Ký sinh trùng

GIÁO TRÌNH THỰC HÀNH KÝ SINH TRÙNG Y HỌC Mã môn học MIB 254 ĐÀ NẴNG , 03/2018 BÀI 1: KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ CÁCH SỬ DỤNG Mục tiêu: Sử dụng kính hiển vi cách thành thạo, hiểu biết nguyên tắc, ứng dụng Kính hiển vi Lịch sử phát triển Kính hiển vi Từ kính hiển vi (KHV) có tên Microscop tiếng Hy Lạp có nghĩa “người nhìn thấy vật nhỏ” (tên tiếng Anh Microscopy tiếng Pháp Microscopie) Thiết bị dùng để nhìn vật bé mà mắt thường khơng nhìn thấy Những KHV đơn giản có từ thời xa xưa muốn đề cập đến KHV phức tạp Vậy KHV phức tạp gì? Nhờ hai thấu kính, vật quan sát nhân ảnh lên gấp hai lần, hai thấu kính gọi tên vật kính, phóng đại hình ảnh lên lần thứ nhất, thấu kính thứ hai gọi thị kính phóng đại hình ảnh lên lần thứ hai Thực ra, trước KHV có vài thấu kính vừa sử dụng thị kính, vừa để dùng vật kính điều quan trọng tất loại KHV hoạt động dựa nguyên tắc phóng đại kép Ngày nay, người lĩnh vực khoa học công nghiệp làm việc thiếu KHV Những KHV quan sát vật thể nhỏ bé ánh sáng, sử dụng thấu kính quang học hay gương quang học để tăng độ phóng đại hệ quang học, chúng gọi KHV quang học Hiện có nhiều phương pháp khác không sử dụng ánh sáng để quan sát vật thể nhỏ bé KHV thuộc loại có tên gọi đặc trưng cho phương pháp quan sát Nguyên tắc hoạt động Kính hiển vi quang học thiết bị khơng thể thiếu phịng thí nghiệm nghiên cứu sinh học, cho phép quan sát giới hạn vật thể nhỏ công cụ đắc lực để ghi nhận kết thí nghiệm quan sát mô tả Vật quan sát AB (mẫu vật) đạt phía ngồi tiêu điểm (f) vật kính Vật kính tạo nên ảnh thật ngược chiều AB nằm phía ngồi tiêu điểm thị kính (F) Ảnh thật AB qua thị kính lại phóng đại lên lần thứ hai tạo nên ảnh có chiều AB (có nghĩa ngược chiều với vật) ảnh vật mà mắt người quan sát Như qua kính hiển vi, vật đươc phóng đại lên hai lần nhờ vật kính thị kính Độ phóng đại chung kính hiển vi (V) tích độ phóng đại riêng vật kính (Vvk) thị kính (Vtk) V = Vvk x Vtk Hình 1.1 Sơ đồ tạo ảnh kính hiển vi Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Kính hiển vi điện tử (Electron Microscopy) thiết bị dùng để nghiên cứu cấu trúc, vi cấu trúc vật chất, dùng phổ biến vật lý, công nghệ, y sinh học Hiện nay, xu hướng khoa học cơng nghệ nano KHV điện tử lại dụng cụ thiếu công nghệ Bài viết sau trình bày cách khái quát KHV điện tử (cấu tạo, nguyên lý hoạt động số hình ảnh) Tiếp đó, hệ KHV điện tử KHV điện tử truyền qua (TEM) có qt khơng qt ảnh Đối tượng sử dụng TEM chùm điện tử có lượng cao, cấu hình, linh kiện TEM đặt cột chân khơng siêu cao tạo nhờ hệ bơm chân không (bơm turbo, bơm iơn ) Kính hiển vi điện tử truyền qua quét (Scanning TEM - STEM) Kính hiển vi điện tử truyền qua quét loại kính hiển vi điện tử truyền qua khác với CTEM chùm điện tử truyền qua mẫu chùm điện tử hội tụ thành chùm hẹp quét mẫu Nhờ việc điều khiển độ thấu kính hội tụ, chùm điện tử hội tụ thành chùm tia có kích thước hẹp (các Hình 1.2 Nguyên tắc hoạt động KHV Điện tử STEM mạnh cho kích thước tới nm) cho phép ghi ảnh với độ phân giải cao Hơn nữa, chùm điện tử hội tụ, nên góc tán xạ điện tử sau truyền qua mẫu lớn tạo nhiều phép phân tích mạnh, ví dụ phép ghi ảnh trường tối với góc lệch vành