V. Cấy truyền phôi cho dê cừu Tóm tắt
3. Tạo phôi trong ống nghiêm
Mới chỉ một thập kỷ trôi qua kể từ khi sinh ra những con cừu và những con dê sau khi thụ tinh ống nghiệm (IVF). Các kỹ thuật nuôi chín ống nghiệm (IVM) các tế bào trứng, sự
thụ thai của chúng bằng tinh trùng đã được hoạt hoá trong ống nghiệm và nuôi cấy trong
ống nghiệm (IVC) những phôi được tạo ra đã thành công cả ở cừu và dê. Mặc dầu các kỹ thuật sử dụng cho tạo phôi trong ống nghiệm ở gia súc nhỏ nhai lại dao động giữa các phòng thí nghiệm, những phần quan trọng nhất của kỹ thuật được coi là hoạt hoá tinh trùng và nhiệt độ và pH của môi truờng nuôi cấy được thực hiện. Hepảin rất quan trọng trong hoạt hoá tinh trùng bò trong ống nghiệm, đã được sử dụng thành công ở dê và cừu. Tuy nhiên, chất lượng phôi tạo ra trong sự có mặt của heparin vẫn là một câu hỏi, vì chỉ có 25% (5/20)phôi nang đã cấy sinh ra dê con sống so với 61% (11/18; P<0.05) của nhóm đối chứng, mà ở đó tinh trùng được hoạt hoá bằng huyết thanh đã
được sử lý nhiệt. Những khác biệt giữa con đực và nguy cơ đa tinh trùng giữa các thí nghiệm (10-20%) đã được chứng minh. Tuy nhiên, sau khi loại bỏ những tế bào trứng có nhiều tinh trùng, trung bình 60-70% các tế bào trứng cừu và dê thụ thai bình thường có thể đạt được trong ống nghiệm. Gần đây, có thể đạt được tỷ lệ phân chia trong ống nghiệm tương đương với tỷ lệ phân chia trong cơ thể, mà không có mặt các tế bào soma trong hệ thống môi trường nuôi cấy không có huyết thanh. Các nghiêm cứu trước đây đã chỉ ra rằng rào cản sự phát triển ở giai đoạn 8-16 tế bào có thể vượt qua bằng việc cùng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng. Tỷ lệ có chửa cao đã đạt được sau khi cấy (2 phôi nang trên con nhận) phôi có nguồn gốc nuôi cấy trong môi trường ống dẫn trứng tổng hợp (SOF) có BSA và axit amin hay SOF có bổ xung FCS (bảng 3)
Bảng 17. Ảnh hưởng của bổ xung môi trường SOF với 10% huyết thanh thai bê (FCS) 2 ngày sau thụ tinh (dpi) lên tỷ lệ phát triển và khả năng sống sau khi cấy phôi cừu tạo ra trong ống nghiệm. Môi trường nuôi cấy* % trứng phân chia 2dpi % phôi dâu 8dpi % phôi nang 8dpi Số phôi nang được cấy Có chửa lúc 50 ngày Có chửa lúc sinh %bê sinh ra trên phôi nang cấy SOF SOF+FC S 83 81 16 9 29 27 16 15 6/8 8/8 5/8 8/8 44(7/16) 80(11/15) *Số tế bào trứng IVM/IVF/IVC ở mỗi nhóm =230
Người ta đã báo cáo rằng cấy phôi cừu tạo ra trong SOF bổ xung 20% huyết thanh người làm cho thời gian có chửa dài hơn và trọng lượng so sinh cao hơn so với mong
đợi bình thường. Những khuyết tật này rõ ràng không quan sát thấy sau khi nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh.
