Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%-2%,
Kỹ thuật điện di trên gel là hết sức quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính, chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic. Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn. Kiểu loại gel dùng trong điện di có
tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid. Agarose được chiết xuất từ tảo biển,
có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 450C, trong dung dịch
đệm ở nồng độ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v). Khi làm nguội
(dưới 450C), agarose đông lại thành gel. Gel agarose thường được dùng để chạy
trong máy điện di. Gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn. Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi đưa vào gel chạy tới đầu cuối của gel. Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại. Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002).
Theo Vũ Minh Thục (2004), nhược điểm chính của phương pháp PCR là sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả “dương tính sai”, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt, Hansen (1999) đã khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đã được kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, gà, ... Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm. Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt. Với hai đoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào.
2.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH DỊCH TẢ VỊT
2.2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt tại Việt Nam
Năm 1963, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại Cao Bằng làm thiệt hại trên 3000 vịt.
Tháng 5/1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt đã làm thiệt hại tới 15000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội. Cũng năm này, chủng virus nhược độc
dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt đã được sử dụng để sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt ở Việt Nam (Trần Minh Châu,1980).
Ở Việt Nam, chủng virus nhược độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt đã được sử dụng để sản xuất vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, vaccxin tạo được miễn dịch tốt cho đàn vịt. Vịt con 1 ngày tuổi sau khi tiêm vacxin được bảo hộ chắc chắn 100% đến 45 ngày tuổi, vịt lớn kéo dài miễn dịch tới 9 tháng.
Trần Minh Châu (1987), đã nghiên cứu chủng vacxin nhược độc dịch tả vịt thích nghi trên phôi gà. Tác giả cho biết, chủng virus này gây chết phôi gà rất
ổn định, thời gian chết phôi 72-120 giờ. Virus vacxin có ELD50 từ 10-3,31/0,2 ml
đến 10-4,5/0,2 ml. Vacxin khi sử dụng an toàn cho vịt nhưng về hiệu lực cần
nghiên cứu thêm. Tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vô hoạt và đưa ra kết luận: Vacxin vô hoạt cũng tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng đáp ứng miễn dịch không mạnh mà giá thành lại cao.
Phạm Thị Lan Thu và Thân Thị Hạnh (1989) cho biết đàn vịt của Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát ra bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi. Các tác giả đã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên đàn vịt ở Phú Khánh.
Lê Văn Lãnh (1991), nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vacxin dịch tả vịt chủng Jansen và cho biết virus vacxin có tính ổn định khi nuôi cấy trên
phôi gà và tế bào xơ phôi gà 1 lớp; chỉ số ELD50 biến động trong khoảng từ 10-
3,31/0,2 ml đến 10-3,36/0,2 ml; CPE50 biến động từ 10-4,36 đến 10-4,54. Vacxin an
toàn cho mọi lứa tuổi vịt, hiệu lực của vacxin cao. Vacxin được chế biến dưới 2 dạng là vacxin tươi và vacxin đông khô.
Vacxin tươi thường được đóng ở ampoul 100 liều, chỉ bảo quản tối đa là 4 tháng ở kho lạnh và phải dùng không quá 6 giờ khi đã pha loãng vacxin bằng nước sinh lý. Vacxin đông khô thì thời gian bảo quản dài hơn (khoảng 1 năm) và ít bị mất hiệu lực khi gặp điều kiện bất lợi. Vacxin đông khô có thể đóng ampoul 100 liều hoặc chai có từ 500-1000 liều (Nguyễn Như Thanh, 2001). Tuỳ theo liều đóng vacxin mà pha loãng với nước sinh lý đủ cho 0,2ml/vịt con và 0,3-0,5ml/vịt lớn. Đường tiêm chủ yếu là dưới da hoặc bắp lườn.
Nguyễn Đức Hiền (1999) đã chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt ở Cần Thơ và theo kết quả chẩn đoán lâm sàng thì trên 1.176 vịt bệnh được mổ khám có 455 vịt được chẩn đoán là mắc bệnh dịch tả vịt. Tác giả cũng nghiên cứu về vacxin dịch tả vịt kết luận phương pháp nhỏ mắt hoặc tiêm bắp hoặc kết
hợp cả hai đều cho đáp ứng miễn dịch tương đối giống nhau và đạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%.
Nguyễn Ngọc Huân (2006) khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt đông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi ở nông hộ.
Từ năm 2000 đến nay, bộ môn VSV-TN, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đang có những nghiên cứu về việc chế tạo vacxin mới với chủng virus cường độc dịch tả vịt DP-EG-2000 có xuất xứ từ nước ngoài. Những kết quả thử nghiệm ban đầu khá khả quan, dần đáp ứng được yêu cầu trong nghiên cứu và sản xuất.