khuyên lớn (High-annular dark-field imaging - HADF), khả phân tích phân bố nguyên tố với độ phân giải cực cao nhờ phép phân tích phổ tổn hao lượng điện tử (EELS) thực đồng thời với trình ghi ảnh Hơn nữa, ảnh độ phân giải cao trực tiếp liên quan đến nguyên tử khối ngun tố, hữu ích cho việc phân tích phân bố ngun tố hóa học STEM lần đầu xây dựng năm 1938 Manfred von Ardenne công ty Siemens (Berlin, Đức) sau thời gian TEM xuất hiện, phát triển việc khó khăn việc hội tụ chùm điện tử có tính đơn sắc vào điểm nhỏ Tuy nhiên, phải đến năm 1970 STEM thực phát triển nhờ việc tạo chùm điện tử có độ đơn sắc cao nhờ súng phát xạ trường (FEG) Cho đến nay, STEM công cụ mạnh để ghi ảnh với độ phân giải tới cấp nguyên tử Trong nghiên cứu phát triển STEM nay, mục tiêu loại trừ quang sai (do tính khơng hoàn toàn đơn sắc chùm điện tử) vấn đề cấp bách để đạt STEM có độ phân giải cực lớn Nhiều dự án xây dựng STEM mạnh phát triển dựa mục tiêu người ta xây dựng STEM có khả phân giải cao, gọi SuperSTEM Kính hiển vi đảo ngược Kính hiển vi đảo ngược cơng cụ khơng thể thiếu nhiều phịng thí nghiệm nghiên cứu vật liệu sống, công nghệ sinh học, di truyền học tế bào phương pháp kỹ thuật cổ điển ni cấy tế bào Lọai kính nâng cấp thành hệ thống chuyên dụng cho ứng dụng thông thường phát triển nghiên cứu đặc biệt Dịng sản phẩm kính hiển vi Wilovert Hund thiết kế riêng biệt cho xu hướng Với phương pháp khác tương phản nối hùynh quang, thiết bị phù hợp cho nhiều ứng dụng nghiên cứu lãnh vực: + Chăn nuôi, sinh vật học tế bào; + Nghiên cứu bệnh học tế bào; + Nghiên cứu miễn dịch; + Nghiên cứu hồ, nghiên cứu nấm; + Nghiên cứu vật ký sinh, có ký sinh trùng; + Nghiên cứu dược lý nghiên cứu liên quan phịng thí nghiệm Đặc điểm kính hiển vi đảo ngược Thân kính Wilovert dạng đúc khối hình chữ U giúp kính độ ổn định cao Bộ đảo mini dễ dàng lắp vào với kính hiển vi lọat Wilovert; Dãi lựa chọn rộng cho nguồn sáng: Đèn Halogen 6V / 20W 6V / 30W, ngồi chọn Hình 1.3 Kính hiển vi đảo ngược đèn 12V / 50W 12V / 100W Đèn thủy ngân HBO 50W HBO 100W cho nguồn sáng hùynh quang; Vật kính: Đối với kính hiển vi đảo mẫu nghiên cứu lọ nuôi cấy mô với chiều cao, độ dầy vật liệu khác nhau, trái lại với lam kính lamen mẫu chuẩn dùng cho kính hiển vi đứng, địi hỏi phải có phần quang học đặc biệt; Tụ quang, có nhiều lựa chọn: + Tụ quang NA 0.25 cho sáng ánh sáng truyền qua với khỏang cách làm việc 58 mm; + Tụ quang kết hợp NA 0.25 với khỏang cách làm việc 58 mm cho sáng ánh sáng truyền qua phản pha + Tụ quang NA 0.4 cho sáng ánh sáng truyền qua với khỏang cách làm việc 55 mm + Tụ quang kết hợp NA 0.4 với khỏang cách làm việc 38 mm cho sáng ánh sáng truyền qua phản pha Giá đỡ cho lọ nuôi cấy: lọ nuôi cấy thường sử dụng đĩa Petri, lọ nuôi cấy mô, khay microtest khay microtiter đặt khung giữ đặc biệt kính hiển vi Wilovert Bộ phận dẫn hướng mục tiêu đảm bảo mẫu quét hoàn toàn Ứng dụng nghiên cứu loại kính hiển vi Kính hiển vi quang học (Optical microscopy) Trong nghiên cứu đơn bào sốt rét: + Xét nghiệm lam máu soi kính hiển vi phát hiện, chẩn đốn lồi đơn bào sốt rét đến xem “chẩn vàng” chẩn đốn Mặc dù, có nhiều phương pháp, kỹ thuạt đại giúp chẩn đoán sớm bệnh test chẩn đoán