Với những tiến bộ gần đây về phương pháp những trứng rụng được thụ tinh và nuôi cấy trong ống nghiệm tạo ra 60-70% phôi nang, tỷ lệ đó gần với tỷ lệ phát triển quan sát
được trong cơ thể. Khi sử dụng các tế bào nuôi chín trong ống nghiệm tỷ lệ phát triển giảm xuống xấp xỉ một nửa. Nguyên nhân chính vẫn là việc lựa chọn những tế bào trứng có khả năng chín trong ống nghiệm, thụ tinh và phát triển tiếp theo. Kích thươcs của nang trứng mà ỏ đó có tế bào trứng cần phải được quan tâm khi thu tế bào trứng cho IVM.Đạt được khả năng phân bào và khả năng phát triển tiếp theo bởi tế bào trứngxuất hiện trong giai đoạn sinh trưởng của nang trứng. Tế bào trứng từ nang trứng nhỏ và trung bình cho tỷ lệ phôi nang thấp hơn so với phôi nang từ những nang trứng lớn. ở
cừu có gen gây chết Booroola, sự phát triển của các tế bào trứng từ một kích thước nang trứng đã cho tốt hơn so với quan sát được đối với các tế bào trứng thu được từ
kích thước tượng tựở con cái có kiểu gen hoang dại. Điều này cho thấy một gen có thể điều khiển động thái của sự chín nguyên sinh chất của tế bào trứng bên trong nang trứng phát triển. Trong cơ thể, khả năng của tế bào trứng có thểđược kiểm soát bởi môi trường nang trứng như đã được dẫm chứng bằng những thí nghiệm của Moor và cs (1993) cho thấy 6 giờđầu tiên xảy ra bên trong nang trứng cừu được kích thích bằng LH là quan trọng đối với khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng. Khả năng phát triển của tế bào trứng ước lượng sau IVF/IVC cũng có liên quan với tần suất nhịp LH ở cuối pha nang trứng của chu kỳ động dục ở cừu. Bản chất chính xác của các yếu tố nang trứng điều khiển sự đạt được của tiềm năng phát triển bằng tế bào trứng chín vẫn chưa
được biết mặc dầu một số yếu tố sinh trưởng, hocmôn và các peptides trong buồng trứng được coi là các ứng cử viên.
Phương pháp đầu tiên đề cử cho sự nuôi chín tế bào trứng bên ngoài nang trứng là cùng nuôi cấy 24 giờ hỗn hợp cumulus- tế bào trứng (COC) với các tế bào hạt trong môi trường có bổ xung FSH, LH, estradiol và huyết thanh thai bê trong những điều kiện không ổn định. Hệ thống này đã được mở rộng đến các tế bào trứng của dê. Tuy nhiên,
đơn giản hoá môi trường nuôi chín các tế bào trứng cừu và dê là có thể, bổ xung dịch nang trứng cừu và dê (10%) và FSH (100ng/ml) vào M199. Sự thành công của quá trình nuôi chín (24 giờở cừu, 27 giờở dê) có thể bịảnh hưởng bởi sự lựa chọn tế bào trứng và nhiệt độ tối ưu (38,5 -390) thu tế bào trứng từ buồng trứng ở lò mổ bằng cách hút hay cắt cho 1,5-2 COC có thể dùng được trên mỗi buồng trứng cừu hay dê. Cắt nhỏ buồng trứng là một phương pháp hiệu quả hơn đối với thu một số lượng lớn COC (6COC/ buồng trứng), nhưng các tế bào trứng thu được thêm từ những nang trứng nhỏ ít có khả
năng phát triển sau IVF. Trung bình 9COC trên mỗi trứng được cắt (bao gồm 4COC từ
những nang trứng lớn hơn 5mm) có thể đạt được với dê được sử lý trước bằng FSH. Khi thu tế bào trứng lặp lại được thực hiện bằng phương pháp ovum pick-up bằng hút nội soi sau khi sử lý trước bằng FSH, 3 hay 4 COC đạt được trên mỗi buồng trứng ở
cừu và dê tương ứng tới. Báo cáo của Ruacura về thu phôi thu phẫu thuật các tế bào trứng cừu cho thấy đến 57% các tế bào trứng có thể phát triển thành phôi nang, sinh ra 1,5 cừu con trên mỗi cừu cái được hút. Cũng như ở bò, thu các tế bào trứng lặp lại từ
cừu sống và dê sống có thể là quan trọng trong sự phát triển của các chương trình cải tiến giống có hiệu quả. Bây giờ có khả năng nuoi chín và thụ tinh các tế bào trứng trước tuổi trưởng thành ở cừu và dê, cho phép giảm khoảng cách thế hệ.