vòng nhẫn
Hình 4.8. Dạ dày cơ và dạ dày tuyến xuất huyết
Ruột xuất huyết hình vòng nhẫn (hình 4.7). Dạ dày tuyến phủ nhiều dịch nhớt giống như mủ, gạt lớp niêm dịch thấy niêm mạc xuất huyết (hình 4.8). Dạ dày cơ cũng xuất huyết nặng (hình 4.8). Kết quả mổ khám cũng cho thấy tim xuất huyết, niêm mạc hậu môn tụ huyết, xuất huyết và loét, thận tụ huyết, tuyến tụy xuất huyết. Hậu môn, trực tràng xuất huyết thành những vệt màu đỏ, xen kẽ những vết loét màu vàng.
Kết quả kiểm tra bệnh tích vi thể cho thấy gan thái hóa mỡ (hình 4.9); sung huyết biểu mô khí quản (hình 4.10), tế bào biểu mô khí quản bong tróc
Hình 4.9. Gan thoái hóa mỡ (HE40X)
Hình 4.10. Sung huyết biểu mô khí quản và bong tróc (HE40X)
Hình 4.11. Tế bào biểu mô khí quản bong tróc (HE10X)
Hình 4.12. Xuất huyết ở hạ niêm mạc khí quản (HE40X)
4.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT VG-04 CỦA CHỦNG VIRUS CƯỜNG ĐỘC DỊCH TẢ VỊT VG-04
4.2.1. Kết quả khuếch đại trình tự đoạn gene US7
Trong các nghiên cứu về sinh học phân tử thì phản ứng PCR đã và đang là công cụ hữu hiệu dùng để chẩn đoán cũng như khuếch đại các gene khác nhau
của virus dịch tả vịt (Hansen et al., 1999; Hu et al., 2009; Zhang et al., 2011).
Trong nghiên cứu này mẫu DNA của virus cường độc dịch tả vịt VG-04 đã được tách chiết và dùng cho phản ứng PCR để khuếch đại vùng gene US7. Kết quả chạy điện di trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi DEV-
US7F/DEV-US7R đặc hiệu cho gene US7 có kích thước khoảng 557 bp, đúng với kích thước như đã được công bố trước đây (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2016) (hình 4.13).
M 1
Hình 4.13. Kết quả kiểm tra sản phảm PCR trên gel Agarose.
Giếng M: Marker DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen); Giếng 1: Gene US7 (557 bp)
4.2.2. Kết quả phân tích trình tự gene US7
Theo Wu et al., (2012), gene US7 được cho là gene có mức độ đa dạng
khá cao trong genome của virus dịch tả vịt. Trong nghiên cứu này gene US7 của chủng virus VG - 04 đã được giải trình tự và được so sánh về trình tự nucleotide với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác. Kết quả ở bảng 4.13 cho thấy, mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng gene US7 giữa chủng virus VG – 04 và các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác dao động trong khoảng từ 96,5% - 99,6%.
Kết quả phân tíchvề trình tự gene US7 cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG - 04 có mức độ tương đồng 100% khi so sánh với chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000 (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2016). Khi so sánh với chủng virus dịch tả vịt cường độc CV và CHv của Trung Quốc (mã số
truy cập tương ứng trên ngân hàng GenBank: JQ673560 và JQ647509)(Wu et al.,
tự khi so sánh với chủng virus vacxin DEV03 và VAC (mã số truy cập tương ứng
trên ngân hàng GenBank: HQ009801 và EU082088) (Li et al., 2009) của Trung
Quốc, tỷ lệ tương đồng về trình tự gen US7 tương ứng là 99,6% và 96,5%.