nhanh, quang phổ, quang phổ khối đơn dòng, đa dòng; sinh học phân tử PCR, …, chưa có phương pháp hay kỹ thuật thay bao phủ tính tồn vẹn chúng phương pháp vừa mang tính định tính vừa mang tính định lượng, khơng giúp chẩn đốn, theo dõi điều trị mà cịn tiên lượng bệnh; + Bên cạnh đó, chúng cịn cơng cụ thiếu nghiên cứu mảng đánh giá thường quy hiệu lực thuốc theo phác đồ Bộ Y tế hành mà đánh giá hiệu lực thuốc sốt rét hay nghiên cứu kháng thuốc; + Các phương pháp khác dù có đại, nhanh, xác,…cũng khơng thể thay hồn tồn tính ưu việt KHV mà mang tính chất hỗ trợ Trong nghiên cứu ký sinh trùng giun sán: + Xét nghiệm mẫu phân thu thập cộng đồng bệnh nhân nằm điều trị, xử lý soi KHV cho phép xác định số loại trứng, ấu trùng, trưởngthành số loài giun, sán ký sinh gây bệnh người động vật lây sang người (người vật chủ tình cờ); + KHV cơng cụ giúp theo dõi diễn tiến điều trị ca bệnh lâm sàng bệnh viện; + Cũng phát hiện, chẩn đoán đơn bào sốt rét, kỹ thuật sử dụng KHV giúp cho đánh giá hiệu lực thuốc điều trị giun sán, tình trạng mức độ kháng thuốc giun sán người gia súc, thông qua đánh giá tỷ lệ trứng, số giảm trứng,… Trong nghiên cứu côn trùng truyền bệnh: + Sau thu thập làm tiêu muỗi, sử dụng KHV để soi định loại muỗi, đánh giá tỷ lệ có mặt lồi muỗi vùng nghiên cứu; + Hoặc mổ muỗi phát thoa trùng vấn đề liên quan khác BÀI 2: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN MỤC TIÊU  Mô tả quy trình kỹ thuật xét nghiệm phân  Thao tác kỹ thuật quy trình nhận định kết  Hiểu ưu nhược điểm số kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp, Willis, Kato kỹ thuật giấy bóng I Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp thường dùng nước muối sinh lý dung dịch lugol nhằm phát trứng giun sán đơn bào đường ruột có mẫu phân Chuẩn bị phương tiện 1.1 Dụng cụ: - Lọ đựng phân có ghi tên, tuổi bệnh nhân - Lam kính, lamen - Bút chì kính - Que tre que nhựa 1.2 Hoá chất: - Nước muối sinh lý - Dung dịch lugol: + Iod: 1g + Kali Iodid: 2g + Nước cất vừa đủ : 100mL Dung dịch lugol đựng lọ màu, thời gian sử dụng tháng 1.3 Bệnh phẩm: Đánh số thứ tự phù hợp với phiếu xét nghiệm Quy trình kỹ thuật Chuẩn bị đủ dụng cụ, hoá chất, bệnh phẩm Đánh dấu tiêu đầu bên trái lam kính Nhỏ giọt nước muối sinh lý bên trái giọt lugol bên phải lam Dùng que lấy lượng phân tương đương với đầu que diêm trộn vào giọt nước muối sinh lý Lấy thêm phân trộn vào giọt lugol Đậy lamen lên giọt cách đặt nghiêng cạnh lamen xuống trước, từ từ hạ lamen xuống Đảm bảo vệ sinh, soi vật kính 40x dung dịch khơng tràn, khơng có bọt Soi kính hiển vi vật kính 10x vật kính 40x Soi theo hình chữ chi từ phải sang trái, từ xuống Ghi kết vào phiếu xét nghiệm Xử lý tiêu bản, bệnh phẩm sau xét nghiệm Tiêu chuẩn tiêu tốt Tiêu không dày mỏng q Phân hồ đều, khơng có bọt, dịch phân khơng tràn xung quanh không tràn sang giọt Mỗi mẫu phân làm tiêu Cách đánh giá kết quả: Đánh giá sơ tiêu trực tiếp: Có 1-2 trứng vi trường: (+) Có 3-5 trứng vi trường: (++) Có 6-20 trứng vi trường: (+++) Có >20 trứng vi trường: (++++) Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp kỹ thuật định lượng đơn giản, cho kết qủa nhanh, dụng cụ hoá chất khơng phức tạp, phát loại trứng giun