plague virus in tissue cultures Tijdchr Diergeneesk, deel 92, afl II, 1967, pp 713 – 714 53 Lam, K.M (1984) Antibody and complement mediate cytolysis against duckenteritis-virus-infected cells Avian Dis 28, pp 1125 - 1129 54 Leibovitz L (1991) Duck virus enteritis in disease of, Iowa State University Press, pp 609-618 55 Leibovitz L and Hwang J (1967) Duck plague on the American continent, Proc 39th Ann Mtg Northeasthern Conj Avian disease State Univer NewYork Stony, N.Y.Yune 1967 56 Li H., Liu S and Kong X (2006) Characterization of the genes encoding UL24, TK and gH proteins from duck enteritis virus (DEV): a proof for the classification of DEV, Virus Genes 2006 Oct; 33(2): 221-7 57 OIE (2000) Manual of Standards for diagnostic test and 66 download by : skknchat@gmail.com vaccines, http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00111.htm 20/05/2014 58 OIE (2006) Annual animal disease status, http://www.oie.int/hs2/report.asp 59 Proctor, S.J (1976) Pathogenesis of duck plague in the bursa of Fabricius, thymus and spleen American Journal of Veterinary, Research, 37, 427– 431 60 Pritchard L.I., Morrissy C., Van Phuc K., Daniels P.W and Westbury H.A (1999) Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis, Vet Microbiol, 1999 Aug 16; 68(1-2): 149-56 61 Reed, L.J and Muench, H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints The American Journal of Hygiene 27(3), 493–497 62 Renyong Jia, Anchun Cheng, Mingshu Wang, Dekang Zhu, Han Ge, Hongyi Xin, Fei Liu, Qihui Luo, Yufei Guo, Xuefeng Qi, Zhongqiong Yin and Xiaoyue Chen (2009) Cloning, Expression, Purification and Characterization of UL24 Partial Protein of Duck Enteritis Virus, Intervirology; Vol 52, number :326-334 63 Sarmah R and Sarmah A.K (1996) Development of interference against duck plague virus, Indian J virol, No.2.pp 113-114 64 Sandhu T.S., Leibovitz L Duck virus enteritis (Duck plague) Diseases of Poultry 2008 pp 384–393 65 Shawky S (2000) Target cells for duck enteritis virus in lymphoid organs, Avian Pathology, Volume 29, Number 6, pp 609-616(8) 66 Shawky S.A and Sandhu T.S (1997) Inactivated vaccine for protection against duck virus enteritis, Avian Dis., 41, 461-468 67 Shawky S and Schat K.A (2002) Latency sites and reactivation of duck enteritis virus, Avian Dis., 2002 Apr-Jun; 46(2):308-13 68 Shengwang Liu, Huixin Li, Yang Li, Zongxi Han, Yuhao Shao, Rui An and Xiangang Kong (2008) Phylogeny of Duck Enteritis Virus: Evolutionary Relationship in the Family Herpesviridae, Intervirology; 51:151-165 69 Shengwang Liu, Shuhong Chen, Huixin Li and Xiangang Kong (2007) Molecular characterization of the herpes simplex virus (HSV-1) homologues, UL25 to UL30, in duck enteritis virus (DEV), Science direct Volume 401, Issues 1-2, 15 October 2007, Pages 88-96 70 Van Dux-baen, C At, and ỴL Kunst, 1955 Susceptibility of ducks and various other water fowl to duck plague virus Tidschrift voor Diergeneeskunde 80:1286-1295 67 download by : skknchat@gmail.com 71 Voxapeer Suwathanaviroij (1978) Report at Poultry disease workshop in Kualalumpur Malaysia 72 Woolcock P.R and J Fabricant (1991) Diseases of Poultry Nainth, Iwoa State University Press, Ames, Iwoa USA 73 XuefengC Qi, Yang XiaoyanC, Cheng AnchunCE, Wang MingshuCE, Zhu Dekang, and Jia Renyong (2007) Quantitative Analysis of Virulent Duck Enteritis Virus Loads in Experimentally Infected Ducklings, Avian Diseases 52(2):338-344 74 Xuefeng Qi, Xiaoyan Yang, Anchun Cheng, Mingshu Wang, Dekang Zhu, Renyong Jia and Qihui Luo (2009) Intestinal mucosal immune response against virulent duck enteritis virus infection in ducklings, Research in veterinary science, vol 87, no2, pp 218-225 75 Yufeng Li, Bing Huang, Xiuli Ma, Jing Wu, Feng Li, Wu Ai, Minxun Song and Hanchun Yang (2009) Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus, Virology, vol 391, no2, pp 151-161 68 download by : skknchat@gmail.com ... 36 4.1.2 Kết đánh giá số ELD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 41 4.1.3 Kết đánh giá số EID50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản ... phôi vịt - Xác định số sinh học ELD50, EID50 phôi vịt virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 sau bảo quản - Xác định số LD50 chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 động vật sau bảo quản 27 download... kiễm tra số đặc tính sinh học chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04 sau bảo quản 36 4.1.1 Kết kiểm tra khả thích ứng ổn định chủng virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 phôi vịt