Bảng 4.13. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide vùng gene US7 giữa chủng virus dịch tả vịt cường độc VG- 04 trong nghiên cứu này với các
chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác trên thế giới
STT Chủng virus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 DP-EG-2000 2 VG-04 100 3 JQ673560 CV/China 99.4 99.4 4 KF487736 K/China 99.4 99.4 100 5 JQ647509 CHv/China 99.4 99.4 100 100 6 KF263690 C-KCE/China 99.6 99.6 99.8 99.8 99.8 7 JF999965 2085/Germany 99.1 99.1 99.6 99.6 99.6 99.4 8 HQ009801 DEV03/China 99.6 99.6 99.8 99.8 99.8 100 99.4 9 EU082088 VAC/China 96.5 96.5 96.7 96.7 96.7 96.9 96.4 96.9
Kết quả phân tích về trình tự nucleotide vùng gene US7 cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG – 04 hoàn toàn đồng nhất với chủng virus vacxin dịch tả vịt nhược độc DP-EG-2000 của Việt Nam (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2016) và sai khác so với các chủng virus tham chiếu còn lại ở 2 vị trí: 193 (T↔C) và 396 (T↔A). Bên cạnh đó, chủng virus VG-04 có sự sai khác so chủng CV (mã số
truy cập ngân hàng GenBank: JQ673560) (Yang et al., 2014), chủng K (mã số
truy cập ngân hàng GenBank: KF487736) (Yang et al., 2013), chủng CHv (mã số
truy cập ngân hàng GenBank: JQ647509) (Wu et al., 2012) và chủng 2085 (mã
số truy cập ngân hàng GenBank: JF999965) (Wang et al., 2011) ở vị trí 555
(T↔G). Ngoài ra, sự sai khác giữa chủng virus VG-04 và chủng 2085 còn xuất hiện thêm ở vị trí 288 (A↔G) và 512 (C↔A). Khác biệt về trình tự nucleotide
giữa chủng virus VG-04 và chủng virus vacxin VAC (Li et al., 2009) đang sử
dụng ở Trung Quốc xảy ra ở vị trí nucleotide 159 (T↔G), 204 (G↔T), 214 (G↔T), 229 (T↔C), 231 (C↔T), 250 (G↔C), 260 (T↔C), 262 (G↔A), 265 (A↔T), 269 (G↔C), 277 (T↔C), 283 (T↔C), 285 (A↔T), 287 (A↔T), 302 (A↔C), 318 (G↔T). Đặc biệt, ở chủng virus vacxin VAC xuất hiện đột biến thêm T ở vị trị 314 làm thay đổi khung đọc của vùng gene US7 ở chủng này so với các chủng khác (hình 4.14).
10 20 30 40 50 60 70 80 90
. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 GAAGCCTGTGACCGTTCCTACGACTAACAATTACACAACATTATCTGATGATATGCAGCCTACGCATAATGATACCAATAGTGGACTTAA VG-04 .......................................................................................... JQ673560 CV/China .......................................................................................... KF487736 K/China .......................................................................................... JQ647509 CHv/China .......................................................................................... KF263690 C-KCE/China .......................................................................................... JF999965 2085/Germany .......................................................................................... HQ009801 DEV03/China .......................................................................................... EU082088 VAC/China .......................................................................................... 100 110 120 130 140 150 160 170 180 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 TATCTTTGACAAAATTCCAAATATCTATCTTATCCCAGCTGTAATGTTTGTGGTACTACCGCTGACCATATTCATCGTGTTGATGTGCTC VG-04 .......................................................................................... JQ673560 CV/China .......................................................................................... KF487736 K/China .......................................................................................... JQ647509 CHv/China .......................................................................................... KF263690 C-KCE/China .......................................................................................... JF999965 2085/Germany .......................................................................................... HQ009801 DEV03/China .......................................................................................... EU082088 VAC/China ....................................................................G..................... 190 200 210 220 230 240 250 260 270 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 TCCTCTTAAACGTAAATTATGTCGTTGTTGTACGAAACGACGTGTTTATACAGGTTCTACCACAAGCGTGATCAACCAATCGGCACTGGA VG-04 .......................................................................................... JQ673560 CV/China ............C............................................................................. KF487736 K/China ............C............................................................................. JQ647509 CHv/China ............C............................................................................. KF263690 C-KCE/China ............C............................................................................. JF999965 2085/Germany ............C............................................................................. HQ009801 DEV03/China ............C............................................................................. EU082088 VAC/China ............C..........T.........T..............C.T..................C.........C.A..T...C. 280 290 300 310 320 330 340 350 360 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 TAATCCTCCTTCTCAAGACGCTCTGGAATCAAAACATCCGGAG-CTAGATGGTACCCTAATGAGAAAGCTGGAGGAAAAACTGGCAGCGT VG-04 ...........................................