sán, ấu trùng giun đơn bào có phân Tuy nhiên khối lượng phân nên trường hợp ký sinh trùng, kỹ thuật khơng phát Vì vậy, để kết luận trường hợp không thấy trứng giun sán đơn bào nên xét nghiệm 2-3 lần kết hợp với phương pháp khác II Kỹ thuật Willis Nguyên tắc: Kỹ thuật Willis dựa đặc tính trứng giun dung dịch nước muối bão hồ có tỷ trọng cao dính vào thuỷ tinh 10 BÀI 7: KỸ THUẬT KÉO MÁU VÀ NHUỘM GIEMSA TÌM KÝ SINH TRÙNG BỆNH SỐT RÉT Mục tiêu:  Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất để kéo máu nhuộm Giemsa  Mô tả thao tác kỹ thuật để hoàn thành tiêu tìm KST sốt rét DỤNG CỤ & HỐ CHẤT: • Giá tiêu • Lame sạch, khơ • Lame kéo máu (có bờ phẳng) • Kim chích máu, bơm kim tiêm vơ trùng • Bơng thấm nước vơ trùng, gạc • Cồn 700, • Bút ghi lame Chuẩn bị bệnh nhân:  Những bệnh nhân có biểu lâm sàng bệnh sốt rét hay người điều tra dịch tễ học sốt rét  Thời gian lấy máu tốt lúc bệnh nhân lên sốt, chưa dùng thuốc kháng sốt rét  Vị trí lấy máu thơng thường lấy máu ngoại vi mặt bên đầu ngón tay đeo nhẫn Ở trẻ em lấy dái tai đầu ngón chân  Khi kéo máu ngoại vi nhiều lần không phát ký sinh trùng lấy máu tĩnh mạch máu tủy xương TIẾN HÀNH: • Sát khuẩn vị trí chích máu, để khơ • Dùng kim chích máu vơ khuẩn chích nhanh gọn • Lấy giọt máu thứ 2, cho vào lame • Làm giọt máu đàn • Làm giọt máu đặc 42 Hình 7.1 Tiêu giọt đàn giọt đặc Kỹ thuật làm tiêu giọt đàn: Lấy lame thứ đặt mép lame tiếp tuyến với giọt máu thứ tạo thành góc 450 lúc giọt máu lan lame đẩy nhẹ lame phía trước tạo thành lưỡi máu dàn Kỹ thuật làm tiêu giọt đặc: Dùng góc lame kính thứ đặt vào trung tâm giọt máu thứ đánh từ trung tâm cho giọt máu có đường kính 1-1,5 cm giọt máu khơng có chỗ dày chỗ mỏng Hình 7.2 Vị trí lấy máu xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét Ý nghĩa lame giọt đàn giọt đặc Giọt đàn: Hồng cầu dàn lame kính, sau cố định nhuộm thấy rõ hình dạng kích thước hồng cầu dễ dàng cho định loại loài ký sinh trùng sốt rét Phục vụ cho điều trị, giảng dạy, nghiên cứu Hạn chế lượng ký sinh trùng ít, thời gian đọc lam máu Giọt đặc: Tập trung nhiều ký sinh trùng nên xác định nhanh, thuận tiện cho chẩn đoán điều trị dịch tễ học Tuy nhiên hình dạng ký sinh trùng khó định loại 43 Kỹ thuật nhuộm Giemsa 4.1 Dụng cụ hóa chất • Tiêu máu kéo • Giá đựng lame, pipet, bình định mức, cốc mỏ • Dung dịch Giemsa mẹ • Cồn • Nước cất 4.2 Kỹ thuật nhuộm Phương pháp nhuộm nhanh: pha giemsa 1/5 nhằm chẩn đoán lâm sàng, dịch tễ nhiên dễ phai màu Phương pháp nhuộm chậm: pha giemsa 1/20 ; bắt màu đẹp, bảo quản lâu, dùng cho giảng dạy nghiên cứu Các bước tiến hành: • Cố định giọt đàn cồn 900, 2-3 phút • Tẩy huyết sắc tố giọt đặc nước cất • Để khơ • Phủ dung dịch Giemsa (nhanh: phút; chậm: 30 phút) • Rửa nước • Để khơ, soi kính Tiêu chuẩn tiêu nhuộm tốt: o Tiêu sạch, không cặn o Thấy rõ tế bào máu: Hồng cầu bắt màu xanh tím o Thấy hạt sắc tố, hạt đặc hiệu (Maurer, Schuffneer) o Ký sinh trùng sốt rét: nhân đỏ thẫm, nguyên sinh chất màu xanh nhạt, hạt sắc tố màu nâu sẫm 44 BÀI 8: HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Mục tiêu:  Nhận dạng ký sinh trùng sốt rét giọt đàn giọt đặc  Phân biệt hình thể số loài ký sinh trùng sốt rét Đại cương :  Ký sinh trùng sốt rét thuộc giới đơn bào, lớp trùng bào tử, họ Plasmodidae, giống Plasmodium  Có lồi Plasmodium P.falciparum, P.vivax, P.malariae, P.ovale P.knowlesi có khả gây bệnh người Việt Nam có loại: P.falciparum (70 – 80%), P.vivax (20 – 22%), P.malariae (0 – 2%)  Ký sinh trùng sốt rét ký sinh hồng cầu Quan sát tế bào máu ký sinh trùng tiêu • Hồng cầu hình dĩa trịn bắt màu tím vơi Giemsa • Bạch cầu bắt màu đỏ • Nhân: màu đỏ thẫm • TB chất: màu xanh nhạt • Không bào: không bắt màu • Hạt sắc tố: nâu đen, nâu ánh vàng • Hạt đặc hiệu: đỏ nâu Hình thể Ký sinh trùng sốt rét 3.1 Hình thể Plasmodium falciparum 3.1.1 Thể tư dưỡng T (Trophozoite):  Tư dưỡng non: Có hình nhẫn, mảnh, nhỏ, nhân hình trịn bắt màu đỏ thẫm hay đỏ tía Ngun sinh chất bắt màu xanh lơ, kích thước khoảng 1/5-1/6 hồng cầu thường có 2-3 thể nhẫn hồng cầu  Tư dưỡng già: hình cà rá, nhân nguyên sinh chất lớn nhiều so với thể tư dưỡng non, nhân nguyên sinh chất có khoảng khơng bào Hồng cầu có hạt sắc tố Maurer to, thơ, kích thước khơng Hạt chuyển hóa Hb thành Haemozoine tạo nên 45 Hình 8.1 Thể tư dưỡng P.falciparum 3.1.2 Thể phân chia S (Schizonte)  Nhân lớn lên bắt đầu phân chia, đến giai đoạn cuối thường có 8-16 mảnh trùng  Khơng cịn khoảng không bào  Nguyên sinh chất phân chia, giai đoạn cuối mảnh nhân bao bọc mảnh nguyên sinh chất Khi hồng cầu vỡ giải phóng nhiều mảnh trùng  Có hai loại: Phân chia non nhân phân chia Phân chia già nguyên sinh chất phân chia  Thể phân chia thấy máu ngoại vi, bình thường tập trung tĩnh mạch sâu, tăng trưởng đủ độ có 8-12 mảnh trùng Hình 8.2 Thể phân chia P.falciparum 3.1.3 Thể giao bào G (Gametocyte) Hình mảnh trăng non, hình chuối, lưỡi liềm, khơng có khơng bào, có hạt sắc tố màu nâu đen Giao bào có nhân tập trung giữa, hạt sắc tố chung quanh nhân 46 Giao bào đực nhân có giới hạn khơng rõ rệt, hạt sắc tố nằm rải rác Hồng cầu chứa nhiều hạt Maurer Hình 8.3 Thể giao bào P.falciparum 3.2 Hình thể Plasmodium vivax 3.2.1 Thể tư dưỡng T  Hồng cầu bị ký sinh thay đổi hình dạng trương lớn, méo mó, có nhiều hạt Shuffner nhỏ mịn Hiếm thấy hầu cầu  Tư dưỡng non: có hình nhân thơ so với P.falciparum, nhân lớn, bắt màu đỏ tía, nguyên sinh chất vòng quanh nhân màu xanh lơ khoảng khơng bào kích thước khoảng 1/3-1/2 hồng cầu  Tư dưỡng già: gọi thể amips (trophozoite amibboide) có nhân lớn, ngun sinh chất nhiều mảnh tạo hình chân giả chứa nhiều hạt sắc tố màu nâu sẫm, cịn khoảng khơng bào Hình 8.4 Thể tư dương non P.vivax Hình 8.5 Thể tư dưỡng già P.vivax 3.2.2 Thể phân chia S  Nhân phân chia thành 16-24 mảnh 47  Nguyên sinh chất phân chia bao bọc quanh nhân  Ký sinh trùng không cịn khoảng khơng bào  Thể phân chia non có nhân phân chia  Thể phân chia già nguyên sinh chất phân chia bao bọc quanh nhân Hồng cầu trương lớn, méo mó, có nhiều hạt Shuffner Hình 8.6 Thể phân chia P.vivax 3.2.3 Thể Giao bào G  Giao bào hình trịn hay hình cầu chiếm 2/3 thể tích hồng cầu, khơng có khoảng khơng bào  Giao bào nhân lớn tập trung cực tế bào, nguyên sinh chất chiếm gần hết hồng cầu Có nhiều hạt sắc tố nâu đen  Giao bào đực có nhân lớn giữa, hạt sắc tố bao quanh nhân Hình 8.7 Thể giao bào P.vivax 48 Những khác hình thể loại Plasmodium