2.2.2. Những nghiên cứu về bệnh dịch tả vịt ở nước ngoài
Ở nước ngoài, bệnh dịch tả vịt đã được nghiên cứu về triệu chứng và bệnh tích từ lâu. Cho đến nay, những hiểu hiết về virus dịch tả vịt là rất sâu và đều được các tác giả tập trung vào lĩnh vực sinh học phân tử của virus.
Shawky (2000), nghiên cứu về tế bào đích của virus dịch tả vịt trong các cơ quan lâm ba. Các tác giả cho biết kháng nguyên dịch tả vịt được tìm thấy ở trong lách, tuyến ức, và túi Fabricius vào ngày thứ 3, 6 và thứ 8 sau khi gây nhiễm. Kháng nguyên được xác định trong tế bào biểu mô của tất cả các cơ quan Lympho được kiểm tra. Tế bào B di chuyển ra từ túi Fabricius và không thể tuần hoàn ngược về, sự di chuyển của tế bào B tới lách chỉ xuất hiện vào ngày thứ 8 sau khi gây nhiễm. Các tác giả kết luận, tế bào đích của virus dịch tả vịt là tế bào biểu mô và tế bào B.
Shengwang et al. (2007), đã nghiên cứu tính tương đồng về mặt phân tử
của herpes simplex virus 1 (HSV-1), UL25 và UL30 trong virus dịch tả vịt.
XuefengC Qi et al. 2007, đã phân tích định lượng virus dịch tả vịt ở đàn
vịt bị công cường độc và cho biết tỷ lệ nhiễm của virus dịch tả vịt ở túi Fabricius và ruột non là rất cao.
Shengwang et al. (2008), đã tiếp tục nghiên cứu về sự phát sinh loài của
virus dịch tả vịt và quan hệ tiến hoá trong họ Herpesviridae. Từ phân tích phả hệ các tác giả cho biết virus dịch tả vịt và những herpesvirus khác đều bắt nguồn từ một nhánh và virus gây bệnh dịch tả vịt thuộc phân nhóm dưới họ Alphaherpesvirinae. Trong hầu hết các trường hợp, virus gây bệnh dịch tả vịt có quan hệ gần với chi Mardivirus, nhưng tách ra một nhánh riêng.
Renyong Jia et al. 2009, trong nghiên cứu của mình đã công bố ở vịt trắng Bắc Kinh bị gây nhiễm bởi chủng DEV-97, 3 tuần sau khi gây nhiễm, không thể xác định được virus ở các mô và swab ổ nhớp (cloacal swabs (CSs)). Từ 7 đến 9 tuần sau khi gây nhiễm, DNA của virus được xác định bằng phương pháp PCR trong hạch thần kinh. Tác giả cho rằng đây là hiện tượng virus ở thể ẩn. DNA virus được xác định trong hạch lâm ba ngoại vi, lách, tuyến ức, túi Fabricius và hạch thần kinh trong điều kiện in vitro. Đồng thời các tác giả cũng tiến hành dòng hoá, giải trình tự, tinh sạch và tìm hiểu đặc tính sinh học của phân đoạn protein UL24 của virus dịch tả vịt.
Chanjuan Shen et al. (2009), đã định vị phân bố protein UL51 của virus
dịch tả vịt trong tế bào bằng sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp. Xuefeng Qi (2009), đã nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch ở niêm mạc ruột với sự gây nhiễm virus dịch tả vịt cường độc bằng phương pháp tinh sạch IgA. Kết quả cho thấy các mức độ DNA của dịch tả vịt tiếp tục tăng trong máu và nhiều cơ quan khác. Hơn nữa, IgA và IgG đặc hiệu dịch tả vịt tăng lên trong mật, huyết thanh và ruột. Mật độ IgA trong ruột được xác định từ 1-12 ngày sau khi gây nhiễm. Các tác giả kết luận gây nhiễm virus dịch tả vịt có thể kích thích cả IgA trong ruột và IgG trong huyết thanh.
Đáng kể nhất là công trình nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của hệ
gen virus dịch tả vịt của Yufeng et al. (2009). Các tác giả đã xác định toàn bộ
trình tự gen của virus dịch tả vịt. Theo các tác giả, hệ gen của virus có độ dài là 158.091 bp, mã hoá 78 protein và có sự tương đồng với những virus thuộc họ Alphaherpesvirinae về mặt tổ chức và kết hợp gen. Hệ gen của virus bao gồm các vùng gen unique long (UL), unique short (US), unique short internal repeat (IRS) và unique short terminal repeat (TRS). Cách thức sắp xếp hệ gen (UL-IRS-US- TRS) tương ứng với D-type herpesvirus và phù hợp với những thành viên của Varicellovirus và Iltovirus. Phân tích trình tự cho thấy hệ gen của virus chứa 67
gen tương đồng với những virus thuộc họ Alphaherpesvirinae. Ngoài những gen
này ra, có một gen tương đồng với Herpesvirus 8 ở loài linh trưởng, là virus
thuộc họ Betaherpesvirinae, và 5 gen tương đồng với Herpesviruse ở gia cầm.