-................................... JQ673560 CV/China ...........................................-................................... KF487736 K/China ...........................................-................................... JQ647509 CHv/China ...........................................-................................... KF263690 C-KCE/China ...........................................-................................... JF999965 2085/Germany .................G.........................-................................... HQ009801 DEV03/China ...........................................-................................... EU082088 VAC/China ......C.....C.T.T..............C...........T...T............................... 370 380 390 400 410 420 430 440 450 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 ATGACAGCTCTGGGGATCATAAAACAGAATAATTCTCATCAGTATGACTAAAAGTAAATGTTTTTGTTATGATTGACTGTTTGCCTTTCA VG-04 .................................................................................... JQ673560 CV/China .................................A.................................................. KF487736 K/China .................................A.................................................. JQ647509 CHv/China .................................A.................................................. KF263690 C-KCE/China .................................A.................................................. JF999965 2085/Germany .................................A.................................................. HQ009801 DEV03/China .................................A.................................................. EU082088 VAC/China .................................A.................................................. 460 470 480 490 500 510 520 530 540 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
DP-EG-2000 TTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGGAGCTATAGATCTGTACTAATTTAAGTGTGCAGCCTGGTTAACTG VG-04 .......................................................................................... JQ673560 CV/China .......................................................................................... KF487736 K/China .......................................................................................... JQ647509 CHv/China .......................................................................................... KF263690 C-KCE/China .......................................................................................... JF999965 2085/Germany .............................................................A............................ HQ009801 DEV03/China .......................................................................................... EU082088 VAC/China .......................................................................................... 550 . . . . | . . . . | . . . . | . . . DP-EG-2000 TATTATGCGCGGAGTTTG VG-04 .................. JQ673560 CV/China ..............G... KF487736 K/China ..............G... JQ647509 CHv/China ..............G... KF263690 C-KCE/China .................. JF999965 2085/Germany ..............G... HQ009801 DEV03/China .................. EU082088 VAC/China ..................
Hình 4.14. So sánh trình tự vùng gene US7 giữa chủng virus cường độc dịch tả vịt VG - 04 trong nghiên cứu này với các chủng virus dịch tả vịt tham
4.2.3. Kết quả phân tích cây phả hệ (phylogenetic tree) dựa trên trình tự vùng gene US7 vùng gene US7
Trình tự nucleotide của vùng gene US7 đã được sử dụng để xây dựng cây phả hệ nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền giữa chủng virus dịch tả vịt VG-04 với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác trên thế giới.
Hình 4.15. Mối quan hệ di truyền giữa chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 trong nghiên cứu này với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác
trên thế giới dựa trên trình tự gene US7.
Kết quả phân tích cây phả hệ ở hình 4.15 cho thấy chủng virus VG-04 cũng có mối quan hệ di truyền gần gũi với các chủng virus dịch tả vịt phân lập được từ thực địa tại Trung Quốc trong những năm gần đây (chủng K, CV, CHv). Kết quả phân tích này còn cho thấy chủng virus VG-04 nằm cùng nhánh với chủng virus vacxin dịch tả vịt nhược độc DP – EG – 2000 của Việt Nam (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2016) và nằm khác nhánh với chủng virus vacxin VAC
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1. KẾT LUẬN
1. Sau 10 năm bảo quản ở -860C dưới dạng nước trứng tươi và bệnh
phẩm, chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 vẫn ổn định về một số đặc tính sinh học:
- Có tính thích ứng cao và ổn định trên phôi vịt 13 ngày tuổi. Virus nhân lên trong phôi, gây chết phôi với bệnh tích đặc trưng, số phôi chết tập trung ở khoảng thời gian từ 73 - 120 giờ.
- Chỉ số ELD50 và EID50 của chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 04
sau bảo quản ở -860C dưới dạng bệnh phẩm và nước trứng tươi vẫn tương đối
ổn định.
+ Chỉ số ELD50 và EID50 trung bình sau bảo quản dưới dạng bệnh phẩm
qua 3 lần chuẩn độ tương ứng là: 105,29ELD50/0,2 ml và 107,56 EID50/0,2 ml.
+ Chỉ số ELD50 và EID50 trung bình sau bảo quản dưới dạng nước trứng
tươi qua 3 lần chuẩn độ tương ứng là: 105,39ELD50/0,2 ml và 107,63 EID50/0,2 ml.
- Kết quả gây nhiễm virus trên vịt cho thấy chủng virus dịch tả vịt cường độc VG-04 có khả năng nhân lên và gây chết vịt thí nghiệm với các triệu chứng
và bệnh tích đặc trưng. Chỉ số LD50 trung bình của chủng virus cường độc dịch tả
vịt VG – 04 sau bảo quản ở -860C dưới dạng bệnh phẩm và nước trứng tươi vẫn
tương đối ổn định và tương ứng là: 109,13/0,5 ml và 109,23/0,5 ml.
Như vậy, sau 10 năm bảo quản ở -860C chủng virus cường độc dịch tả vịt
VG – 04 ở dạng bệnh phẩm cũng như nước trứng vẫn thích ứng và ổn định trên phôi vịt, trên vịt; hiệu giá và độc lực virus vẫn đạt được ở mức cao.
2. Kết quả phân tích về trình tự nucleotide của đoạn gene US7 cho thấy chủng virus VG-04 có mức độ tương đồng cao khi so sánh với các chủng virus dịch tả vịt tham chiếu khác thu thập được trên ngân hàng GenBank, tỷ lệ tương đồng về nucleotide đạt từ 96,5 – 99,6%.
5.2. ĐỀ NGHỊ
1. Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy có thể sử dụng chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 phân lập được tại Việt Nam cho thí nghiệm công
cường độc để đánh giá hiệu lực của vacxin dịch tả vịt cũng như cho mục đích giảng dạy và nghiên cứu khác.
2. Để chủng virus cường độc dịch tả vịt VG-04 có chất lượng tốt, các chỉ số sinh học cũng như đặc tính kháng nguyên ổn định thì chỉ nên bảo quản trong khoảng thời gian 10 năm, cứ sau 10 năm phải tiến hành gây nhiễm virus trên bản động vật 1 lần.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005). Quyết định của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 63/2005/QĐ - BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 về việc Ban hành Quy định về tiêm phòng bắt buộc vacxin cho gia súc, gia cầm.
2. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005). Quyết định của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 64/2005/QĐ - BNN ngày 13 tháng 10 năm 2005 về việc Ban hành Danh mục các bệnh phải công bố dịch, các bệnh nguy hiểm của động vật, các bệnh phải áp dụng các biện pháp phòng bệnh bắt buộc.
3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2006). Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 815- 2006, Quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt, Hà Nội.
4. Kim Văn Phúc, Trần Đình Từ, Nguyễn Thị Lam Hương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Chung và Leigh Nind (1999). Phân lập – Giám định virus dịch tả vịt ở một số tỉnh Nam Bộ, Báo cáo hội nghị khoa học kỹ thuật chăn nuôi – thú y, Bộ NN&PTNT. 5. Lê Thanh Hoà (2002). Sinh học phân tử: Nguyên lý và ứng dụng. Tài liệu giảng dạy
sau đại học.
6. Lê Văn Lãnh (1991). Khảo sát một số đặc tính sinh học giống virus vacxin Jansen và chế vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, Tuyển tập công trình nghiên cứu KHKT Nông nghiệp 1986-1991, NXB Nông nghiệp, tr. 120-121.
7. Lê Hồng Mận (1999). Bệnh của vịt và biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Lê Hồng Mận (2005). Nuôi ngan vịt siêu thịt, NXB Thanh Hoá.
9. Lê Chí Minh, Hồ Đình Chúc và Bùi Quý Huy (1999). Kết quả điều tra dịch bệnh gia súc, gia cầm ở 5 tỉnh phía bắc (1995-1997), Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, hội thú y Việt Nam, tập 6, số 3- Trang 75.
10.Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch và Phạm Văn Ty (1972). Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
11.Nguyễn Xuân Bình, Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2006). 43 bệnh gia cầm và
cách phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
12.Nguyễn Ngọc Điểm (2005). Tình hình bệnh dịch tả vịt trên đàn vịt nuôi tại ngoại thành Hà Nội và một số tỉnh lân cận. Phân lập, khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus
cường độc, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội. 13.Nguyễn Bá Hiên (2005).Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus vacxin
nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
14.Nguyễn Bá Hiên (2009). Khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng virus vacxin nhược độc dịch tả vịt DP-EG-2000, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, Hội Thú y Việt Nam tập