ký sinh người: Thể P falciparum P.vivax P.malariae Tư dưỡng non Nhẫn nhỏ mảnh, thường rìa hồng cầu Nhẫn tương đối dày gọn Tư dưỡng già Thường tròn, tế bào chất dày Hình giống amip Giống hình khăn quàng vắt ngang hồng cầu Phân liệt -32 mảnh 14 – 24 mảnh trùng, trùng thấy máu ngoại vi – 12 mảnh trùng – 12 mảnh trùng Giao bào Hình lưỡi liềm hình chuối Hình trịn Hình trịn Hình trịn Sắc tố KST Sắc tố ít, nhỏ, màu, đen Sắc tố hình gậy, màu nâu Sắc tố hạt to, không màu đen Sắc tố màu nâu nâu đen, mịn Hồng cầu bị ký sinh Hình dáng, kích thước bình thường Có thể thấy hạt Maurer lớn thưa thớt, không Lớn bình thường hình dáng méo mó Có hạt sắc tố Schuffner lấm nhiều Bình thường, có co nhỏ Thường khơng thấy hạt sắc tố Lớn bình thường Hình bầu dục, đuôi nheo hạt Schuffner màu hồng, xuất sớm Nhẫn nhỏ mảnh thành băng ngang P.ovale Nhẫn dày gọn Các thành phần dễ nhầm lẫn với ký sinh trùng sốt rét  Tiểu cầu kết dính vào hồng cầu dễ nhầm với thể tư dưỡng  Đám tiểu cầu dễ nhầm với thể phân chia  Bạch cầu dễ nhầm với thể phân chia  Vệt thuốc nhuộm bám vào hồng cầu nhầm ký sinh trùng  Ngoài cịn có chất bầ, vi khuẩn, nấm men Do phân tích lam máu cần mơ tả đầy đủ thành phần ký sinh trùng sốt rét để khẳng định chắn 49 BÀI 9: HÌNH THỂ ĐỘNG VẬT CHÂN ĐỐT Mục tiêu:  Mô tả đặc điểm vai trò truyền bệnh động vật chân đốt học  Phân biệt số lồi thuộc lớp trùng lớp nhện I Đại cương lớp côn trùng (Insecta) Côn trùng lớp động vật có khí quản, thể chia làm phần : đầu, ngực, bụng, phân hoá cao tách biệt với rõ rệt, có đơi chân, phần lớn có cánh Cơn trùng phân bố rộng môi trường : không, đất, nước ký sinh động vật, thực vật Đây lớp động vật có số lồi nhiều nhất, triệu loài, chiếm 70% số loài động vật có trái đất Hình thể ngồi : 1.1 Đầu: đốt hợp thành Đốt đầu mang mắt ăng ten, đốt trung gian, đốt hàm trên, đốt hàm đốt môi Ở số lồi trùng có hàm dài sắc, có ống dẫn giúp cho việc hút thức ăn thể 1.2 Ngực: Gồm đốt, ngực trước, ngực giữa, ngực sau Mỗi đốt ngực có đơi chân, đốt ngực phần lớn trùng có đơi cánh đốt Mỗi chân gồm có đốt: đốt háng, đốt chuyển, đốt đùi, đốt cẳng, đốt bàn Cánh có hệ gân cánh đa dạng đặc trưng cho loài 1.3 Bụng: Gồm số đốt có cấu tạo gần giống nhau, đốt có màng mềm nên bụng quay chun giãn Số lượng đốt bụng biến đổi tuỳ theo loài từ -12 đốt, thường từ -10 đốt Các đốt bụng thường khơng có phần phụ, có lỗ thở mé bên Vỏ gồm lớp : lớp kitin bọc bên ngồi, lớp hạ bì lớp màng đáy Lớp kitin thấm chất sáp nên có tác dụng vừa ngăn thấm nước vào thể, vừa chống nước khỏi thể, cịn làm chức bảo vệ thể cảm giác II Phân loại : Tồn lớp trùng có gần triệu loài phân từ 30 – 40 bộ, có liên quan đến y học: 2.1 Bộ Anoplura (Chấy rận ): lồi trùng khơng có cánh thứ sinh, thân nhỏ, mắt tiêu giảm, phần phụ miệng kiểu chích hút.Phát triển có biến thái khơng hồn tồn, 50 sống ký sinh ngồi động vật có vú, hút máu truyền nhiều bệnh nguy hiểm cho người Họ chấy rận (Pediculidae) có giống chấy rận (Pediculus) liên quan đến y học Ví dụ : Chấy (P.Capitis) kí sinh người làm trung gian truyền bệnh sốt phát ban, chấy rận (P.rowazeki) gây bệnh sốt hồi qui chấy rận 2.2 Bộ Hemiptera: trùng có hai đơi cánh, góc cánh trước có nửa gốc dày, cứng, nửa mỏng, phần