Mặt khác, hệ gen có 3 gen duy nhất không tương đồng với bất cứ một loại
Herpesviruse nào. Giống hầu hết các thành viên thuộc họ Alphaherpesvirinae,
IRS-US lại tương tự với virus gây bệnh Marek và Herpesviruses 1 gây bệnh trên ngựa. Do vậy, từ những dữ liệu phân tích hệ gen, các tác giả đề nghị xếp virus
gây bệnh dịch tả vịt vào họ Alphaherpesvirinae.
2.3. VIRUS GÂY BỆNH DỊCH TẢ VỊT
Virus gây bệnh dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesviridae
nhóm Herpesvirus. Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng
có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2001). Theo Li
et al. (2006) virus gây bệnh dịch tả vịt có thể được phân loại vào phân họ
Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae.
2.3.1. Hình thái và kích thước
Nhìn qua kính hiển vi điện tử thấy virus dịch tả vịt có hình cầu, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa. Ở những tế bào được gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất. Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi. Trong nhân của những tế bào có hay không có thể vùi xuất hiện những khoảng trống, ở đó có những virus hoặc tập hợp virus có capxit hình cầu hoặc sáu cạnh Nucleocapxit có đường kính là 93,5 nm; Sau khi qua màng vào nguyên sinh chất đường kính của hạt virus tăng lên có thể đo được 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm (Nguyễn Như Thanh, 2001).
Theo Trần Minh Châu (1987) ở Việt Nam, virus dịch tả vịt cường độc chủng 769 có hình thái và cấu trúc giống như virus mà Proctor (1976) đã mô tả.
Virus dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, Berkefeld nhưng không qua được màng lọc Seitz. Bằng phương pháp lọc qua màng lọc; Hess and Dardini (1968) đã nhận xét, virus dịch tả vịt nhược độc chủng Jansen và virus cường độc có kích thước 150-250 nm.
2.3.2. Cấu trúc
Virus có vỏ bọc bên ngoài là các nucleocapsid. Capsid hình khối đa diện. Nhân của virus là một ADN sợi đôi, gồm 158 – 180 Kbp. Hệ gen bao gồm 78 khung đọc mở mã hóa protein cho virus. Hệ gen của virus bao gồm các vùng gen unique long (UL) chứa 65 khung đọc mở, unique short (US) chứa 11 khung đọc mở, 2 khung đọc mở còn lại nằm ở vùng cấu trúc lặp unique short internal repeat (IRS) và unique short terminal repeat (TRS).
19 N gu ồn : Y uf en g L i et a l . / V ir ol og y 39 1 (2 00 9) 1 51 –1 61 H ìn h 2. 2. H ệ ge n củ a vi ru s d ic h tả v ịt
2.3.3. Sức đề kháng
Với nhiệt độ, theo nghiên cứu của Hess (1968), ở 22oC virus giảm dần tính
gây nhiễm đến 30 ngày thì virus bị vô hoạt hoàn toàn. Virus bị mất hoạt tính ở
50oC sau 2 giờ 30 phút. Nếu được sấy khô bằng CaCl2 thì sau 9 ngày virus bị
chết. Ở 0o - 4oC virus không bảo quản được 3 tháng nhưng nếu ngâm trong dung
dịch Glyxerin 50% thì virus giữ được độc lực trong thời gian trên. Theo Trần Minh Châu (1986) thì virus dịch tả vịt đề kháng kém với nhiệt độ, ở nhiệt độ cao virus bị vô hoạt nhanh còn ở nhiệt độ thấp hơn thì tính gây nhiễm của virus giảm dần. Ngoài ra, Nguyễn Như Thanh (2001) khẳng định: Virus mất khả năng gây
nhiễm ở 300C sau 2 giờ; 700C trong 20 phút, 800C virus bị vô hoạt sau 5 phút.
Trong điều kiện lạnh từ -100C đến -200 C, virus có thể tồn tại rất lâu. Làm đông
khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm mà còn không
làm mất độc lực của virus. Với pH môi trường: virus ổn định ở pH từ 5 - 10 và
bị bất hoạt khi pH < 3 hoặc pH > 10.
Với một số nhân tố hóa học, virus dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform. Dưới tác dụng của hai chất này, virus bị phá hủy. Kunst (1967) cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh hưởng
với virus. Theo Nguyễn Thát (1975); Nguyễn Như Thanh (2001) thì cồn 750 diệt
virus trong 5-30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút. NaOH 2% vỡ
NH4OH 0,5% ở 220C cũng giết chết virus sau 30 phút.
Với một số enzym, Dardini and Hess (1968) cho biết virus dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tụy phá hủy.
Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài tới 30 ngày (OIE, 2006), 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt nó vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987).
2.3.4. Độc lực
Đã xác định được một số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau: Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59, W60,