Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4.5.Nghiên cứu biến đổi bệnh lý trên vịt do chủng virus cường độc dịch tả
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.5.Nghiên cứu biến đổi bệnh lý trên vịt do chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG – 04
Tất cả những vịt chết thu được ở phần 3.4.4 đem mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể sau đó lấy mẫu bệnh phẩm ngâm trong formol trung tính, rồi làm tiêu bản vi thể, quan sát biến đổi bệnh tích vi thể trên kính hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể
* Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể. Xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE).
Mỗi vịt bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai mẫu bệnh phẩm rồi đúc thành hai block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có hai tiêu bản có bệnh tích trở nên thì chúng tôi coi là dương tính.
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
a. Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đụng
hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37oC, máy cắt mảnh
microtom, nước ấm 48 – 52oC, xylem, parafin, thuốc nhuộm hematoxylin,
eosin…
a. Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là gan, khí quản, thận, lách.
b. Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
c. Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
+ Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm. Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h.
+ Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Cồn I: 3h
Cồn II: 3h Cồn III: 4h
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức
+ Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylem Xylen I: 3h
Xylen II: 3h Xylen III: 12h
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi tổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như miếng thạch là được. Nếu để quá lâu
tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
+ Khử Xylen: Cho qua hệ thống parafin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5 % sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Parafin I: 6h trong tủ ấm 56oC
Parafin II: 6h trong tủ ấm 56oC
Parafin III: 12h trong tủ ấm 56oC
Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn parafin
thấm đều trong các kẽ mô bào. Nếu nhiệt độ trên 56oC tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
khó cắt.
d. Đúc block
+ Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối parafin tạo thành một thể
thống nhất.
+ Chuẩn bị: Máy đúc block, parafin.
+ Phương pháp tiến hành: đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh parafin lỏng vào khuôn block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block. Để nguội đến khi block đông cứng đặc chắc là được.
e. Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
+ Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức.
+ Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm
48 – 52oC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở
tủ ấm 37oC trong vòng 24h.
f. Nhuộm tiêu bản
Các bước tiến hành:
+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 1h
Xylen II: 1h Xylen III: 1h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1: 10 phút
Cồn 2: 10 phút Cồn 3: 10 phút
+ Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 15 phút. + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân):
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương):
Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng 5 – 10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa.
+ Tẩy nước: Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 4: 1 phút
Cồn 5: 1 phút
Cồn 6: 1 phút
Rửa tiêu bản
g. Gắn Baume canada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu
xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng. Không có nước, không có bọt khí là được. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});