phụ miệng kiểu chích hút, có hai họ liên quan đến y học - Họ Cimicidae ( Rệp ): truyền bệnh dịch hạch, xoắn trùng Rệp biến thái khơng hồn toàn qua ba thời kỳ : trứng, ấu trùng trưởng thành - Họ Tritomidae (Bọ xít hút máu): truyền bệnh trùng roi xoắn trùng đường máu, bệnh Chagas 2.3 Bộ Aphaniptera : lồi khơng cánh thứ sinh , thể nhỏ , giẹp, phần phụ miệng kiểu chích hút, chân sau kiểu chân nhảy , phát triển có biến thái hồn tồn Bọ chét hút máu, sống ký sinh thể động vật có vú 2.4 Bộ Diptera : Gồm trùng có hai cánh rõ cánh thối hố, trùng hai cánh có biến thái hồn tồn, ấu trùng khơng có chân khơng cánh Cơn trùng hai cánh chia làm hai nhóm côn trùng truyền bệnh quan trọng giới Việt Nam Nhóm Brachycera ( ăngten có ba đốt) : ruồi có liên quan đến y học : - Tabanidae (ruồi trâu) hút máu động vật người Trứng cỏ đất, giai đoạn nhộng đất VD : Chrysops cascuticus đốt người truyền bệnh giun từ động vật sang người - Muscidae : có hai loại: Musca domestica Musca vicina.Ruồi vận chuyển nhiều loại mầm bệnh thể, kể mầm bệnh ký sinh trùng, vi khuẩn, vi rút, bệnh giun sán, đơn bào, mắt hột, bai liệt thương hàn …Nói chung, nơi ruồi đậu có mầm bệnh có vận chuyển để bệnh lan tràn Nhóm Nematocera (ăngten ba đốt) : Gồm họ có liên quan đến y học như: - Simulidae (ruồi vàng) thể giống muỗi, có khả vừa gây bệnh vừa truyền bệnh, khả gây bệnh yếu Khi hút máu Simulidae có tiết chất độc, nhiều nghiêm trọng làm chết người động vật Simulidae 51 đốt người làm chảy máu, thể bị phù nề viêm loét, trường hợp bị nhiễm độc nặng có biểu lạnh chân tay, hạ nhiệt, đái gắt, truỵ tim mạch, thương tổn Simulidae đốt lâu khỏi - Chrynomonidae: Gần giống muỗi nhỏ VD : Dĩn ( Culicoides furens ) truyền giun Filaria ozzadi Muỗi Culicidae chia họ phụ : họ phụ Culicinae họ phụ Anophelinae Đặc điểm họ phụ Culicinae :  Pan ngắn vịi  Cánh khơng có đốm đen  Tấm lưng sau có thuỳ  Khi đậu thân song song với giá thể  Bọ gậy nằm chếch góc so với mặt nước, có ống xi phơng dài Đặc điểm họ phụ Anophelinae - Pan dài vòi - Cánh có đốm đen - Tấm lưng sau có thuỳ - Muỗi đậu chếch góc 45 so với giá thể - Bọ gậy nằm song song với mặt nước, khơng có ống xi phơng Kỹ thuật mổ muỗi Mục đích:  Tìm KSTSR ( Oocyste, sporozoite ) tuyến nước bọt dày muỗi, từ xác định trung gian truyền bệnh sốt rét  Xác định tuổi sinh lý, tuổi nguy hiểm muỗi Dụng cụ - Kính lúp mắt, kính hiển vi - Kim mổ muỗi - Cồn 70, thấm nước - Nước cất, nước muối sinh lý 0,9% - Ether Chloroform 52 - Lam lamen Các bước tiến hành 3.1 Mổ muỗi, soi tươi : Gây mê muỗi ether hay chloroform, dùng kính lúp định loại muỗi, xác định sella muỗi Dùng kéo cắt chân, cánh, đầu muỗi… sử dụng phần làm tiêu muỗi phần Cho lên lam kính giọt nước muối sinh lý, giọt cách 1,5 cm Đưa lam kính vào kính lúp mắt, muỗi đặt vào giọt nước giữa, đầu muỗi hướng phía bên phải, bụng muỗi hướng phía người mổ 3.1.1 Mổ tuyến nước bọt : Tay trái người mổ muỗi cầm kim đè nhẹ lên ngực muỗi chỗ đôi chân thứ 2, tay phải cầm kim đặt nhẹ vào cổ muỗi kéo nhẹ, tuyến nước bọt theo đầu muỗi lôi Dùng kim cắt tuyến nước bọt khỏi đầu đưa sang giọt nước bên tay phải Có thể mổ lấy tuyến nước bọt cách dùng kim tay phải cắt rời đầu muỗi, sau dùng kim tay trái đè nhẹ lên ngực muỗi vị trí đốt 1và 2, tuyến nước bọt vọt Hình 9.1 Tuyến nước bọt muỗi 3.1.2 Mổ dày buồng trứng : Dùng kim xé rách kitin đốt cuối (đốt 8) Đặt kim phải lên ngực muỗi, kim trái lên đốt cuối kéo dần kim sang phía trái dày buồng trứng lôi khỏi bụng muỗi Vớt xác muỗi khỏi lam kính.Tách buồng trứng sang giọt nước bên trái, dày giữ nguyên giọt nước 53 3.1.3 Tìm thoa trùng tuyến nước bọt : Đặt lamen lên giọt nước có tuyến nước bọt, sử dụng thị kính 7x hay 10x, vật kính 8x để tìm tuyến nước bọt, sau chuyển sang vật kính 40x tìm thoa trùng Khi đặt lamen lên tuyến nước bọt dùng đầu kim ấn nhẹ lên lamen để tuyến nước bọt vỡ Đầu tiên quan sát ống dẫn nước bọt, tế bào tiết Thông thường thuỳ có nhiều thoa trùng hai thuỳ bên Thoa trùng có hình thoi, dài 12 –14 m, hai đầu nhọn tù hay đầu nhọn, đầu tù Có thể thấy thoa trùng rải rác hay nhiều Thoa trùng thường chuyển động tiến lên phía trước theo trục thân, cong lại nhiều lần, đầu gần chạm Có sóng nhu động chạy suốt thân thoa trùng, từ từ liên tục Hình 9.2 Hình thể thoa trùng muỗi 3.1.4.Tìm oocyste dày muỗi : Đặt giọt nước có dày muỗi lamen Sử dụng độ phóng đại 8x, 40x để tìm oocyst Oocyste tuổi 1, nhỏ, đường kính -7 m, có sắc tố nhìn thấy Có thể sử dụng kim mổ xê dịch lamen cho dày lăn lam để nhìn oocyste rõ Oocyste phát triển từ tuổi - thường dễ nhận thấy : oocyste có đường kính 10 - 40 m, thấy rõ thành oocyste nhân, thấy thoa trùng dạng sporozoblast, giai đoạn thường khơng có sắc tố Oocyste sang tuổi khơng nhìn thấy sporozoblast, nhìn thấy thoa trùng xếp thành bó, oocyste vỡ giải phóng thoa trùng tự do, có cử động 3.1.5 Xác định tuổi muỗi độ chín trứng: Dùng kim tay trái để giữ buồng trứng, kim tay phải xé dần bao buồng trứng, lấy kim tách rời số trứng kéo thẳng dây trứng Đếm số bìu, có bìu nhiêu tuổi sinh lý Chú ý : dùng kim tách dây trứng phải 54 làm thật nhẹ nhàng để dây trứng khơng bị đứt Trường hợp có trứng Christopher 4-5 đếm số bìu trứng non có dây trứng dài Soi trứng để định Christopher Hình 9.3 Các giai đoạn phát triển trứng Phân loại muỗi truyền bệnh sốt xuất huyết, ZiKa  Aedes aegypti: o Có khả chịu đựng cao với hóa chất diệt trùng Hiện kháng với hóa chất thuộc nhóm Perithroid tổng hợp  Aedes albopictus o Phổ biến vùng nơng thơn truyền bệnh giống Ae.aegypti Phân loại bọ gậy: Quan sát kính hiển vi, số đặc điểm khác biệt lồi từ định danh xác sau ghi kết định loại Hình 9.4 Bọ gậy Ae aegypti Hình 9.5 Bọ gậy Ae albopictus 55 Hình 9.6 Đặc điểm phân loại bọ gậy Aedes Phân loại muỗi Aedes Hình 9.7 Muỗi Ae aegypti Hình 9.8 Muỗi Ae albopictus 56 ... Schuffneer) o Ký sinh trùng sốt rét: nhân đỏ thẫm, nguyên sinh chất màu xanh nhạt, hạt sắc tố màu nâu sẫm 44 BÀI 8: HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Mục tiêu:  Nhận dạng ký sinh trùng sốt rét... chế lượng ký sinh trùng ít, thời gian đọc lam máu Giọt đặc: Tập trung nhiều ký sinh trùng nên xác định nhanh, thuận tiện cho chẩn đoán điều trị dịch tễ học Tuy nhiên hình dạng ký sinh trùng khó... Ancylostoma bao gồm loài Ancylostoma duodenale ký sinh người, A caninum ký sinh chó Giống Necator ký sinh người lồi Necator americanus Ở Việt Nam có hai lồi ký sinh Ancylostoma duodenale (giun móc) Necator